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A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

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DOI:

10.3791/53131

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26 de novembro de 2015

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1Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Sciences, Medical University of South Carolina, 3Intuitive Surgical, Inc

Neste artigo

Resumo

Existem vários métodos para a introdução de agentes ototóxicos na cóclea de modelos animais. Apresenta-se um protocolo cirúrgico para entrega de agentes ototóxicos no nicho da janela redonda. O procedimento é confiável, cria lesões intracocleares direcionadas e evita danos mecânicos à microarquitetura. O exame do autorreparo/regeneração coclear é possível.

Resumo

Os pesquisadores utilizaram uma ampla gama de modelos animais e técnicas de investigação para estudar o sistema auditivo dos mamíferos. Grande parte da pesquisa básica envolvendo a cóclea e suas vias neurais associadas envolve a exposição de cócleas modelo a uma variedade de agentes ototóxicos. Isso permite que os investigadores estudem os efeitos de danos direcionados às estruturas cocleares e, em alguns casos, o auto-reparo ou regeneração dessas estruturas. Existem várias técnicas para a administração de agentes ototóxicos na cóclea. Ao selecionar uma técnica específica, os investigadores devem considerar vários fatores, incluindo a indução de toxicidade sistêmica inadvertida, a quantidade de dano coclear produzido pelo próprio procedimento cirúrgico, o tipo de lesão desejada, a capacidade de sobrevivência do animal e a reprodutibilidade/confiabilidade dos resultados. As técnicas atualmente estabelecidas incluem injeção parenteral, injeção intraperitoneal, injeção transtimpânica, injeção de saco endolinfático e cocleostomia com perfusão perilinfática. Cada um desses métodos foi utilizado com sucesso e está bem descrito na literatura; no entanto, cada um tem várias deficiências. Aqui, apresentamos uma técnica para aplicação tópica de agentes ototóxicos diretamente no nicho da janela redonda. Esta técnica não é invasiva para as estruturas do ouvido interno, produz início rápido de lesões direcionadas de forma confiável, evita toxicidade sistêmica e permite um controle intra-animal (o ouvido contralateral). Os resultados decorrentes dessa abordagem ajudaram a entender melhor a fisiopatologia auditiva, a degeneração das células cocleares e a capacidade regenerativa em resposta a uma lesão aguda. Investigações futuras podem usar esse método para realizar estudos intervencionistas envolvendo terapia gênica e transplante de células-tronco para combater a perda auditiva.

Introdução

Os investigadores têm utilizado uma grande variedade de modelos animais para estudar a função normal do sistema auditivo, bem como a fisiopatologia da perda de audição. Estes modelos também são muito úteis para a realização de estudos de intervenção contra vários processos patológicos e servir de base para aplicações de translação em seres humanos. Para a maioria das pesquisas envolvendo a cóclea e suas vias auditivas associadas, algum grau de danos ou perturbações devem ser introduzidos no sistema. Muitas vezes, o dano é intencionalmente destinado a criar uma lesão específica, permitindo que os investigadores a estudar o efeito de que a lesão na função normal, bem como a capacidade coclear para recuperar dele. Ao seleccionar um modelo animal em particular e / ou a técnica (s) para a introdução de dano, um número de factores deve ser considerado para conseguir os melhores resultados possíveis. Vários modelos animais podem responder de forma diferente a intervenções, enquanto os efeitos diretos e indiretos de uma técnica pode serinteiramente deletério para o resultado desejado. Na maioria dos casos, o protocolo ideal danos ouvido interno poderia evitar a toxicidade sistémica, rapidamente e com fiabilidade produzir danos, criar uma lesão precisa e consistente, e ser de sobrevivência para permitir um estudo mais aprofundado das alterações funcionais, celulares e moleculares. Idealmente, esses métodos também preservaria a microarquitetura e gradientes eletroquímicos delicadas da cóclea, na medida do possível.

Até à data, os investigadores tiveram sucesso em estabelecer um número de técnicas para induzir lesões do ouvido interno. A maioria destes implica expor a cóclea a um agente ototóxico sistemicamente ou por via cirúrgica. As técnicas incluem a injecção parenteral, injecção intra-peritoneal, a injeção trans-timpânica, injeção endolinfático sac e cocleostomia com perfusão perilinfática. Estas técnicas têm sido utilizados para introduzir uma variedade de agentes ototóxicos, tais como a furosemida, a gentamicina, a ouabaína, e heptanol 1-5.Embora bem sucedido na criação de lesões cocleares específicos, as técnicas acima também reconheceram limitações. Injecções sistémicas podem ser altamente tóxico para o animal e pode ser associado com insultos cocleares não intencionais e resultados inconsistentes. Este último defeito também tem sido associada com injecções trans-timpânica. Técnicas como a cocleostomia e perfusão perilinfática, enquanto capazes de induzir lesões rápidas e altamente confiáveis, estão diretamente invasiva à estrutura do ouvido interno e função. Muitas das abordagens cirúrgicas são também associados a um alto grau de dificuldade técnica e pode requerer deixando objetos estranhos no animal, como um infusor micropump. 2-4,6-8 Nenhuma técnica única está livre de falhas, e os investigadores devem escolher métodos cuidadosamente para atender suas necessidades experimentais. Aqui, descrevemos, em detalhes, o nicho da janela redonda (RWN) técnica de aplicação para a entrega tópica de agentes ototóxicos em ratos adultos.

Fiprimeiro descrito por Husmann et ai, em 1998, ao estudar o efeito da gentamicina em degeneração de células pilosas sensitivas em um modelo aviário, esta técnica mostrou ser capaz de produzir lesões significativamente mais fiáveis ​​do que a aplicação de gentamicina sistémico, evitando as toxicidades associadas. 9 Desde então, uma número de outros pesquisadores, incluindo nosso laboratório, têm utilizado esta técnica com grande sucesso. Em 2004, Heydt et al. adaptado para um modelo de ratinho e descrita uma maior capacidade para controlar o tamanho da lesão, preenchendo o RWN com esponja de gelatina absorvível embebido em concentrações variáveis ​​de gentamicina. 10 Palmgren et al., em 2010, estudaram os efeitos ototóxicos de beta-bungarotoxina, um potente elemento no veneno das faixas de Taiwan caixa, através da aplicação de uma forma aquosa do mesmo para o RWN de ratos adultos. 11 Além disso, um número de estudos anteriores de nosso laboratório utilizada a abordagem da janela redonda para estudar os efeitos ototóxicos de furosemidae, ouabaína, e heptanol. 5,6,12-15 Os resultados destes estudos têm demonstrado a importância de fluido coclear e homeostase de íons de audição normal, descobriram células capacidade proliferativa no gânglio espiral e parede lateral da cóclea, e aumentado o nosso entendimento da relacionada com a idade perda auditiva.

A seguinte abordagem envolve o acesso cirurgicamente no ouvido médio através de uma incisão retroauricular e destelhamento parcial da bula timpânica óssea. Isto permite uma excelente exposição do RWN membrana e para o qual um agente ototóxico seleccionado pode ser aplicado directamente. O agente líquido, em seguida, piscinas no oco do tipo copo do RWN (ou lentamente drena a partir de um portador de gelatina esponja absorvível saturada lotaram o RWN) e difunde através da membrana da janela redonda no espaço perilinfático do vestíbulo coclear. Sem cocleostomia direta é feita nesta abordagem. As vantagens desta técnica incluem a preservação da orelha interna microarquitetura, evasãode toxicidade sistêmica, o subsídio de um intra-animal controlo orelha, o início rápido de efeito, degeneração seletiva em certos tipos de células da cóclea (por exemplo., Tipo I espiral neurônios do gânglio com exposição ouabaína e tipo coclear II fibrocytes induzidos pelo tratamento de heptanol), e resultados reprodutíveis / fiáveis. Esta técnica pode ser aplicada, com algumas alterações entre outras espécies de roedores, incluindo ratos, cobaias e gerbos. Inconvenientes incluem uma curva de aprendizagem técnica íngreme e a limitação relativa de insulto ototóxico que é limitada a um único ponto no tempo.

Protocolo

Todos os aspectos da pesquisa animal foram conduzidos de acordo com as orientações do Comitê Animal Care Institucional e uso apropriado. Todos os procedimentos experimentais em animais vertebrados descritos aqui foram aprovadas sob as diretrizes da Universidade Médica da Comissão (MUSC) Institutional Animal Care e Uso da Carolina do Sul (IACUC).

Seleção 1. Modelo

  1. Manter o modelo animal em um viveiro de baixo ruído com guarda de rotina por protocolos institucionais até estar pronto para uso. Em pesquisas com animais instalações (ARFs), manter a estabilidade de vibração, amortecimento de ruído, iluminação diurna, espaço de preparação, acabamentos de superfície, vedação e calafetagem, e ventilação que cumprem as normas do NIH.
    Nota: Institutos Nacionais de Saúde (NIH) diretrizes para ARFs e manutenção de um baixo ruído viveiro pode ser revista em: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
  2. Para todos os experimentos, use a orelha direita como na orelha experimental. A orelha esquerda serve como um controlo intra-animais e não é alterada cirurgicamente.
  3. Inspecione o modelo animal pré-operatório para detectar sinais de infecção do ouvido médio ou externo. Sinais potenciais podem incluir a drenagem de fluido ou pus do ouvido, tecido inflamado pavilhão auricular, e / ou letargia do animal. Isso é incomum, mas se observou, evitar mais cirurgias e tratar o animal de forma adequada.

2. Os procedimentos pré-operatórios

  1. Anestesiar o animal 30 minutos antes da cirurgia e quaisquer procedimentos perioperatórios via intraperitoneal (IP) de injecção de cetamina (100 mg / kg ip) e xilazina (20 mg / kg IP). Suplemento anestesia, conforme necessário, tal como avaliado por um reflexo positivo de igual pitada, com uma dosagem inferior de cetamina (25 mg / kg ip) e xilazina (5 mg / kg IP). Determinar a dosagem em conformidade com os protocolos institucionalmente permitidos para camundongos com idade de ajustamentos adequados dose.
  2. Verifique se há plena sedation do modelo. Verifique se há um estágio 3 plano de anestesia para a totalidade do protocolo descrito marcada por uma taxa de respiração regular, a falta de reflexo de endireitamento (em ratos), e falta de pedal e palpebral (toe-pitada) reflexos. Manter o animal a este nível de anestesia. Isso é fundamental para a minimização da dor e do movimento intra-operatória, sangramento e vazamento de líquidos intersticiais durante a cirurgia.
  3. Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C com uma almofada de aquecimento de circuito fechado.
  4. Administrar analgesia através de injecção subcutânea de buprenorfina. Deliver buprenorfina (0,1 mg / kg SQ uma vez 30 minutos antes da cirurgia) como analgesia para minimizar qualquer desconforto cirúrgico. Dosagem de base e as alternativas adequadas ao modelo selecionado em protocolos institucionalmente aprovados. Uso de antibióticos não é necessário se boa técnica asséptica tem sido praticada. Os animais recebem analgesia pós-operatória se há sinais de dor e sofrimento.
  5. Execute physiologic testes pré-operatório. Execução de tronco encefálico (ABR) o teste auditivo e / ou produto de distorção testes de emissões optoacoustic (EOAPD), tanto no pré-operatório e apenas antes do sacrifício do animal serve como uma medida objetiva para o efeito do agente ototóxico escolhido em audição do mouse.

3. Preparação cirúrgica e Posicionamento

  1. Esterilizar todos os instrumentos de pré-operatório por normas institucionais. Prepare instrumentos cirúrgicos e campo de uma forma consistente, estéril, e organizada para evitar esforços desnecessários e movimento durante o procedimento. Instrumentos típicos exigida inclui tesouras de dissecação afiados, vários pares de pinças metálicas com dicas de joalheiro, um picador de otológica, uma cureta otológica, e uma unidade de eletrocautério bipolar (Figura 1).
  2. Prepare e esterilizar mechas de papel feitas de labwipes com antecedência pelo corte de um pequeno pedaço triangular da limpeza (~ 0,7 em x 1,25 em x 1.75 in) e torcendo-a com força entre o polegar eo indicador de uma mão (~ 1,25 in). Criação de um pavio extremamente fina firmemente torcida é fundamental para o sucesso do procedimento. Preparar um total de 15-20 mechas antes da cirurgia (Figura 2).
  3. Use uma broca de dentista para perfurar rapidamente o osso da bula timpânica de uma forma controlada. O uso de uma broca de mão dental acionado por correia com uma ponta de 1 ou 2 mm cônico é preferível. Um microscópio operatório é necessário para completar o protocolo. (veja o Passo 4.7)
  4. Pré-desenhar 0,2 ml de uma solução aquosa contendo o agente ototóxico seleccionado dentro de uma seringa de tuberculina de 1 ml com um 28 g, 1/2 'agulha. Tipicamente uma gota (~ 10 ul) do agente é suficiente para encher completamente o RWN rato. A metálico, agulha ponta da seringa sem corte facilita a administração do agente, evitando danos às estruturas subjacentes por uma ponta afiada de bisel. Expelir o ar no interior da seringa como bolhas pode inadvertidamente encher o RWN e / ou prevenir adequadaaplicação do agente à janela redonda si.
  5. Retire a pele da pele pós-auricular usando cortadores de higiene elétricos. Retire a pele em uma zona que se estende desde o vinco aurículo-cefálica rostralmente ao caudal cintura escapular. Estender a remoção do cabelo do dorsal, na linha média sagital ao ângulo mandibular lateralmente. Remoção adequada da pele é fundamental para a manutenção de um campo cirúrgico limpo e claro. Escove suavemente recortes de sítio cirúrgico pretendido.
  6. Esterilizar a pele da área preparada por protocolos institucionais. Aplicar betadine (povidona / iodo) alternadas com etanol topicamente de um modo circular durante 2 min. Outros agentes podem ser substituídos por diretrizes institucionais.
  7. Colocar o animal sobre uma superfície plana para manter o posicionamento do corpo constante durante o processo. Utilize uma pequena almofada de aquecimento colocada por baixo do corpo para a plataforma para controlar a temperatura do corpo durante o processo para manter a temperatura corporal do animal em 36-38 ° C. Não overheat o animal, pois isso pode levar a leve a lesões cutâneas graves e / ou eutanásia cedo.
    1. Fixe a cabeça do animal através de um aparelho de suporte de bloco de mordida / cabeça. Utilizar um 0,5 cm por 2 cm bloco de mordida usinado de latão com buracos de 2-4 mm de diâmetro perfurados por ela em intervalos de 5 mm ao longo do eixo longo. Abra a boca do animal em todo este acessório e se encaixam os incisivos centrais superiores em um dos buracos, dependendo do tamanho do animal. Aperte levemente uma pequena braçadeira sobre o dorso do focinho do animal para segurá-la no lugar (Figura 3).
    2. Confirmar que o suporte de bloco / cabeça da mordida está rigidamente ligado ao centro de um braço articulado em forma de U (Figura 3). Fixe uma haste de 1 centímetro de largura para o braço esquerdo do "U" e usar haste como um descanso principal do lado esquerdo (o lado direito é o lado operacional).
    3. Uma vez firmemente fixado no suporte de cabeça, gire o mouse para uma posição de decúbito lateral esquerdo. Posicione o corpo carefully na superfície plana de funcionamento para garantir que será estável durante todo o procedimento e evitar a tensão de torção indevida sobre as vértebras cervicais.
  8. Posicione um microscópio cirúrgico capaz de 4x, 10x, 20x e sobre o campo cirúrgico. Confirmar que o microscópio pode manter a sua posição de um modo mãos-livres tal como este é ideal para o protocolo cirúrgico de duas mãos discutido abaixo.
  9. Coloque uma unidade de cautério habilitado para bipolar com peça de mão do joalheiro de ponta fina em uma posição que está imediatamente disponível para a assistência na cauterização de pequenos vasos e dissecção do tecido. Isto pode também ser necessário um sangramento mais pesado deve ser encontrado.

4. Abordagem Cirúrgica

  1. Sob ampliação microscópica, use uma tesoura afiada ou uma lâmina de bisturi para criar uma incisão postauricular 1-1,5 cm, cerca de 6-8 mm caudal ao vinco auriculocephalic. No ratinho adulto, uma incisão de linha média dorsallateralmente a um ponto perto do ângulo de mandíbula é adequada. Evitar o corte cuidadosamente profundamente para preservar estruturas vasculares subjacentes.
  2. Realizar cuidadosa dissecação romba através da camada de gordura subcutânea que pode ser de espessura variável. A gordura pode ser removida de forma segura, se necessário para uma melhor exposição. Tome cuidado ao dissecar em uma direção ventral-medial como a veia jugular externa atravessa esta área e danos a essa estrutura pode causar grandes quantidades de perda de sangue e inundações do campo cirúrgico. Controlar qualquer sangramento excessivo com esponjas de gelatina absorvíveis e / ou bolinhas de algodão. Use cautério bipolar para um sangramento mais pesado.
  3. Uma vez que a camada de gordura é adequadamente dividido, expor a musculatura do colo do útero. Nota estruturas importantes, incluindo o corpo grande músculo dos cleidomastoideus centralmente no interior do campo cirúrgico exposto, a veia jugular externa ventralmente, e o tecido da parótida rostral sobrepondo o ângulo de mandíbula. Um marco importante é um pequeno nervo branch (XI do nervo craniano) que circunda o bordo posterior / dorsal do cleidomastoideus estender rostral para o pavilhão auricular (Figura 4).
  4. Suavemente retrair o corpo muscular cleidomastoideus em uma direção posterior / dorsal (Figuras 4, 5). Gentilmente dividir a fáscia transparente que envolve o corpo muscular. De um modo semelhante, a retrair suavemente parótida e veia jugular externa na frente (anterior / ventral) o sentido (Figura 5).
  5. Com boa retracção do corpo de músculo cleidomastoideus, a cúpula brilhante do periósteo bula timpânica entrará em vista (Figura 6). No aspecto caudal do bula, a inserção de um músculo do colo do útero mais profundo, o sternomastoideus, vai entrar em vista (Figura 6). Preservar o nervo facial, que se torna visível na parte dorsal e rostral aspecto da cúpula bula. Coloque um afastador de auto-retenção (titânio estéril shaft-- incorporado em silicone descartáveiscolar) antes da perfuração.
  6. Com a técnica de duas mãos, gentilmente dividir o periósteo bula, com diatermia bipolar para expor o osso subjacente. Utilizando uma pinça ou uma cureta otológica, gentilmente elevar e empurre o periósteo numa direcção periférica para expor amplamente a cúpula bula.
    Nota: Etapa 4.6 é crítica para maximizar a visão cirúrgica do espaço do ouvido médio. Utilize manipulação dos tecidos moles meticuloso e delicado para evitar sangramento e / ou vazamento de fluido intersticial na cavidade bula após a perfuração.
  7. Após uma cúpula de bolha com uma exposição adequada, faça um furo piloto 2 milímetros através do osso bula com uma broca cirúrgica dental entre a margem caudal da cúpula e da linha visivelmente opaca (representando a membrana timpânica) que se estende em todo o aspecto rostral da bolha (Figura 7). Tome cuidado para perfurar somente através do osso para preservar as estruturas subjacentes, como a artéria estapediano. Perfurar um segundo furo piloto nas proximidades para facilitar un-cobertura do osso bula ( Figura 7).
  8. Usando um par de fórceps ponta do joalheiro, uncap o osso bolha em um dorsal e direção caudal (Figura 8). Retirar o osso de forma fragmentada sob alta ampliação. Não perfurar a artéria estapediano, que fica logo abaixo da tampa bula, como sangramento desta artéria pode comprometer o procedimento. Minimizar a quantidade de osso removido para evitar a entrada excessiva de líquidos para o ouvido médio, enquanto ainda permitindo excelente visualização e acesso ao nicho da janela redonda (Figura 8).

5. Rodada Janela de Aplicativo de ototóxicos Agent

  1. Fazer ajustes rotacionais sutis para suporte da cabeça para trazer o RWN diretamente à vista. O RWN normalmente está localizado no aspecto dorsal e caudal do espaço da orelha média e aparece como um recuo do tipo copo do osso cápsula ótica. Na maioria dos casos, a artéria estapediana corre 1-2 mm ventral / rostral a esta. O RWN às vezes pode ser tucked perifericamente sob uma angulação aguda da cúpula bula. Em tais casos, o posicionamento cuidadoso da cabeça do animal é primordial.
    1. Usando os pavios de papel preparados no pré-operatório, remover todo o fluido visível na orelha média e RWN até osso seco é visualizado.
      Nota: Este é o passo mais importante de todo o protocolo, como a ~ 10 ul (1 gota) de agente ototóxico aplicada ao RWN pode facilmente ser diluído por este fluido.
  2. Sob ampliação máxima, use uma agulha de calibre fino em uma seringa de 1 ml de tuberculina para aplicar uma gota (~ 10 l) de agente ototóxico diretamente ao RWN, enchendo-o completamente. Tome cuidado para não perturbar a artéria estapediano e observar de perto para a substituição de uma pequena reflexão da luz na base de um nicho seque com um maçante e nebulosas menisco fluido como um indicador de que o nicho é preencher corretamente.
    1. Permitir que o agente para descansar dentro do RWN para o tempo de exposição de aproximadamente 10 min. Depois disto, completamente Wick o agente e substituí-la por uma nova aplicação do mesmo agente. Determinar repetições de aplicação de acordo com as especificações do agente. O tempo total de exposição a este processo varia, tipicamente, entre 30 a 60 min.
    2. No final do procedimento, pavio completamente afastado do agente de uma última vez e aplicar o agente de fresco para RWN. Deixar a bula destapados e utilizar uma pinça para fechar o tecido mole sobre o local cirúrgico.
  3. Selar local da cirurgia ao nível da pele com uma 4-0, a sutura de monofilamento não absorvível. Colocar o animal em uma gaiola de recuperação / estação. Monitorar a condição clínica do animal na sequência de regularidade da operação. Manter o animal em condições ambientais adequadas, incluindo a habitação com roupa de cama macia e suplementação com alimento macio, para minimizar o estresse. Determinar os procedimentos futuros e condições pós-operatórias de acordo com os protocolos IACUC institucionais.
  4. Use protocolos IACUC institucionais para esterilizar instrumentoss antes de usar no próximo animal. Permitir tempo resfriamento adequado entre o uso de instrumento.

6. Os procedimentos pós-operatórios e Coclear colheita Tissue

  1. Tal como descrito no passo 2.5, realizar o teste fisiológico da audição no pós-operatório em pontos desejados e antes do sacrifício. Realizar procedimentos pós-operatórios de acordo com objetivos experimentais. Sacrificar o animal em qualquer dia de pós-operatório desejado.
  2. Após a anestesia completo através de injeção IP, conforme exigido por protocolos institucionais IACUC, sacrificar o animal. Usando uma tesoura afiada, decapitar animais apenas caudal ao occipital. Acentuadamente abrir a caixa craniana com uma tesoura ao longo da dorsal e ventral e se espalhou amplamente. Delicadamente retire o tecido cerebral para expor os ossos temporais.
    Nota: Uma série de procedimentos para investigação de alterações pós-exposição na cóclea pode ramificar a partir deste ponto e será mencionado na seção de discussão. Determine o método de investigação mais relevant para os fins experimentais. Se microscopia eletrônica está prevista após a cóclea são seccionadas, utilize o cateterismo cardíaco pré-fixar o tecido. Isso está além do escopo desta discussão e tem sido abordado de forma aprofundada em outros lugares. 13
  3. Corte os ossos temporais para fora da base do crânio com a tesoura e imediatamente colocado em solução fixadora. Imergir ossos directamente em paraformaldeído a 4% durante 1,5 h à TA. Monitorar tempo de fixação, como a longa duração pode limitar o resultado da análise histológica em etapas posteriores. Descalcificar dissecados ossos por um período de tempo variável via submersão em 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

Resultados

Em um estudo recente por Stevens et al utilizando o protocolo anterior, camundongos adultos CBA / CaJ de ambos os sexos foram expostas via rodada janela difusão de heptanol. 15 Heptanol é uma junção de lacuna un-acoplador conhecido por produzir alvo, lesão recuperável para as células do parede lateral coclear. O objectivo do estudo foi o de produzir um modelo fiável para danos coclear alvo, permitindo a investigação de regeneração pós-cirúrgica de quaisquer elementos danificados. Limiares auditivos pré-cirúrgica e pós-cirúrgica serviram como um ponto de extremidade funcional. Microscopia e técnicas de coloração imuno-histoquímica foram usadas para estudar alterações morfológicas. Aumentos significativos em limiares ABR foram observados nos ratinhos tratados com heptanol (Figura 9). Os animais de controlo que receberam a cirurgia sham, com entrega de solução salina em vez de heptanol, não demonstraram mudanças significativas limiar em qualquer freqüência testada.

Immunostaining contra uma retificação para dentrocanal de potássio (Kir) 4,1 serviu como um método indireto para a visualização de danos / recuperação de estruturas cocleares. Isto demonstrou diferenças altamente reprodutíveis entre tratamento e controle ouvidos. Em geral intensidade de coloração foi marcadamente diminuída dentro da estria vascular (STv) e entre fibrócitos do ligamento espiral (SLF), 1-3 dias após a exposição heptanol, denotando uma grande quantidade de danos em função destas áreas. Houve uma diminuição em particular no Kir 4.1 intensidade de coloração nas áreas de Tipo II e Tipo IV SLFs (Figura 10) e STV (Figura 11). Evidência de integridade nuclear interrompido e cromossómico condensação / bolhas típicas da apoptose celular também foi observada em counterstains nucleares nestas áreas cocleares (Figura 10). Vacuolizados zonas de Kir 4.1 a coloração marcadamente resolvido em 7 dias e estavam ausentes inteiramente por 14 dias. Quando Kir 4.1 intensidade da coloração foi quantificada nas áreas de STV, orelhas tratadas demonstraram uma initicalha ai seguida por uma mudança significativa (p <0,05) de volta para o controlo da intensidade de 7 dias após a exposição heptanol (Figura 12).

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Figura 1. Instrumento configurar. Representação de pré-cirúrgica set-up da instrumentação. Todos os equipamentos devem ser de fácil acesso dentro do campo cirúrgico estéril. Instrumentação típica inclui 2 tesoura afiada dissecção, 2-3 em linha reta e / ou pinça curva do joalheiro ponta com curetas de orelha, picaretas otológicos eixo curvado (substituído com Rosen pega mais tarde - não apresentado), e uma unidade eletro-cautério com uma pinça fina do joalheiro ponta curvada headpiece. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2. Fornecimentos cirúrgicos. Suprimentos adicionais para a manutenção do meio ambiente RWN. Recortes labwipe esterilizados para a formação de pavio de papel (à esquerda), papel firmemente formado Wicks feita a partir de toalhetes esterilizados de laboratório (centro), e 4 pelotas mm de algodão (direita) são usados ​​para limpar o excesso de líquido e inundações sangue no nicho da janela redonda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. titular cabeça Animal. Imagem que descreve o suporte de cabeça e bloco de mordida. Os buracos no bloco caber e proteger os incisivos centrais superiores. A braçadeira é apertada suavemente sobre o focinho dorsal para proteger o animal no lugar. O uso de um suporte de cabeça é crítica para OUTC cirúrgico com sucessoome. Idealmente, este deve ser capaz de rodar em torno do eixo rostral-caudal do animal para otimizar vistas cirúrgicas da bula durante o procedimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4. Cleidomastoideus m.. Gráfico esquemático que representa a anatomia de base da musculatura cervical roedor e sua associação com a veia jugular externa. O músculo cleidomastoideus é o músculo mais prontamente identificados durante a abordagem cirúrgica. A liberação da fáscia envolvente seguido de retração posterior / dorsal do corpo do músculo irá direcionar a dissecção cirúrgica para a bula timpânica (círculo). Por favor clique aqui para ver alversão Arger desta figura.

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Figura 5. Área de Exposição cirúrgica. Descreve a exposição após a dissecção através das camadas de gordura cutâneos e subcutâneos. Marcos estruturais da nota incluem um ramo da XI nervo craniano que recobre o músculo cleidomastoideus (A), a veia jugular externa (B), e os tecidos expostos parótida (C). O ramo cranial XI nervo é muitas vezes associada a uma pequena embarcação e deve ser dividida antes de prosseguir. Direita para a esquerda na imagem corresponde ao eixo rostral-caudal do animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. A exposição do bulla. A exposição da bula timpânica após retração da cleidomastoideus e estruturas adjacentes. Marcos notáveis ​​incluem o corpo do músculo cleidomastoideus (A) reflecte posteriormente / dorsalmente, o nervo facial (B), e a cúpula brilhante do periósteo bula timpânica (C). Além disso, note a inserção do músculo sternomastoideus no aspecto caudal esquerdo da bula timpânica (asterisco). A presença do nervo facial no aspecto dorsal e rostral da bolha é um marco fundamental para a verdadeira identificação da bula. Direita para a esquerda na imagem corresponde ao eixo rostral-caudal do animal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7. Expor rodada janela nicho eu. Imagem que descreve o tympanic bula totalmente exposto após dissecção do periósteo sobrejacente. O orifício piloto é o melhor colocado no meio do caminho entre a borda caudal da cúpula bula e uma linha opaca sutil visualizado dentro do aspecto rostral da bula (representando a membrana timpânica). Um segundo buraco piloto adjacente pode facilitar mais fácil un-cobertura do osso bula. Evitar a perfuração profunda deve ser feita de modo a não ferir a artéria estapédico subjacente. A, objeto metálico escuro na parte inferior da imagem é o afastador de tecido mole de titânio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8. Expor janela redonda nicho II. Bula timpânica não nivelada com a exposição do nicho da janela redonda (seta) e artéria estapediano (estrutura vermelho1-2 mm lateral ao nicho) como visto sob ampliação de 20x. O nicho muitas vezes coloca em posição dobrada sob o ângulo agudo formado pela cúpula bula com a cápsula ótica no aspecto caudal do cúpula. É imperativo que a visualização completa do nicho ser conseguido antes da aplicação do agente ototóxico ou wicking. Remoção óssea excessiva durante uncapping também deve ser evitado como líquido intersticial / sangue tende a inundar a cavidade quando grandes buracos foram criados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9. Os resultados representativos -. Heptanol perda auditiva induzida e recuperação audiometria de tronco cerebral média (ABR) limiares (dB SPL) plotados em função do tom pipfreqüência. As medições são agrupados de acordo com pré-exposição (Black-Control) e pós-operatório (POD) 1, 7 e 14 (vermelho). As barras de erro representam SEM. Figura foi re-plotada de Stevens et al. 2014. 15 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 10. Os resultados representativos - Targeted lesão coclear após exposição heptanol parte I. Alterações do potássio Inner Retificador (Kir) Canal 4.1 coloração dentro da estria vascular (STV) de orelhas tratadas com heptanol e controlar ouvidos. (A) Normal Kir 4.1 coloração típica de orelhas controle com afinidade celular estrial forte para Kir 4.1 (verde). (B) orelha tratamento no 1º dia do PO. Vacuolizados grandes zonas de decrfacilitado afinidade Kir 4.1 são vistos dentro da STV (Setas), juntamente com uma diminuição global na STV Kir 4.1 intensidade da coloração. Os núcleos são contrastadas com iodo de propidio (vermelho) (B). Barra de escala = 15 mm. Figura foi re-plotada de Stevens et al, 2014. 15 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 11. Os resultados representativos - Targeted lesão coclear após exposição heptanol parte II Alterações no ligamento espiral (SL) de heptanol ouvido tratado em relação ao controle ouvido.. (A) Normal Kir 4.1 coloração (verde) dentro do SL típico de ouvido com controle de tipo aparentemente normais II fibrócitos do ligamento espiral (II). (B) t heptanolorelha reated com diminuição acentuada na intensidade Kir 4.1 coloração na área de tipo II fibrócitos ligamento espiral, perturbação nuclear e cromossómico de condensação / bolhas consistentes com apoptose (setas). Os núcleos são contrastadas com iodo de propidio (vermelho). Barra de escala = 15 mm. Figura foi re-plotada de Stevens et al, 2014. 15 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 12. Os resultados representativos -. Recuperação de intensidade de coloração coclear após exposição heptanol A média de luminescência relativa de Kir 4.1 coloração traçada em função do dia de pós-exposição. Luminescência relativa é calculado como Kir 4.1 intensidade reflexiva sob microscopia confocal em heptanol deleiteorelhas ed tomado como uma percentagem do mesmo em orelhas de controlo. Nota POD14-28 dados são reunidas como um único ponto na curva. Os círculos a cheio representam os valores médios, enquanto as barras de erro representam o erro padrão da média. Foi demonstrada uma recuperação significativa de luminescência relativa entre POD 7 e datas posteriores (teste t de Student p <0,05), o Asterisk. Figura foi re-plotada de Stevens et al., 2014. 15 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os resultados de protocolo e representativos acima descritos foram obtidos em um modelo de rato CBA / CaJ incluindo ambos os sexos. Esta linhagem consanguínea está bem estabelecido como um padrão "boa audição" e modelo de "envelhecimento normal" na investigação auditiva. 16-23 Descrição do uso deste protocolo em outros modelos de mamíferos está além do escopo deste texto. O leitor deve observar, no entanto, que a técnica de aplicação RWN oferece várias vantagens para estudar o ouvido interno de mamífero. Destes, o mais notável é que evita a interrupção direta da estrutura anatômica delicado e gradientes bioquímicos que existem dentro das paredes da cápsula ótica. Procedimentos como cocleostomia e implantação de bombas de infusão têm a propensão para violar diretamente estruturas da orelha interna levando a mudanças nos limiares permanentes; um facto que deve ser tido em consideração quando se analisam os resultados. O rompimento das estruturas da parede lateral da cóclea por meto invasivads podem também limitar o uso de agentes ototóxicos, como a furosemida ou heptanol, cujo específica zona de efeito é restrito para esse local. 15,24 abordagens não-invasivas alternativas, como a injeção trans-timpânica e injeção parenteral têm sido atormentado por resultados não confiáveis ​​e / ou toxicidade sistémica para o modelo animal. Este método de aplicação tem provado para evitar ambos estes deficiências, alcançando um nível de consistência aproximando-se dos métodos mais invasivas discutidas acima.

Outras vantagens desta técnica incluem é a sua ampla aplicabilidade para um número de modelos animais e viabilidade de incorporar em uma infra-estrutura existente de laboratório. Relativamente a este último, sem reagentes ou produtos químicos especializados são necessários para além dos agentes ototóxicos escolhidos, anestésicos e analgésicos. Agentes ototóxicos são tipicamente utilizados a uma concentração fixa e misturou-se num grande volume suficiente de solução (5 ml) para durar longos períodos de tempo consideraring cada aplicativo usa cerca de 10 ul (em ratos). Assim, após a aquisição inicial de fontes e instrumentos, os investigadores são relativamente livre de preparação morosa solução ou substituição frequente de materiais. Esta técnica também oferece reduções do tempo operatório, que pode ser significativo quando comparado com os processos que envolvem a implantação de bombas de infusão perilinfáticos ou cocleostomias. Ao atingir um nível de competência técnica, o tempo médio de conclusão da incisão inicial de fecho foi tipicamente de 20 minutos a 1,5 horas dependendo da duração de exposição desejada para o agente ototóxico. Três ou quatro cirurgias podem facilmente ser concluída em um único dia, permitindo uma maior eficiência e aumento do potencial para a obtenção de resultados bem sucedidos. Como descrito acima, esta técnica pode também ser facilmente aplicadas a uma variedade de modelos de roedores, incluindo ratinhos, ratos, cobaias e gerbos.

As limitações deste método são centradas namoderadamente íngreme curva de aprendizado necessária para dominá-lo e diminuiu os resultados esperados até proficiência técnica é atingido. Como será discutido em maior detalhe abaixo, pequenos erros durante o acesso cirúrgico ou insuficiente visualização do campo operatório, quase invariavelmente, levam a um resultado fraco. Achados sutis que um novato pode não reconhecer, como uma espessa bolha de ar bloqueando o acesso sub-milímetro do agente para a membrana da janela redonda ou fluido intersticial diluir o agente, ter tempo para apreciar e desenvolver as habilidades psicomotoras necessárias para corrigi-los. No entanto, com desempenho repetido do procedimento esses obstáculos são facilmente superadas e constituem um desafio técnico para os investigadores menos assustador do que alguns dos métodos invasivos acima mencionados. Finalmente, esta técnica está associada com a limitação relativa que a lesão coclear só pode ser induzida em um único ponto no tempo durante a exposição cirúrgica. Isto pode ser superado para um certo grau, Através do enchimento do RWN com esponja de gelatina absorvível embebido no agente como foi descrito por Heydt et al 10. A esponja de gelatina absorvível vai reabsorver ao longo do tempo, mas pode permitir um período de exposição mais longo do que é alcançável por meio de aplicação de uma solução aquosa sozinho.

Para que um investigador para perceber as vantagens desta técnica e evitar as armadilhas, é fundamental reconhecer os dois elementos críticos desta técnica: 1) a manter consistentemente visualização do espaço da orelha média e RWN; e 2) a capacidade de manter o campo cirúrgico livre de líquido e / ou sangue intersticial. Ao atingir o primeiro destes, a importância de um titular de cabeça adequada não pode ser mais enfatizado. Fixação segura da cabeça do animal garante uma visão estável sob o microscópio; a importância do que se torna facilmente evidente quando instrumentação subtil muda drasticamente o posicionamento das estruturas sob ampliação. Um bom htitular ead que pode girar em torno do eixo rostral-caudal do animal também facilita a mudanças dinâmicas importantes na linha do investigador do site. Muitas vezes, a alguns milímetros de rotação em torno deste eixo pode significar a diferença entre a visualização do RWN e visualização de somente o osso cápsula ótica. A capacidade de mudar constantemente vista também é fundamental para garantir fluido intersticial está devidamente removido das profundezas do nicho e também que o agente ototóxico é totalmente removido entre aplicações como discutido na Parte 5. Em nossa experiência, sangue, condensação, ou fluido intersticial que penetra no espaço do ouvido médio tem a capacidade de interferir com a experiência inteira. Isto não é surpreendente, já que a pequena quantidade de agente ototóxico aplicada à janela redonda (~ 10 l) pode facilmente ser diluído ao entrar em contato com o mesmo pequenos volumes de líquido estranho. Por esta razão, a dissecção cirúrgica meticulosa, destapar fragmentada da bula timpânica e preservat cuidadoion da artéria estapédico são equivalentes a uma resultados experimentais bem sucedidas.

Se as etapas críticas acima são observados e os resultados esperados ainda não são alcançados, solução de problemas deve começar. Em nossa experiência, muitas vezes é útil para executar variações de teste de dois elementos processuais. O primeiro é o de modificar a frequência com que o agente ototóxico é reabastecido na janela redonda. Dependendo do agente a ser utilizado, o tempo total de exposição é entre 30 minutos e 1 hora, com o que a absorção completa e subsequente substituição do agente a cada 10 min. Se expondo por períodos mais curtos, o aumento da exposição total pode permitir que o agente de mais tempo para se difundir através da membrana da janela redonda. A exposição adicional e reabastecedor também pode ajudar a evitar a diluição indesejada do agente ototóxico por sangue, condensação, ou intersticial, como discutido acima. O cuidado deve ser mantido ao utilizar esta abordagem, no entanto, uma vez que tende a aumentar o risco de inadvertidaly lesando a artéria estapediano e / ou introdução de fluido intersticial para o RWN.

Esta técnica é significativo em que ela oferece às investigações da fisiologia e fisiopatologia coclear. Esta técnica minimamente invasiva permite estudo detalhado dos processos bioquímicos delicado e tem sido equivalente em aprofundar nossa pesquisa teve como objetivo avaliar o potencial regenerativo coclear. 12,24 Essa abordagem cirúrgica e exposição também é reproduzido através de uma variedade de outras técnicas do ramo, e os resultados bem sucedidos utilizando este método têm sido relatados em estudos de implantação de células-tronco coclear. 14 Uma grande parte permanece desconhecido sobre a cóclea, no entanto, esta técnica, juntamente com o arsenal mais amplo disponível para pesquisadores, ajudará a estreitar essa lacuna de conhecimento.

Divulgações

Sem competindo interesses financeiros. Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Número da concessão: NIH P50DC00422 (HL); NIH R01DC12058 (H.L.). Este trabalho também se beneficiou do Prêmio de Ciências Clínicas e Translacionais da Instituição de Pesquisa Clínica e Translacional da Carolina do Sul (SCTR) (NIH / NCRR UL1RR029882). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e/ou análise. Os autores gostariam de agradecer a Lonnie E. Brown Jr. por suas contribuições artísticas e gráficas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-Heptanol 98%Sigma-AldrichH2805PubChem ID da substância 24895536
Ketaset Injetável Patterson Veterinary07-803-6637 Concentrado 100mg/ml
(Cetamina HCl)10 mlSubstância controlada
Analisada InjetávelLloyd LaboratoriesNADA# 139-236Concentrado 20mg/ml
Buprenex Injetável Patterson Veterinary07-850-2280 Concentrado 0,3 mg/ml
(Buprenorfina HCl)5 ampolas por caixaSubstância
Betadine Skin Prep SolutionMedlineMDS093941  1 Quart garrafa com tampa de rosca
0,9% EstérilSolução salina variávelPara misturar soluções e injeções
Microscópio CirúrgicoCarl Zeiss32192
Acústica Controlada Ambiente Cabine de SomIndustrial Acoustics Company
Suporte de Cabeça CirúrgicaFeito Sob Medida -  Por favor, veja a Figura 3
Retrator de Tecidos Moles do Pescoço da Universidade Médica da Carolina
(Espéculo de Arame, Titânio) 1,75 polegadaWorld Precision Instruments555801LEspalhamento máximo 20 mm
Embutido em massa descartável para fixar dinamicamente ao suporte
Broca Manual Acionada por Cinto Dental 90N Emesco Item
Cabo de Bisturi Tamanho 6Bard-ParkerMEDC-011990
#15c Lâmina de Bisturi Cirúrgico em Aço Inoxidável Bard-ParkerSKU: 097-721550 Lâminas/Caixa
Via ACE Código de Fornecimento
Ponta Reta Pinça de Joalheiro Tesoura deMIL17304
CurvadaMedlineDYND04026 
Iris Scissors StraightMedlineDYND04025 
Tesoura de Tenotomia Stevens RetaMedlineMDG3222111  < / a>
Rosen Agulha de orelha Eixo reto, ponta levemente curvadaMytaMedItem # 6.56.00A Figura 1 demonstra palhetas de eixo angular. Este foi posteriormente substituído pelas palhetas Rosen
Rosen Agulha de Orelha Eixo Reto, Ponta Fortemente CurvadaMytaMedItem# 6.56.01
Limpadores de Tarefas Delicadas Kimwipes Kimtech ScienceCODE 34155 Branco, Tamanho 4.4x8.4 Polegadas. Corte em triângulos e enrolado em mechas de ponta fina.
Cureta de Orelha House, haste de 6", ângulo de luzMedlineMDG0396486 
Gelfoam (esponja de gelatina absorvível) Tamanho 100MedlineIIS34201  Substituições podem ser feitas
Pellets de algodão #3 4 mmRichmondCódigo do Fabricante 100108
Unidade EletroCirúrgica 100 E M/MElmedLista No. 52-5770Bipolar e Monopolar Capaz
1cc U-100 Seringa de Insulina 28G, agulha de 0,5" de comprimentoBDNúmero do Produto: 329410Opcional para entrega de agente ototóxico
23G, ponta romba, 1" agulha de comprimentoKendallCódigo do Produto 8881202397Para entrega controlada de agente ototóxico com menor risco de danificar a artéria estapedial
Máscara CirúrgicaU-lineS-10478
Luvas Cirúrgicas de Nitrilo de Grau de ExameU-lineS-12549
Máquina de Cortar Cabelo de PrecisãoWahlVários modelos podem ser substituídos
5-0 Sutura de monofilamento preto de nylon em PC-1  Agulha circular 3/8 de 13 mmEthilon1855GPodem ser feitas substituições. 
Bolsa de Esterilização de Selagem InstantâneaFisher01-812054
Esterilizador a SecoROBOZGerminador TM 500
Schedule CIIIcontrolada Schedule CIIIdo Sulda cabeçaVintageCirúrgico Íris Bernell

Referências

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