Investigando regeneração funcional em organot�icas Medula Espinhal Co-culturas cultivadas em Arrays Multi-eletrodo

Resumo

Aqui apresenta-se um protocolo que é baseado em fatias de medula espinhal cultivadas em matrizes multi-eléctrodos para estudar a regeneração funcional de ligações propriospinal in vitro.

Resumo

Os vertebrados superiores adultos têm um potencial limitado de recuperação de lesões na medula espinhal. Recentemente, surgiram evidências de que as conexões proprioespinhais são um alvo promissor para intervenção para melhorar a regeneração funcional. Até o momento, não existe nenhum modelo in vitro que conceda a possibilidade de examinar a recuperação funcional das fibras proprioespinhais. Portanto, foi desenvolvido um modelo representativo baseado em duas seções organotípicas da medula espinhal de ratos embrionários, cultivadas uma ao lado da outra em matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs). Essas fatias crescem e, em poucos dias in vitro, se fundem ao longo dos lados voltados um para o outro. O desenho dos MEAs utilizados permite a realização de lesões com lâmina de bisturi através deste local de fusão sem infligir danos aos MEAs. As fatias mostram atividade espontânea, geralmente organizada em rajadas de atividade de rede, e parâmetros de atividade espacial e temporal, como a localização das origens das rajadas, velocidade e direção de sua propagação e latências entre as rajadas podem ser caracterizados. Usando esses recursos, também é possível avaliar a conexão funcional das fatias calculando a quantidade de rajadas sincronizadas entre os dois lados. Além disso, os cortes podem ser analisados morfologicamente por meio da realização de colorações imuno-histoquímicas após os registros.

Várias vantagens das técnicas utilizadas são combinadas neste modelo: as fatias preservam em grande parte a arquitetura original do tecido com circuitos sinápticos locais intactos, o tecido é fácil e repetidamente acessível e a atividade neuronal pode ser detectada simultaneamente e de forma não invasiva em um grande número de pontos em alta resolução temporal. Essas características permitem a investigação da regeneração funcional das conexões intraespinhais isoladamente in vitro de forma sofisticada e eficiente.

Introdução

Culturas organotípicas de fatias do sistema nervoso central (SNC) tem sido amplamente utilizado para estudar vários fenómenos fisiológicos e patológicos que vão desde o desenvolvimento neuronal a neurodegeneração. Em comparação com culturas de células dissociadas, fatias organotípicas oferecem a vantagem de uma maior complexidade com um citoarquitetura intacta e circuitos sináptica local. Ao mesmo tempo, o tecido pode ser analisada de uma maneira isolada, sem a necessidade de comprometer a complexidade do conjunto no contexto in vivo. Além disso, o acesso fácil e repetido para as células de escolha é justificada, o ambiente extracelular pode ser controlada com precisão e, geralmente, em modelos in vitro são menos onerosos do que os seus homólogos in vivo. Nos últimos anos, vários estudos apresentados semelhanças notáveis ​​entre os perfis de desenvolvimento de culturas de longo prazo contra os animais que vivem correspondente ^1,2. Demonstrou-se que os circuitos neuronais do CNS vários Regions expressar atividade de rede espontânea durante o desenvolvimento e que fatias organotípicas manter parcialmente este fenómeno ^{3 -7.} Isolado preparações da medula espinal têm sido especialmente usados ​​para investigar geração ritmo ⁶ e a formação de circuitos neuronais ^1.

Uma maneira de gravar a atividade espontânea de fatias organotípicas é a cultura deles em cima de arrays multi-eletrodo (AMA). Estes dispositivos contêm múltiplos eletrodos que podem monitorar os potenciais extracelulares geradas por potenciais de ação de numerosas células simultaneamente (gravação multi-unidade). A alta resolução temporal das gravações MEA pode ser usado para reconstruir a dinâmica atividade precisa dentro de um dado circuito neuronal. Além disso, em contraste com o remendo de fixação da técnica é não-invasiva, que permite medições de longo prazo e que resulta no fato de que os neurónios não são afectados no seu comportamento.

Fou o propósito deste estudo, a combinação de organotípicas espinal medula co-culturas e gravações multisite foi utilizado para investigar a regeneração funcional no interior da medula espinal. Desde adultos vertebrados superiores têm potencial para recuperar de danos da espinal medula limitado, diferentes estratégias têm sido estudados para promover a regeneração após a lesão da medula espinal. Até agora, o trato corticoespinhal geralmente tem sido o sistema de modelo de escolha para tais investigações. Estas experiências são geralmente demorado, caro e exige grandes grupos de animais, devido à alta variabilidade dentro dos grupos individuais. Além disso, as evidências sugerem que as conexões propriospinal (neurônios que são totalmente confinados dentro da medula espinhal) pode desempenhar um papel fundamental no processo de recuperação após lesões da medula espinhal ^8. Estas fibras são difíceis de estudar in vivo sem a interferência de ascendentes e descendentes tratos de fibras. Bonnici Kapfhammer e ⁹ utilizada medula espinhal longitudinalculturas fatia de ratos pós-natais como uma abordagem alternativa. Após a realização de lesões mecânicas eles analisaram semi-quantitativamente a regeneração morfológica de axônios entre segmentos da medula espinhal. Eles observaram menos, mas não nenhum axônios que cruzam o local da lesão em culturas cortadas em uma idade madura. Em contraste, as culturas que foram lesionados numa fase mais jovem exibido uma elevada quantidade de regeneração axonal 5 - 7 dias após o dano. No entanto, a prova para conexões funcionais não foi apresentada.

Por conseguinte, o desenvolvimento de um modelo in vitro representativo de fibras propriospinal que permite a investigação de regeneração funcional pode ser uma ferramenta valiosa para estender o nosso conhecimento sobre os processos de regeneração da medula espinhal.

Protocolo

Cuidados com os animais foi de acordo com as directrizes aprovadas pelas autoridades locais suíços (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Berna, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, Nrs aprovação. 52/11 e 35/14). Essas diretrizes estão de acordo com a directiva comunitária 2010/63 / UE.

Nota: Trabalho em uma capela de fluxo laminar com instrumentos e soluções estéreis para todas as etapas 1 - 5, incluindo sub-etapas.

1. Preparação de acordos ambientais multilaterais

Nota: AAM são compostas de um substrato de vidro, eletrodos pré-fabricadas das micro do metal e uma camada de isolamento de polímeros SU-8 (ver também Tscherter et ^{al. 3).} Para o propósito deste estudo, AAM disponíveis comercialmente foram encomendados com um esquema de conjunto de eléctrodos personalizado (Figura 1 A e B). Os eléctrodos 68 estão dispostas numa grelha rectangular que é dividida em duas zonas por uma ranhura 300 um de largura livre de eléctrodos, electrleads iCal e isolamento. Cada um dos eléctrodos é de 40 x 40 um em tamanho e estão espaçados por 200 um de centro a centro. Quatro grandes eléctrodos de terra estão posicionados em torno do local de gravação. Eles diferem de outros acordos ambientais multilaterais padrão disponíveis comercialmente em seu tamanho (21 milímetros x 21 mm) e eles não têm câmara de gravação fixo.

1. Para a desinfecção de enxaguamento AAM em 100% de etanol (2x), etanol a 70% (1x) e água destilada (2x) durante pelo menos 30 seg cada. Deixe secar. Colocar 10 - 12 AAM numa placa de Petri de vidro limpo (150 mm x 25 mm) e feche a tampa.
2. AAM autoclave durante 20 min a 120 ° C. Armazenar à temperatura ambiente.
3. Preparar a solução de revestimento (ver lista de materiais) para os acordos ambientais multilaterais e armazenar alíquotas a -20 ° C.
4. Colocar cada MEA numa placa de Petri estéril indivíduo (35 mm x 10 mm).
5. Usar uma pipeta para colocar arrefecida 150 ul de solução de revestimento refrigerada no topo dos eléctrodos e fechar a tampa do prato de petri. Após cerca de 10 min, verificar se há bolhas de ar no topo doos eletrodos e removê-los delicadamente com uma espátula de borracha coberta, se necessário. Deixe repouso durante 1 h à TA.
6. Aspirar resíduos de solução de revestimento, lavagem 1x com meio otimizado para pré-natal e neurônios embrionários e 2x com água destilada e estéril. Se AMA não são usadas até o dia seguinte, mantê-los em água destilada, água estéril a 37 ° C na incubadora de O / N. Caso contrário, deixa directamente seco à TA.

2. Os ingredientes necessários para a preparação e Crescimento de culturas organotípicas

1. Preparar a solução de lavagem sem cálcio (ver lista de materiais).
2. Reconstituir plasma frango em solução de lavagem (1: 1, agite, evitar a formação de bolhas), centrifugar a 3000 xg durante cerca de 20 minutos e decantar o conteúdo claro em um tubo estéril. Alíquota de 200 ul em criotubos e armazenar a -20 ° C.
3. Reconstituir trombina a partir de plasma bovina em conformidade (200 U / mL) e esterilizado por filtração (filtro de 0,2 um de poro). Alíquota de 200 ul em crytotubes e armazenar a -20 ° C.
4. Por 30 culturas preparar 100 ml de meio nutriente (ver lista de materiais).

3. Spinal Cord Tissue Dissection

Nota: o rendimento Processo, de acordo com o número de embriões, fatias de medula espinal durante cerca de 25 - 35 co-cultura, é preparado dentro de uma câmara de fluxo laminar em condições estéreis.

1. Aplicar uma dose letal de pentobarbital (0.4 ml) a mãe do animal por injecção intramuscular. Confirme anestesia profunda, verificando o reflexo de retirada do pedal. Entregar embriões de ratos E14 por cesariana e sacrifício por decapitação.
2. Transferir os corpos dos embriões numa placa de petri cheia com, refrigerada, a solução de lavagem estéril.
3. Realizar um corte transversal completo com um bisturi acima dos membros posteriores e outro acima dos membros anteriores e remover os membros do corpo. Em seguida, faça um corte no plano frontal para separar as vísceras da peça de volta contendo o co espinhalrd.
4. Para cortar, transferir as peças de volta contendo a medula espinal um de cada vez sobre um disco de montagem e cortada a uma espessura de 225 - 250 fim com um cortador de tecido. Colocar uma gota da solução de lavagem sobre o tecido picado e transferir as fatias com uma espátula em 35 mm x 10 mm com placas de petri cheias, refrigerada, a solução de lavagem estéril.
5. Para cada fatia separadamente, dissecar medula espinhal longe do restante tecido. Deixe gânglio da raiz dorsal anexado.
6. Deixe as fatias descansar durante 1 hora a 4 ° C.

4. Montagem da Coluna Vertebral fatias de tecido Cord sobre acordos ambientais multilaterais

1. Aqueça meio nutriente estéril na incubadora (37 ° C, levemente tampa para a oxigenação desatarraxou).
2. Posição MEA com pinças estéreis com dicas cobertas de borracha em temperatura ambiente na placa de Petri sob um microscópio estéreo com o conjunto de eletrodos em foco. Centralize uma gota 6 mL de plasma de frango no conjunto de eletrodos limpo, livre de poeira, e estéril. Usando uma pequena espátula, cuidadosamente deslizeduas secções da espinal medula com lados ventral frente para o outro dentro da gota de plasma. Não toque os eletrodos com a espátula.
3. Adicionar 8 mL de trombina em torno da gotícula de plasma de galinha. Usando a ponta trombina pipeta, cuidadosamente misturar e espalhar a mistura de frango plasma / trombina em torno das duas fatias. Mais uma vez, não toque no conjunto de eletrodos diretamente frágil. Pouco antes de coagulação, aspirar o excesso de frango plasma / trombina.
4. Tapar o prato de petri para reter humidade elevada, enquanto o conjunto do MEA / cultura senta-se durante cerca de 1 h numa câmara humidif içada no interior da incubadora a 37 ° C.
5. Adicionar cuidadosamente 10 ml de meio nutriente para a câmara de cultura, tampar a placa de Petri e colocar de volta na incubadora por cerca de 30 min.
6. Coloque cada conjunto MEA / cultura com, dicas cobertas de borracha estéreis em um tubo de rolo, adicionar 3 ml de meio nutritivo e bem perto da tampa. Colocar o tubo de enrolamento no tambor de rolos que roda a 1 - 2 rpm na incubadora em 5% de CO _{2 -containing atmosfera a 37 ° C.}
7. Mudar metade do meio nutriente depois de 7 dias in vitro (DIV) e, depois, 1 - 2 vezes por semana.

5. As lesões mecânicas

1. Leve o conjunto MEA / cultura com, dicas cobertas de borracha estéreis para fora do tubo de rolo e coloque em um prato de petri sem meio nutriente sob um microscópio estéreo com o tecido em foco. Visualmente verificar que as duas fatias são fundidos.
2. Segure o MEA / cultura montagem estável, colocando uma pinça com pontas cobertas de borracha na MEA.
3. Coloque uma lâmina de bisturi na ranhura do MEA perto das fatias de tecido. Segurar o bisturi em vez horizontalmente.
4. Levante o bisturi lidar com até mas deixe a lâmina de bisturi ficar na ranhura da MEA, de tal forma que a lâmina "rola" da base à ponta e reduz, assim, através do tecido que cobre a ranhura.
5. Graves quaisquer ligações de tecido residual com uma agulha de 25 G ponta se necessary. Trabalhar somente na área dentro do sulco e não toque nas bordas do concurso.
6. Coloque o conjunto da MEA / cultura de volta para dentro do tubo de rolo. Fornecer 3 mL de meio nutriente fresco para as culturas e colocá-los de volta para dentro do tambor de rolos na incubadora.

6. As gravações eletrofisiológicas da atividade espontânea

1. Para investigar a regeneração funcional entre as duas fatias de medula espinhal após o número escolhido de DIV, monte o conjunto MEA / cultura em uma câmara de gravação em um microscópio e aplicar cerca de 500 solução extracelular ul (ver lista de materiais).
2. Esperar 10 min antes da primeira gravação para permitir que o sistema se estabilize.
3. Grave 2x atividade espontânea básicos para cerca de 10 min de cada eletrodo do MEA a RT-detectar atividade.
4. Para garantir condições estáveis ​​extracelulares, trocar solução extracelular após cada sessão de gravação.
5. Para desinibir a rede, aplique a solução de co extracelularntaining estricnina (1 uM) e gabazine (10 uM). Aguarde pelo menos 2 minutos antes de iniciar a gravação.

Análise 7. Dados

Nota: Para a detecção dos potenciais de acção extracelularmente gravados para cada eléctrodo usar um detector baseado no desvio padrão e um discriminador subsequente. Este procedimento é descrito em detalhe em Tscherter et al. ^3.

1. Mostrar a actividade neuronal detectada de cada eléctrodo num lote raster de acordo com procedimentos padrão ³ (Figura 1F).
2. Determinar e exibir a actividade da rede total para cada fatia através da soma do número de eventos nos canais de acordo dentro de uma janela deslizante de 10 mseg, deslocada em passos mseg (Figura 1G 1 e ver Tscherter et al. ^3).
3. Detectar em cada fatia rajadas individuais (clusters de actividade que aparecem em vários eletrodos). Portanto, Definir um limite mínimo de atividade pico na atividade de rede total correspondente e definir cada início e fim estourar estourar. Por exemplo, um limite adequado é de 25% da amplitude média de ruptura e um início de ruptura pode ser definido por ser o primeiro evento numa janela de tempo de pelo menos 5 mseg, uma extremidade de explosão, sendo o último caso de uma janela de tempo de pelo menos 25 ms (ver Heidemann et al. ^10).
4. Para quantificar a regeneração funcional calcular a porcentagem de explosões sincronizadas entre as duas fatias. Para fazer isto, calcule a latência entre uma explosão numa fatia e a seguinte explosão na outra fatia.
   Nota: Um par de ruptura é denominado "sincronizado", quando a latência é menor do que o comprimento de ruptura médio. Especialmente em co-culturas com uma grande quantidade de actividade, existe a possibilidade de ambos os lados coincidentemente iniciar uma explosão na janela latência escolhido. Este facto deve ser tido em conta na quantificação da percentagem de SYrajadas nchronized. Para uma descrição pormenorizada dos cálculos ver Heidemann et ai. ^10.

8. Fixação das Culturas e imunohistoquímica

1. Para todas as etapas que incluem a lavagem ou incubação certifique-se de colocar as culturas em uma mesa basculante para garantir a difusão adequada da solução através do tecido.
2. Imediatamente após a sessão de gravação for concluído tomar a montagem MEA / cultura para fora da instalação, colocá-lo em uma placa de Petri (35 mm x 10 mm) e adicionar cerca de 2 ml de solução extracelular.
3. Para separar as fatias a partir de células que rodeiam as camadas que se formaram durante o tempo in vitro, ter uma ponta de pipeta 10 ul e circundar as fatias. Preste atenção para não danificar as culturas. É possível omitir este passo, mas incorporando mais tarde é mais fácil quando esta é realizada.
4. Use uma agulha de seringa não metálica fina (ver lista de materiais), em combinação com uma seringa de 1 ml preenchido com soluti extracelularsobre a soprar delicadamente a cultura fora do MEA.
5. Remover a ponta de uma pipeta de Pasteur e encaixar o bolbo de borracha na extremidade lascas. Utilizar a extremidade traseira para transferir a cultura em fixador (paraformaldeído a 4% com solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,1 M)). Não use o padrão ponta da pipeta Pasteur para a transferência, porque é muito pequeno e as culturas seriam dobradas e provavelmente danificado. Fix durante 1 - 2 h a 4 ° C. Lavar o MEA com água destilada e remover os resíduos de tecido com os dedos, mas não arranhar com a unha. Loja AAM em água destilada a 4 ° C.
6. Lavam-se as culturas 3x em PBS durante pelo menos 10 min cada. Armazenar em PBS a 4 ° C ou começar directamente com o processo de coloração.
7. Incubam-se as culturas durante pelo menos 90 minutos em solução de (5% de soro de cabra, 1% de albumina de soro bovino, 0,3% de detergente em PBS) de bloqueio.
8. Adicione o primeiro anticorpo diluído em solução de bloqueio e incubar durante 3 noites a 4 ° C.
9. Lavar 3x em PBS durante pelo lleste 30 min cada.
10. Adicionar o segundo anticorpo diluído em PBS durante 2 horas à temperatura ambiente.
11. Lavar 3x em PBS durante pelo menos 30 minutos cada.
12. Transfira as fatias com uma pipeta Pasteur com ponta removido em um objeto slide. Retire o excesso de PBS e incorporar com meio de montagem.

Resultados

Para investigar o potencial para a recuperação funcional dos co-culturas derivadas da espinal medula de embriões de rato E14, lesões foram realizados em uma janela de tempo de 8-28 DIV. 2 a 3 semanas mais tarde, a atividade neuronal espontânea foi gravado com os acordos ambientais multilaterais (Figura 1 C & D). Os potenciais de ação extracelular registrados foram identificados off-line para cada eletrodo indivíduo (Figura 1E). A partir destes dados foram gerados lotes de varredura (Figura 1F), seguido por parcelas de actividade de rede para visualizar a actividade total separadamente de cada lado (Figura 1G). Em cada fatia da atividade espontânea é normalmente organizado em rajadas. Se as fatias estão funcionalmente ligados, estes rajadas pode propagar de uma fatia para o outro. Portanto, a quantidade de rajadas sincronizados entre as duas fatias foi calculada para medir quantitativamente a regeneração funcional. Para uma descrição detalhada de como a transformação into as diferentes parcelas é realizado e como a fórmula para calcular a porcentagem de atividade sincronizada foi derivado, consulte Heidemann et al. ^10.

Em todas as experiências, a actividade foi registado em primeiro lugar sob as condições padrão. Num segundo passo, a inibição sináptica foi bloqueada por adição de estricnina (1 uM) e gabazine (10 uM) à solução de banho extracelular. Isto conduz geralmente a desinibição de um padrão de actividade mais regular com rajadas e prolongados intervalos de explosão, o que facilita a definição de rajadas e, assim, a determinação de rajada de sincronização entre as fatias.

Culturas lesionados numa idade jovem (7 - 9 DIV) exibido uma elevada quantidade de actividade sincronizado 2-3 semanas após a lesão lesionado ao passo que as culturas nos estádios mais tardios (> 19 DIV) mostraram uma nítida redução na capacidade de regenerar (Figura 2 A - F). Estes resultados indicam que a capacidade de regeneraçãode conexões funcionais da coluna vertebral em culturas fatia cordão diminui a partir de um nível elevado, representando o estado embrionário in vivo, a um nível baixo, o que representa o estado mais desenvolvido in vivo, no prazo de três semanas em cultura.

Que tipos de conexões estão realmente envolvidos na sincronização estourou entre as duas fatias? Além conexões propriospinal, as fibras também pode surgir a partir de neurónios motores ou dorsal neurônios do gânglio da raiz. Foi demonstrado anteriormente que os neurónios do gânglio da raiz dorsal não são relevantes para a ligação funcional entre a medula espinal ¹⁰ fatias. No entanto, o envolvimento dos neurónios motores permaneceu uma possibilidade. Desde motoneurons são conhecidos para formar conexões colinérgicos para neurônios da medula espinhal através de receptores nicotínicos ^13, a atividade da medula espinhal co-culturas foi gravado em 8 DIV, num momento em que as culturas mostram altamente atividade ¹⁰ sincronizado, e o antagonista nicotínico Mecamilamina (MEC, 100 pM) foi adicionada à solução do banho extracelular. A participação de motoneurónios na conexão entre as duas fatias iria resultar numa diminuição da percentagem de actividade sincronizado. No entanto, este não era o caso (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; controle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, teste pareado de Wilcoxon). Estes resultados sugerem que as sinapses colinérgicas não contribuem para a ligação funcional entre fatias. No entanto, uma vez que os motoneurónios também foram exibidas para libertar glutamato nas sinapses no sistema nervoso central ^{11, 15,} estas experiências não excluir totalmente o seu envolvimento.

Para identificar motoneurons colorações de imuno-histoquímica contra a neurofilament não fosforilada H com SMI-32 foram realizadas. Eles revelaram vários corpos rotulados grandes celulares típicos para motoneurons, distribuídos ao longo do fatias (Figura 3A). O anticorpo SMI-32 tem sido relatado para rotular os corpos celulares de motoneurons ^{12 e} esta constatação também vale para as culturas utilizadas ^13. Além disso, colorações de corpos celulares neuronais em geral, por exemplo, contra o b-III-tubulina ou NeuN, bem como corpos celulares gliais, por exemplo., Astrócitos com anticorpo GFAP estão em linha com outros relatórios e combinar as descrições morfológicas desses tipos de células ( Figura 3 B - D). No entanto, a rotulagem dos axônios com o anticorpo SMI-32 é relativa (Figura 3E). Contra as expectativas, uma enorme rede de fibras aparece quando usando este anticorpo e parece semelhante à coloração SMI-31 que rotula fosforilada neurofilament H (Figura 3F). Uma interpretação desse resultado poderia ser que a regulação do desenvolvimento de neurofilament fosforilação / desfosforilação não é tão apertado nas culturas utilizadas em relação à situação in vivo. Uma ocorrência mista de neurofilamentos fosforiladas e não fosforiladas-no mesmo axónio pode explain este achado. Outra possibilidade é que os SMI-32 axónios marcados surgir a partir de neurónios de projecção. Tsang e seus colegas demonstraram que ¹⁶ por exemplo, colunas e colunas de células intermediolateral neurônios de Clark estão manchadas pela SMI-32 além de neurónios motores. Proliferação de neurites pronunciado desses neurônios também poderia explicar a abundância de SMI-32 fibras positivos.

Figura 1. Visualização e análise da atividade espontânea. (A) Diagrama de um MEA. Os eletrodos de platina coberto são retratados em preto, os fios transparentes em vermelho e do sulco no meio do MEA em amarelo. (B) Close-up do conjunto de eléctrodos localizados no centro da MEA. Os diagramas são gentilmente cedido pelo Dr. M. Heuschkel. Imagem de campo brilhante de um velho cultur 8 DIV (C)e. As fatias foram cultivadas e fundida ao longo dos lados voltados um para o outro. A barra amarela representa o sulco electrode- e sem isolamento do MEA. Barra de escala = 400 mm (D) Timeline de experimentos. Duas fatias de medula espinhal de embriões de ratos E14 são colocados ao lado do outro em acordos ambientais multilaterais. Dentro de poucos dias, as fatias de crescer e se fundem ao longo dos lados voltados um para o outro. Em um prazo de 8-28 DIV, lesões completas são realizadas através do site de fusão. Duas a três semanas mais tarde, a actividade espontânea é registada e as culturas são fixadas por colorações imuno-histoquímica. (E) vestígios atividade espontânea de cada eletrodo individual de uma cultura de 23 DIV idade. Para visualização mais clara, única a cada segundo traço é ilustrada. Traços de laranja retratam atividade que foi gravada a partir da fatia no lado direito, traços azuis do lado esquerdo. A maioria das @ bursts @ são sincronizados entre os dois. A seta aponta para uma explosão que ocorrem na fatia deixou que só partially propagadas para a fatia direita. A actividade na fatia direita no entanto não atinja o limiar escolhido de pelo menos 25% do pico de actividade máxima média de acordo com o lado e, por conseguinte, não é detectada como uma explosão. Ampliações à direita retratam o último par explosão sincronizado. (F) Raster gráfico da actividade mostrada em (E). (G) lote de atividade de rede com rajadas definidos (barras abaixo da linha de base) da atividade mostrada em (E). Adaptado de Heidemann et al. ^10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Sincronizado ou Atividade não sincronizado. (A, B) parcelas Raster de culturas Lesioned em idade jovem (a 7 - 9 DIV), que mostra a actividade sincronizados sob condições padrão (A) e sob desinibição (B). (C, D) parcelas raster de culturas lesionados em idade avançada (a> 19 DIV), que apresentam uma actividade não sincronizado, sob condições padrão (C) e sob desinibição (D). (E, F) Percentagem média de actividade sincronizado representada para cada lesão individual dia registada sob condições padrão (E) e sob desinibição (F). As gravações foram tomadas 2 - 3 semanas após o dia da lesão. Adaptado de Heidemann et al. ^10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Caracterização imuno-histoquímica. (A) Coloração de corpos celulares motoneurônio com SMI-32. (B) tubulina rotulagem de corpos celulares neuronais maduros e os seus processos de β-III. (C) Identificação de astrócitos com GFAP. (D) Rotulagem de corpo celular neuronal maduro com NeuN. (E) SMI-32 coloração de não-fosforilada neurofilament H. (F) neurofilament fosforilada H identificado por SMI-31. Adaptado de Heidemann et al. ^10. Note-se que com ambos, SMI-31 e SMI-32, uma grande rede de fibras é visível nas culturas. Bares AD = 20 mm, H & F = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Vários elementos do processo apresentados são fundamentais para a realização de experimentos precisos e reprodutíveis. Todos os passos durante a preparação das soluções e meas, a produção das culturas de fatias são realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os antibióticos não são aplicados ao meio nutriente, pois podem afectar a actividade espontânea ^14. Durante o revestimento MEA, a parte mais importante é certificar-se que a solução de gel matriz extracelular permanece frio em todos os momentos. Descongele na geladeira e mantê-lo em gelo durante todo o procedimento para garantir uma temperatura máxima próxima de 0 ° C. Durante a preparação do fatias rápido isolamento e corte, bem como prestar atenção a uma baixa temperatura, utilizando gelo buffers dissecção fria aumenta a porcentagem de culturas saudáveis. Além disso, o / trombina coagulação do plasma é um dos passos mais críticos. Primeiro, certifique-se de que o plasma é adequadamente mixed com a trombina. Em segundo lugar, prestar especial atenção à remoção de resíduos tanto quanto possível para assegurar a fixação adequada das fatias para os acordos ambientais multilaterais. Este passo é extremamente sensível ao tempo; Se o intervalo de tempo for demasiado curto, o excesso da mistura de plasma / trombina é removido. Se o intervalo de tempo for demasiado longo, já ocorreu coagulação, aumentando o risco de a remoção das fatias, juntamente com o resíduo de plasma / trombina.

Se as lesões mecânicas são planejadas, é importante a utilização de acordos ambientais multilaterais, com um planeamento cuidadoso. A área onde a lesão se destina precisa estar livre de eletrodos, fios e isolamento. Caso contrário, o sistema eléctrico do MEA vão ser danificado e, portanto, não há gravações pode mais ser executada.

Um outro passo crucial diz respeito ao tamanho da lesão. Foi demonstrado anteriormente que a reconexão duas pequenas fatias após lesão leva cerca de dois dias ^{a 10.} Para todos os experimentos, a regra de ouro foi usado que o espaço betwebr as fatias após lesão não deve ser maior do que a largura da ranhura de MEA (300 uM). Um tamanho maior lesão pode resultar em um prazo mais longo para a reconexão ou, se a lesão é muito grande, não reconexão em tudo. Para anotar, ex experiências revelaram que uma colocação inicial das duas fatias mais longe do que 1 mm resultados em uma taxa de ligação muito reduzida.

Antes do início da gravação, um tempo de ajuste de pelo menos 10 min à temperatura ambiente, em vez de 37 ° C da incubadora, e à solução extracelular, em vez do meio de nutrição é recomendado. Fechar observação do padrão de atividade durante esses minutos iniciais garante que os dados medidos representam o padrão estouro da cultura de forma adequada após a gravação foi iniciada.

Para a detecção da actividade, aquisição de dados e posterior processamento, hardware caseiro (câmara de gravação, ligações para os amplificadores e amplificadores), programas em laboratórioVIEW, C ⁺⁺ e IgorPro são usados. Setups MEA comerciais e outros pacotes de software são adequados, bem como para estas operações. Aqui, os sinais observados pelos eléctrodos são amplificados de 1001 vezes e, em seguida digitalizou a uma taxa de 6 kHz.

O modelo apresentado pode ser uma ferramenta útil para examinar as conexões propriospinal porque in vivo, eles são difíceis de estudar sem a interferência do ascendente e descendente feixes de fibras. O co-cultura das duas fatias de medula espinhal pode elegantemente contornar este problema. As culturas proporcionar um microambiente que pode ser rigorosamente controlado e manipulado facilmente. Por outro lado, a entrada sensorial e supraespinal é falta de curso. Além disso, o processo da preparação de cultura representa uma situação de lesão do SNC. As células da glia como microglia e astrócitos são conhecidos por responder à lesão com o aumento da proliferação e, portanto, o tecido é, em certa medida reorganizado. Relativa ao modo apresentadol a formação de uma cicatriz glial após a realização de lesões mecânicas não foi observado. Uma explicação pode ser que os mecanismos adaptativos de astrócitos já foram desencadeadas durante o processo de preparação e que as lesões das culturas não resultou em uma resposta ainda mais. Além disso, não há evidências para o envolvimento de inibidores associados mielina, por exemplo., Nogo-A, em baixo potencial de regeneração de culturas lesionados em idade avançada. No entanto, foi demonstrado que o tratamento com o inibidor da fosfodiesterase 4 Rolipram, começando imediatamente após a realização de lesões em 23 DIV aumenta a regeneração funcional entre as fatias ^10. Estes resultados demonstram que a recuperação funcional pode ser aumentado em culturas velhas. Visivelmente, quando a contagem do número de axônios que cruzam o local da lesão, não houve diferença entre as culturas lesionados em uma idade jovem e culturas lesionados em uma idade avançada foi descoberto. Estes resultados sugerem que a falta de regeneração axonal não é a razão principal fou a perda de recuperação após lesões tardias na cultura e, portanto, enfatizam a necessidade de um modelo que permite a análise funcional da regeneração. Formação sináptica e plasticidade sináptica poderia desempenhar um papel importante no processo de recuperação ^10. Estes mecanismos ganhou muita atenção nos últimos anos e é hoje amplamente aceito que eles têm um grande impacto sobre o resultado após a lesão medular. Portanto, um modelo que proporciona condições estáveis ​​para a investigação dos processos em isolamento e em grande detalhe pode certamente ajudar a obter uma visão sobre a regeneração funcional na medula espinhal.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz de multieletrodos planar	Qwane Biosciences		feito sob medida de acordo com o design do nosso laboratório
Meio			Para 100 ml
Dulbeccos modificado Meio de águia Gibco		31966-021	80 ml
Soro de cavalo	Gibco	26050-070	10 ml
água			10 ml
Fator de crescimento nervoso-7S [5 ng/ml]	Sigma-Aldrich	N0513	200 µ l
reconstituído em solução de lavagem com solução
			de revestimento
Gel de matriz extracelular	BD Biosciences	356230	Deve permanecer frio o tempo todo; diluir 1:50 com meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários
meio otimizado para neurônios pré-natais e embrionários	Gibco	21103-049
Solução		de lavagem	[mg/L]
MgCl2-6H2O			100
MgSO4-7H2O			100
KCl			400
KH2PO4			60
NaCl			8.000
Na2HPO4 anidro			48
D-Glicose (Dextrose)			1.000
De acordo com o protocolo http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html
Solução extracelular (pH 7,4)			[mM]
NaCl			145
KCl			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES			5
Na-piruvato			2
Glicose			5
Solução
Detergente: Triton X-100			0,3%, prejudicial se engolido
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9418	1%
Soro de cabra	Gibco	16210-064	5%
Plasma de frango	Sigma-Aldrich	P2366	liofilizado, reconstituir com solução de lavagem
Gabazine	Sigma-Aldrich	SR-95531
Cloridrato de mecamilamina	Tocris	2843	tóxico por ingestão
Micropipeta	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
Paraformaldeído			prejudicial, 4%
SMI-31	Covance	SMI-31P
SMI-32	Covance	SMI-32R-500
Estricnina	Sigma-Aldrich	S0532	trombina tóxica
	Merck Millipore	1123740001	irritante, sensibilizante, reconstituir com solução
de lavagemTubo plano de cultura de tecidos 10 (= tubo de rolo)	Techno Plastic Products AG	91243

nutriente de destilada, estéril BSA a 1% de Bloqueio