Artigo de método

Utilizando Análise de confocal

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 de dezembro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

Neste artigo

Resumo

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O manuscrito aqui fornece um simples conjunto de métodos que permitam analisar a secreção e difusão de ligantes marcados fluorescentes em Xenopus. Isto proporciona um contexto para testar a capacidade de outras proteínas para modificar a distribuição de ligando e permitindo experiências que podem dar uma visão sobre os mecanismos que regulam a gradientes de morfogénio.

Resumo

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Este protocolo descreve um método para visualizar ligandos distribuídos através de um campo de células. A facilidade de expressão de proteínas exógenas, juntamente com o grande tamanho das suas células em embriões precoces, Xenopus laevis fazer um modelo útil para a visualização de ligandos GFP. MRNAs sintéticos são traduzidos eficientemente após a injecção em embriões de Xenopus fase inicial, e as injecções podem ser destinados a uma única célula. Quando combinado com um marcador de linhagem, tais como membrana tethered RFP, a célula injectada (e seus descendentes) que estão a produzir a proteína sobre-expressa pode ser facilmente seguido. Este protocolo descreve um método para a produção de fluorescente etiquetado Wnt e Shh ligandos a partir de ARNm injectado. Os métodos envolvem a miCro dissecção de explantes ectodérmicos (CAPS animais) e a análise de difusão de ligando em amostras múltiplas. Utilizando imagiologia confocal, as informações sobre a secreção de ligando e de difusão sobre um campo de células pode ser obtida. As análises estatísticas de imagens confocal fornecer dados quantitativos sobre a forma de gradientes ligando. Estes métodos podem ser úteis para pesquisadores que queiram testar os efeitos dos fatores que podem regular a forma de gradientes de morfogénio.

Introdução

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Durante o desenvolvimento embrionário inicial, as células são progressivamente comprometida a seguir linhagens específicas de diferenciação: isto significa um grupo de totipotente (ou pluripotentes) as células tornam-se progressivamente limitado ao estabelecimento de populações de células progenitoras determinados para dar origem a um tipo de célula. Sinalização célula-célula é central para a regulação da especificação das linhagens durante o desenvolvimento embrionário. A manipulação destes sinais serão necessários para dirigir células estaminais em relação a determinados destinos para suportar novos tratamentos médicos.

Um número relativamente pequeno de vias de sinalização são reiterados durante o desenvolvimento, incluindo as vias de resposta à superfamília TGF (nodals e BMPs) 1-2, 3 FGFs, Wnts 4, 5 e ouriços. Estas proteínas segregadas se ligam a receptores presentes na membrana celular para activar a transdução de sinal alterando desse modo a expressão do gene e / ou o comportamento das células. A regulação apertada de sinal de celularAlling é essencial para a especificação das linhagens de células e desenvolvimento normais. Enquanto a conversa cruzada entre estas vias é importante na determinação do destino celular, um único ligante pode-se desencadear respostas diferentes em diferentes concentrações. Gradientes de morfogénios foram descritos mais de 100 anos atrás, como uma teoria para explicar como os diferentes tipos de células pode derivar de um campo de células 6. Sinalização moléculas produzidas por um grupo de células pode difundir-se ao longo de um determinado intervalo, diminuição da concentração com uma maior distância a partir da origem. As células expostas ao sinal irá responder à concentração local na sua posição no campo de células, com as células nas posições distintas de responder de forma diferente a diferentes níveis do sinal. A evidência para a existência de morfogénios vem de estudos de Drosophila embrião precoce 7 e o disco de asa 8, bem como o membro de um vertebrado 9 e 10 do tubo neural.

Métodos são necessários noterrogam como gradientes morfogénio são estabelecidos e para identificar outras moléculas importantes na regulação desses gradientes. Experimentos elegantes usando imuno-histoquímica para visualizar as proteínas endógenas in vivo no contexto de diferentes origens genéticas têm sido utilizados para investigar gradientes de morfogénio 11-12. No entanto, bons anticorpos e mutantes específicos nem sempre estão disponíveis, assim que nós descrevemos aqui um protocolo com a sobre-expressão de ligantes fluorescentes em Xenopus, para fornecer uma alternativa, método simples para dissecar como produtos de genes exógenos podem influenciar a distribuição de ligantes através de um campo de células. Xenopus laevis fornece um excelente sistema para realizar estes tipos de experimentos como os seus embriões se desenvolvem externamente para que eles sejam acessíveis nas fases iniciais. O seu grande tamanho (1-1.5mm de diâmetro) simplifica a microinjeção e manipulação cirúrgica e por blastula encena as células são fáceis de imagem como eles ainda são relativamente grande (cerca de 2081; m de diâmetro). Estudos sobre-expressão em Xenopus são simples de fazer: mRNA injetadas no embrião podem ser direcionados para determinadas células e eficiente é traduzido.

As construções Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente marcados foram gerados usando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 e eGFP. O péptido HA é importante incluir, não só para proporcionar uma marca molecular adicional, mas também porque é pensado para agir como um espaçador que separa as proteínas Wnt e eGFP permitindo que ambos os produtos dos genes para funcionar. A construção utilizada para a visualização de Shh foi anteriormente usado para gerar um ratinho transgénico que expressa uma proteína de fusão de Shh-eGFP 15; este foi gentilmente cedido por Andy McMahon. Importante, a etiqueta de GFP para todas as construções é clonada a 3 'da sequência de sinal de tal modo que é mantida após o processamento. Também é essencial para assegurar que a proteína final inclui sequências necessárias para tais modificações, o addition de lipídios como é o caso de Shh e Wnt ligands.The cDNAs foram subclonados no vector pCS2 + expressão que é otimizada para a Produção de mRNA sintético; que inclui um promotor de SP6 e sinal de poliadenilação (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

O trabalho descrito aqui fornece um protocolo simples para comparar a secreção e difusão de fluorescente etiquetado Wnt e Shh marcado ligantes. Ao injectar quantidades definidas de ARNm sintético, o protocolo circumnavigates quaisquer problemas associados com a expressão variável de diferentes vectores, utilizando diferentes promotores. Estes métodos foram recentemente aplicado para investigar os efeitos do sulfato de heparano Sulf1 endosulfatase em Shh-eGFP e Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP e secreção de difusão em Xenopus 16-17.

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Protocolo

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Ética declaração: Experimentos em animais foram realizados sob uma licença do escritório UK Home ao eurodeputado e os experimentos realizados foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de York, em conformidade com o CHEGADA (Animal Research: Relatório de experimentos in vivo) orientações. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Estratégia para gerar fluorescente etiquetado Ligands

Abaixo está um exemplo de protocolo para subclonagem Wnt8a-HA e eGFP em pCS2, a fim de produzir a construção de fusão no quadro Wnta-HA-EGFP:

  1. Criar e gerir reacções de PCR para Wnt8a-HA e eGFP. Utilizar a informação exibida iniciador em condições Quadro1 e a reacção de PCR e Exemplo Exemplo de PCR apresentados na Tabela 2. Nota: ADN molde irá variar dependendo da construção a ser produzido, neste exemplo, Wnt8a-HA é utilizado como ADN molde.
  2. Limpe reações de PCR usando um kit de extracção de gel, execute eluição final em 30μl de água de grau molecular.
  3. Entrada 2 jil de produto de PCR num gel de agarose a 1% preparado em TAE.
  4. Produtos de PCR eGFP Digest Wnt8a-HA e pCS2 e usando as enzimas de restrição apropriados (ver Tabela 1), configurado de reacções tal como descrito na Tabela 2 (Exemplo produto de PCR digerido).
  5. Incubar as reacções durante 3 horas a 37 ° C e, em seguida, armazenar produtos Wnt8a-HA e GFP PCR em gelo.
  6. Adicionar 1 ul de fosfatase intestinal de vitelo alcalina (CAIP) para pCS2 Digest e incubar durante 6 minutos a 37 ° C.
  7. CAIP inactivar pelo calor por incubação durante 15 min a 65 ° C.
  8. Run pCS2 e digere PCR num gel de agarose ultrapura a 1% preparada em TAE.
  9. Extracto de gel e limpar produtos pCS2 e PCR usando um kit de extracção de gel, execute eluição final em 30 ul de água de grau molecular.
  10. Defina-se a ligação tal como descrito na Tabela 2 (Exemplo de T4 ligadura) e incubar a 12 ° C durante 16 horas.

2. mRNA Síntese: Gerando o Template

  1. Produção de modelos usando a digestão com enzimas de restrição dos plasmídeos seguintes (todas no vector de expressão pCS2): membrana-Cerúlea (memCerulean), membrana-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Configure restrição digere como descrito na Tabela 2 (modelo Exemplo digerir).
    2. Misturar suavemente e incuba-se as reacções durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Executar 2,5 ul de plasmídeo digerido num gel de agarose a 1% (TAE) para verificar que a reacção foi cortado totalmente.
  3. Limpar as digestões utilizando um kit de extracção de gel, eluição final realizar em 50 ul de água de grau molecular.

3. Síntese de ARNm: Transcrição in vitro

  1. Sintetizar mRNA funcionais usando o kit de transcrição SP6 mRNA. Monte as reações em 1,5 ml DNAse / RNAse microtubos livre.
  2. Defina-se reacções de transcrição de ARNm tal como descrito na Tabela 2 (Exemplo de síntese de ARNm).
  3. Misturar oreacções suavemente com uma pipeta e, em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 4 h.
  4. Entrada 1 uL da reacção num gel de agarose a 2% (TAE).
  5. Adicionar 1 ml de ADNase para a reacção, misturar suavemente com um P20 e incubar a mistura reaccional durante mais 15 min a 37 ° C.
  6. Adicionar 340 uL de água de grau molecular, 40 ul de acetato de amónio e 400 ul de fenol-clorofórmio para a reacção. Vortex as reacções durante 30 segundos.
  7. Girar o ARNm durante 5 min, 14.000 xg, a 4 ° C.
  8. Pipetar a camada superior (aquosa) a partir de cada reacção de movê-lo para um novo tubo de 1.5 ml de tampão do parafuso de microcentrífuga.
  9. Adicionar um volume igual de clorofórmio para cada uma das reacções foi decantado. Agitar as amostras durante 30 segundos.
  10. Girar o ARNm durante 5 min, 14.000 xg, 4 ° C
  11. Pipeta a camada aquosa superior de cada reacção movê-lo para um novo 1,5 ml com tampa de rosca tubo de microcentrífuga.
  12. Adicionar um volume igual de isopropanol para cada uma das reacções e precipitar o mRNA-se a -80 ° C durante 30 min.
  13. Girar cada uma das reacções durante 15 min a 14.000 xg, a 4 ° C para sedimentar o ARNm
  14. Remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o mRNA peletizada
  15. Adicionar 200 ul de etanol a 70% para cada uma das reacções, misturar as reacções e depois girar durante 10 min a 14000 xg, 4 ° C.
  16. Remover o etanol, tendo cuidado para não perturbar o ARNm, secar o sedimento à temperatura ambiente utilizando um exsicador de vácuo ou Speed-Vac.
  17. Re-suspender o ARNm em 10-20 ul de água de grau molecular. Girar rapidamente e manter as amostras em gelo. Nota: O aquecimento da amostra a 80 ° C durante 1 min pode ajudar a dissolver-se.
  18. Corra 1 ul de ARNm sobre um gel de agarose a 2% (TAE) e 1,2 ul analisar num espectrofotómetro para obter uma leitura precisa da concentração.
    Passo crítico: Uma concentração de 400 ng / mL de ARNm sintético é necessário para levar a cabo as seguintes experiências.
    Passo crítico: Se o rácio 260/280 éfora da gama de 2,00-2,20, ou a quantidade total de ARNm excede 12 ug, efectuar uma precipitação com cloreto de lítio.
  19. Loja ARNm em alíquotas de 1 ul a -80 ° C. Use alíquotas e, em seguida, jogar fora; não voltar a congelar mRNA.

4. Gerando Xenopus laevis Embriões

  1. Primeiro Xenopus laevis fêmeas por injecção subcutânea com 50 unidades de hormona gonadotropina coriónica humana (HCG); Chorulon uma semana antes da experiência.
  2. Induzir Xenopus laevis fêmeas a noite antes do ensaio por injecção de 250 unidades de hCG e incubando-as no escuro, O / N a 19 ° C.
  3. Dissecar testículos de rã macho eutanasiados e armazenar em 1xNAM a 4 ° C. Nota: rã masculina é eutanasiado pela anestesia do terminal, conforme Cronograma 1 de Animais (Scientific Procedures) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Massagem fêmea Xenopus laevis para induzir a ovulação, recolher o laovos id em um 55 mm de diâmetro petri prato redondo.
  5. Produzir uma suspensão de esperma por esmagamento ¼ de testículo Xenopus laevis em 1 ml de água desionizada.
  6. Escova de Xenopus oócitos com a suspensão de esperma esmagado usando uma pipeta de Pasteur e pipeta bulbo passo crítico:. Realizar as reacções de fertilização em aproximadamente 4:30 horas do dia da experiência.
  7. Embriões de cultura a 21 ° C em NAM / 10 (ver Tabela 3) para soluções em placas de petri de 55 mm revestidas com agarose a 1% diluído em água (na água).
  8. De embriões-geléia após 45 min, utilizando cisteína / HCl (Tabela 3). Nota: a 21 ° C, os embriões vai chegar à fase 2 de células após 90 min e clivar a cada 20 minutos depois disso.

5. microinjecting Xenopus embriões

  1. Usando 1 x 90mm capilares de vidro e uma Narishige PC-10 dual-fase micropipeta de vidro extrator, puxe micropipetas para injectáveis. Ajustar as configurações empiricamente para atingir uma ponta fina (Diame menos de um mícronter).
  2. Anexar uma micropipeta (agulha) para um microinjector de gás (por exemplo, o Harvard Appartaus PLI-100 PICO-injectores) para fornecer repetidamente volumes precisos de líquido por aplicação de uma pressão regulada por um período definido de tempo digital. Ajustar a pressão pneumática para entregar um volume de 1,25 a 10 nanolitres como determinado utilizando um retículo de calibração ou de slides.
  3. Bata de uma placa de Petri 55 mm com 5 ml de agarose a 1% (água). Corte um quadrado 35-35 mm de agarose para fora do prato, isso vai proporcionar uma superfície estável para microinject embriões.
  4. Transferência de embriões em NAM / 3 + Ficoll (Tabela 3) e se mudam para injeção prato.
  5. Injectar embriões no hemisfério animais uma vez que atingem o estágio obrigatório para o experimento.
    1. Para analisar a distribuição de ligandos GFP marcadas na superfície da célula, injectar os embriões bi-lateralmente no estágio de duas células, NL10 por célula. Exemplo diluições de ARNm mostrados abaixo para Wnt8a-HA-eGFP. Passo crítico: Certifique-se de que todas as concentrações de mRNA starte em 400 ng / mL.
      Nota: A quantidade de mRNA a ser injectado tem de ser determinada empiricamente testando concentrações e encontrar a quantidade mínima necessária para visualizar o ligando fluorescente. Western blotting utilizando um anticorpo anti-HA é um passo essencial para determinar que os mRNAs são convertidos para níveis semelhantes, a fim de permitir a comparação dos dois ligandos marcados por fluorescência diferentes; temos feito isso por Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP em Fellgett et al., 2015.
      Nota: Para avaliar o efeito de um injectado ARNm (tal como uma que codifica para um regulador candidato), um controlo típico é para injectar um ARN não-activa, tais como lacZ em embriões de irmãos, a fim de controlar em relação aos efeitos da adicional transcrições no embrião.
      1. Diluir memRFP ARNm 1 em 4 (1 ul + 3 uL de dH2O) com água de grau molecular para reduzir a concentração de 100 ng / ul.
      2. Diluir Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1 em 4 (1 ul + 3 uL dH2 O) com água de grau molecular para reduzir a concentração de 100 ng / ul.
      3. Misturar memRFP ARNm numa proporção de 1: 1 com Wnt8a-HA-eGFP ARNm.
      4. Misture a partir de ARNm 5.5.1.3 numa proporção de 1: 1 ou com o controlo LacZ ARNm ou um modulador, por exemplo Sulf1.
      5. Injectar bilateralmente embriões na fase de 2 células com NL10 de mRNA por célula (total de 20nl). Nota: Isto resulta em 250 pg de m em RFP, 250 pg de Wnt8a-HA e GFP, 500 pg de Wnt11b-HA e GFP e 2 ng de LacZ ou Sulf1 mRNA a ser injetado em cada célula.
    2. Para analisar a difusão de GFP ligandos etiquetados, para injectar mRNA que codifica ligando-GFP em conjunto com um marcador de linhagem, tais como memRFP na fase 16-32 celular, 1,25 nl por célula.
    3. Para analisar os efeitos de qualquer modulador potencial de difusão ligando, co-injectar-se ARNm que codifica para o modulador em conjunto com o ligante e linhagem traçador. Alternativamente, injectar células vizinhas: um com o ARNm que codificam para GFP-ligan Taggedd e um marcador de linhagem (memRFP) e o outro com os mRNAs que codificam para o modulador e um marcador de linhagem diferente (memCerulean).
  6. Embriões de transferência para um 12,5 ° C incubadora e cultura até o dia seguinte, Nieuwkoop e Faber (NF) etapa 8.

6. excisão Animais Cap explantes

  1. Embriões transferência para um 55 mm placas de Petri revestidas com 5 ml de agarose a 1% (água). Encha o prato com NAM / 2 (Tabela 3).
  2. Tome tampas de animais circulares usando agulhas de tungstênio passo crítico:. Tomar grandes capitalizações nesta fase como estes irão curar melhor e ser mais fácil de imagem, mantenha tampas de controlo para garantir que não ocorre extensão convergente.
  3. Transferir explantes animais para placas de petri de 55 mm revestidas com agarose a 1% (água) e os embriões de cultura a 21 ° C durante 4 h passo crítico:. A incubação de 4 horas é necessário para permitir que as proteínas fluorescentes para amadurecer.
  4. Gerar lâminas de alívio por degola para baixo duas camadas de isolamento de PVCfita N sobre lâminas de microscópio. Cortar uma de 14 mm por 10 mm para fora do rectângulo fita para deixar uma câmara para a montagem de tampões de animais passo crítico:. Nivelar ambas as camadas de fita completamente sobre a lâmina antes de cortar o rectângulo.
  5. Pipetar 2 gotas separadas de NAM / 2 (Tabela 3) em relevo, a corrediça aproximadamente 30 ul por gota.
  6. Transferir explantes animais para as lâminas de relevo utilizando uma ponta de P20 cortado e orientação de modo a que o lado apical fique virado para cima. Nota: Cada slide pode conter 10-15 tampas de animais passo crítico:. Nesta fase, as tampas de animais deveria ter parcialmente curado, isso significa que eles são menos delicado e pode ser orientada usando uma pinça.
  7. Cuidadosamente, baixe uma lamela de vidro sobre a lâmina de alívio e permitir que a lâmina de cobertura para secar por 20 min passo crítico: O tamanho da tampa animal é crucial;. garantir a tampa é grande o suficiente que, quando a lamela de vidro é reduzido para o slide alívio que comprime a camada apical de células cap animais suficientes para produce uma superfície plana para a imagem. Ainda se as tampas de animais são muito pequenos, em seguida, reduzir a fita de PVC para uma camada.
  8. Selar o slide usando esmalte de unha passo crítico:. Não use muito verniz para selar as lâminas de alívio, porque se a fita de PVC torna-se muito úmido que irá aumentar se e estragar o slide.
  9. Lâminas relevo seco durante 20 minutos no escuro e eles estão prontos para a imagem, tipicamente tampas de animais vai permanecer saudáveis ​​por 4-6 horas uma vez selado no slide.

7. Criação de Imagens

Nota: A visualização foi realizada utilizando um microscópio confocal invertido. Modo Lambda foi escolhido para a imagem latente como isso permitiu vários fluoróforos com sobreposição de assinaturas a serem utilizados, e removido o problema de potencial movimento amostra entre as varreduras.

  1. Encontre explantes utilizando uma objectiva de baixa ampliação, em seguida, mudar para 63x / 1.4 objetivo de óleo para maior resolução de imagem.
  2. Ligue lasers necessários; Para este exemplo o 405do laser foi utilizado para excitar memCerulean, o laser 488 foi utilizado para excitar GFP e o laser 561 para excitar memRFP usando 405 e 488/561 espelhos dicróicos.
  3. Use o modo lambda (Zen Em 2011, selecione o modo de lambda - 32 escaninhos).
  4. Selecione a 405nm, 488nm e 561nm lasers.To permitir um campo de visão mais amplo, zoom out a imagem (para 0,6x).
  5. Defina o tamanho do quadro para o tamanho desejado da imagem (1024 x 1024 com tamanhos de pixel de 220 nm foi utilizada para este conjunto de dados).
  6. Definir média tipicamente de 4 a 8 para aumentar o sinal para relação de ruído.
  7. Optimizar a (unidade 1 arejado de acordo com o laser 561nm foi usada para este conjunto de dados) do furo de pino.
  8. Optimizar os poderes de laser passo crítico:. Equilibrar as 405nm, 488nm e 561nm lasers tais que todos os fluoróforos podem ser detectadas usando a matriz de 32 detector, minimizando a quantidade de tensão e ganho necessário.
  9. Recolher o ser de luz emitida a partir memCerulean, GFP e memRFP. Por esta luz de trabalho foram coletados a cada ~10nm de 415-720nm, embora intervalos de recolha também são possíveis maiores (por ex., Cada ~ 20 nm).

Análise 8. Imagem

  1. Investigar os efeitos dos moduladores sobre a expressão da superfície celular de ligandos GFP
    NOTA: Os passos seguintes são um guia detalhado de como a análise foi realizada em nosso laboratório. O usuário final pode querer simplificar o processo de escrever um roteiro ou ImageJ FIJI para remover algumas das etapas manuais.
    Passo crítico: É importante as amostras ao utilizador final a espectros de quaisquer fluoróforos utilizados nas mesmas condições que a experiência final é realizado a fim de perf ORM a separação espectral eficaz dos vários fluoróforos utilizados na experiência final.
    Existem dois tipos principais de análise são realizados nesta seção:
    1. O cálculo do número total de Wnt-HA-eGFP pixels de co-localizáveis ​​com a membrana celular.
      1. Unmix o verde,canais vermelho e azul-celeste, usando espectros amostrados de injeções únicas destes fluoróforos em software ZEN. Guarde estas imagens como documentos LSM separadas para usar em todas as etapas a seguir.
      2. Abrir LSM arquivos diretamente no software de edição de imagem. Nota: As seguintes instruções são para FIJI Imagem J.
      3. Salve as imagens LSM como documentos de sequência de imagem, que irá dividir automaticamente as imagens nos canais separados.
      4. Salve a seqüência de imagens para a mesma pasta como os scripts para o software de análise de script que serão utilizados para analisar os dados (ver arquivos de código suplementares para script real). Nota: As seguintes instruções são para Matlab.
      5. Abra o software de análise de script e abrir o diretório no qual os scripts são escritos.
      6. Digite o nome do arquivo em análise Location, o software terá o nome do arquivo e realizar a análise.
        Nota: Os nomes de arquivos irá ler ImageA0000 e ImageA0001 para cada image. O software de análise de script vai utilizar a imagem marcada 0001 como a máscara e analisar a percentagem de pixels na imagem 0000 que co-localizar com essa máscara.
      7. Tome o número percentual de co-localização (anotada como membrana celular povoada) e copie este para uma planilha. Nota: As seguintes instruções são para o Excel.
      8. Traçar o número percentual de co-localização em um gráfico de barras ou como um valor absoluto ou relativo.
    2. Analisando o número, tamanho e forma de Wnt-HA-eGFP pontos lacrimais.
      1. Abrir LSM não misturados arquivos diretamente no software de edição de imagem. Nota: as seguintes instruções são para FIJI Imagem J.
      2. Dividir cada imagem em seus canais separados (Image> Cor> canais Split).
      3. Threshold tanto a Wnt-HA-eGFP e os canais de marcador de membrana (Image> Adjust> Auto-threshold) ETAPA CRÍTICA:. Tente um número de limiares para ver qual deles produz uma imagem representativa, sem superexposiçãoo canal.
      4. Converter o canal de marcador de membrana para uma máscara (Processo> binário> Faça máscara).
      5. Inverter esta máscara (Edit> Invert).
      6. Converter os pontos lacrimais Wnt-HA-eGFP a uma máscara, como acima.
      7. Subtraia a máscara marcador membrana da máscara ligando-GFP (Processo> calculadora Imagem> Wnt máscara na caixa superior, máscara membrana na caixa em baixo).
      8. Use a função de analisar partículas. A partir daqui, selecionar os parâmetros necessários e analisar os dados (partículas Analyse> Analisar).
      9. Copiar o número de partículas de tamanho médio de partícula, e os dados de circularidade para uma folha de cálculo e, em seguida, traçar gráficos a partir destes dados. Nota: Para esta análise, apenas partículas entre 0.1-10μm 2 tamanho foram analisados, não foram impostas restrições sobre a partícula circularidade. Esta instrução é para Excel.
  2. Analisando o intervalo de difusão ligando
    1. Abra todas as imagens não misturados em confocal imenvelhecimento de software e, em seguida, exportar os arquivos em um formato TIF, como dados brutos e como uma imagem RGB Nota:.. Esta instrução é para Zen Lite 2.011 passo crítico: Incluir uma barra de escala em pelo menos uma das imagens de modo que a distância pode ser calculado durante a análise.
    2. Abra as imagens a serem analisadas em software de análise de imagem. Nota: As seguintes instruções são para o Photoshop 8.2.3), clique com o botão direito no plano de fundo da imagem e selecione "camada de fundo ', para criar uma nova camada..
    3. Definir os canais de marcador de membrana para 0, de modo que apenas o canal ligando-GFP é visível (Layer> camada de ajuste Nova> misturador Channel) passo crítico:. Prenda a nova camada de ajuste para a imagem que está sendo analisado, a opção para o clipe de nova camada a esta imagem está disponível como uma caixa de seleção depois de clicar na opção de canal misturador.
    4. Abra um novo espaço de trabalho. Defina a resolução de 300 pixels por polegada e o modo de cor RGB de cor (File>Novo> Clipboard).
    5. Copia todas as imagens que está sendo analisado no único espaço de trabalho (Clique na imagem e é cortada misturador de canais, mantendo o controle em seguida, mantenha o controle e Alt e arraste a imagem para a área de trabalho).
    6. Orientação de todas as imagens, de modo que o comprimento máximo de difusão para cada imagem pode ser medida ao longo do eixo horizontal, com as células que expressam Wnt-HA-eGFP orientada para a esquerda.
    7. Salve o espaço de trabalho como um TIF e, em seguida, abrir este no software de análise de imagem. Nota: As seguintes instruções são para FIJI Imagem J.
    8. Abra a janela do gerenciador de ROI (Analisar> Ferramentas> Gerenciador de ROI).
    9. Desenhe um retângulo na primeira imagem, o tamanho exato do retângulo pode ser especificado (ferramenta Selecionar retângulo e desenhar qualquer retângulo> Editar> Seleção> Especifique). Nota: um tamanho de 650 x 100 pixels comprimento x largura foi utilizado neste estudo.
    10. Posicione o retângulo na extremidade do domínio expressar Wnt-HA-eGFP. Coloque o retângulo sobre a região com a distância máxima de Wnt-HA-eGFP difusão. Passo crítico: Mesmo sem o marcador de membrana das regiões que expressam Wnt-HA e GFP deve ser visível devido a fluorescência de fundo; se não, então consultar imagens raw.
    11. Deslocar a caixa de 10 � para a direita. Determinar o número de micrómetros, medindo o comprimento da barra de escala incluídos em uma das imagens (Desenhar uma linha traçando a barra de escala> Analyse> definir a escala). Nota: Isto fornece um valor para 10 uM em pixels.
    12. Adicionar a caixa para o gerente ROI pressionando o botão Adicionar na janela do gerenciador de ROI.
    13. Mover retângulo para a próxima imagem a ser medido, clicando novamente na ferramenta retângulo para mover o retângulo. Repita os passos 8.2.10-11.
    14. Uma vez que todos os painéis foram medidos, selecione multiplot no menu gerente ROI (ROI manager> Mais> multiplot> List).
      Nota: os dados representam Wnt pixels intensity (Y) com o aumento da distância ao longo do eixo horizontal (X, medida em pixels). O valor de Y é a intensidade média do sinal de ligando-GFP no ponto X e a média é calculada a partir de todos os pixels no eixo Y para cada valor de X. Consequentemente, o mais alto da caixa, quanto mais pixels serão analisados ​​para produzir esta média. Uma pequena caixa (no eixo Y) será mais ruidoso; uma caixa de altura terá muito baixa intensidade média pixel.
    15. Copie os dados da caixa de multiplot em uma planilha e re-label em conformidade. Nota: As seguintes instruções são para o Excel.
    16. Rejeitar os primeiros 10-20μm de dados a partir de cada análise como esta representa a fluorescência de fundo das células que expressam ligando-GFP e distorce os gráficos.
    17. Abra-se a análise gráfica e software científico e criar um novo notebook. Nota: As seguintes instruções são para SigmaPlot 13.
    18. Rotular o número necessário de colunas para os dados clicando duas vezes sobre os números horizontais on planilha e rotulando-os a distância em um, Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Copiar os dados da folha de cálculo para as colunas relevantes na análise de gráficos e software científico.
    20. Criar um gráfico de dispersão (Criar gráfico> Scatter> dispersão múltipla> Select X muitos Y> Selecione a coluna distância para X> Select Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP para os valores Y> Finish).
    21. Realizar análise de regressão em curva Wnt8a-HA-eGFP pela esquerda clicando em um ponto Wnt8a-HA-eGFP no gráfico de dispersão. Todos os pontos devem destacar. Clique em Análise> assistente de regressão.
    22. Selecione a categoria equação da curva (decaimento exponencial) eo nome da equação (Single, 3 parâmetro) em seguida, pressione próximo.
    23. Selecione os valores X e Y para que a curva deve ser montadas (se os dados foi destacado anteriormente, isso deve ser feito automaticamente), em seguida, pressione próximo.
    24. Continue através do assistente até que a opção de saída numéricos página, garantir "Criar relatório" está marcada, em seguida, pressione próximo. Nota: Os parâmetros para a curva ajustada será mostrado no relatório 1 *.
    25. Na página de opções Gráfico garantir "adicionar à equação título do gráfico 'está marcada, em seguida, pressione acabamento. Nota: O assistente terá criado Relatório 1 * e Gráfico 1 * abas no topo do livro de nota. Além disso, a curva terá sido adicionada ao gráfico produzido em (8.2.20).
    26. Repita os passos 8.2.21-8.2.25 para caber uma curva para Wnt11b-HA-eGFP passo crítico:. Tentar montagem de equações múltiplas categorias e nomes de equações aos dados. Nota: A curva com o melhor ajuste deve produzir o valor mais alto R2 com a menor soma residual dos quadrados.

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Resultados

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Análise confocal de explantes cap animais expressando proteínas por fluorescência com a tag fornece um sistema eficaz para a visualização de distribuição ligando em diferentes condições experimentais. Num exemplo, a distribuição de GFP com etiquetas Shh é mostrado (Figura 1). Na fase de 2 células, embriões de Xenopus são injectados no ambas as células quer com um mRNA com controlo ou com o ARNm que codifica para Sulf1, uma enzima que modifica o sulfato de heparano na superfície celular e influe...

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Discussão

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Uma parte essencial do presente protocolo é a geração de ligandos biologicamente activos que são normalmente processados, segregadas, e capazes de eliciar uma resposta na célula receptora, apesar de ter uma porção fluorescente ligada. É crítico para estabelecer que o produto do gene marcado fluorescentemente é biologicamente activo utilizando um ensaio apropriado. Para Shh-GFP, a capacidade de activar a expressão de PTC1 16 foi confirmada. Wnt8a tem uma capacidade extremamente potente para induzir um...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por uma BBSRC conceder ao eurodeputado (BB / H010297 / 1), um BBSRC quota studentship a SAR, e uma bolsa de estudo MRC para SWF.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AgaroseMelfordMB 1200
Acetato de amônioAmbionDe Megascript SP6 Kit AM 1330
BicarbonatoVWR InternationalRC-091
Nitrato de cálcioSigmaC13961
Cap analog (m7G(5'))AppliedBiosystemsAM 8050
ClorofórmioSigmaC 2432
Cloridrato de L-cisteína monohidratadoSigmaC7880
dNTPsInvitrogen18427-013
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)SigmaO3690
EtanolVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J softwareDownload gratuito http://fiji.sc/Fiji
GentamycinMelfordG 0124
Ácido acético glacialFisher ScientificA / 0400 / PB17
Lamínulas de vidro, No.1.5 Suprimentos de Laboratório Científico22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Extrator de agulhas de vidroNarishigeNarishige PC -10
Agulhas de tração de vidroDrummond Scientific3-000-203-G/X
Gonadotrofina crônica humana (HCG)Intervet
IsopropanolFisher ScientificP/7500/PB17
Cloreto de lítio (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 e Software Zen (2008-2010)Software Carl Zeiss
MatlabMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Água de grau molecular Fisher ScientificBP 2819-10
 BotasCódigo de barras 3600530 373048
EspectrofotômetroLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Placa de Petri (55 mm)VWR International391-0865
Fenol-clorofórmioSigmaP3803
Software PhotoshopAdobehttp://www.photoshop.com/products
DNA polimerase de alta fidelidade e buffers BiolabsM0530S  Tampão - M0531S
Cloreto de potássio (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
Fita de isolamento de PVCOnecallSH5006MPK
Kit de extração de gel QiagenS28704
Enzimas de restrição tampõesRocheSuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001
DNAse livre de RNAsePromegaME10A
Lâminas de borda única traseira de açoPersonna66-0403-0000
Cloreto de sódio (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 kit de transcriçãoAmbionAM1330
Lâminas de vidroThermo FisherSHE 2505
Tris baseInvitrogen15504-020
tungstêniocaseiro
Zen lite softwareCarl ZeissDownload grátis  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html
Verniz para unhas Agulhas de

Referências

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