Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para a criação de um cromossomo artificial bacteriano infeccioso contendo um cDNA de comprimento total do RNA genômico de fita positiva do vírus da encefalite japonesa. Este protocolo pode ser usado para construir um cDNA funcional de outros vírus de RNA de fita positiva, tornando-o uma poderosa ferramenta genômica para estudar a biologia do vírus.

Resumo

A genética reversa, uma abordagem para resgatar vírus infecciosos inteiramente de um cDNA clonado, revolucionou o campo dos vírus de RNA de fita positiva, cujos genomas têm a mesma polaridade do mRNA celular. O sistema de genética reversa baseado em cDNA é um método seminal que permite a manipulação direta do RNA genômico viral, gerando vírus recombinantes para estudos moleculares e genéticos de elementos de RNA viral e produtos gênicos na replicação e patogênese viral. Ele também fornece uma plataforma valiosa que permite o desenvolvimento de vacinas geneticamente definidas e vetores virais para a entrega de genes estranhos. Para muitos vírus de RNA de fita positiva, como o vírus da encefalite japonesa (JEV), no entanto, os cDNAs clonados são instáveis, representando um grande obstáculo para a construção e propagação do cDNA funcional. Aqui, o presente relatório descreve as considerações estratégicas na criação e amplificação de um cDNA infeccioso JEV de comprimento total geneticamente estável como um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usando os seguintes procedimentos experimentais gerais: isolamento de RNA viral, síntese de cDNA, subclonagem e modificação de cDNA, montagem de um cDNA de comprimento total, linearização de cDNA, in vitro Síntese de RNA e recuperação de vírus. Este protocolo fornece uma metodologia geral aplicável à clonagem de cDNA de comprimento total para uma variedade de vírus de RNA de fita positiva, particularmente aqueles com um genoma de >10 kb de comprimento, em um vetor BAC, a partir do qual RNAs infecciosos podem ser transcritos in vitro com uma RNA polimerase bacteriófaga.

Introdução

Para virologistas de ARN, o advento da tecnologia de DNA recombinante no final de 1970, foi possível converter os genomas virais de ARN em clones de ADNc, que pode então ser propagada como plasmídeos em bactérias para a manipulação genética de vírus de ARN. ¹ O primeiro vírus de ARN ser molecularmente clonado foi Qp bacteriófago, um vírus de ARN de cadeia positiva que infecta Escherichia coli. Um plasmídeo contendo uma cópia de ADNc completa do ARN genómico Qp deu origem a Qp fagos infecciosos quando introduzido em E. coli. ² Pouco tempo depois, esta técnica foi aplicada para poliovírus, um vírus de ARN de cadeia positiva de seres humanos e animais. Um plasmídeo que possui um ADNc de comprimento completo do ARN genómico poliovírus foi infecciosas quando transfectadas em células de mamífero e é capaz de produzir viriões infecciosos ³ Nesta abordagem "lançou-ADN", os ADNc clonados deve ser transcrita intracelularmente para iniciar a replicação do ARN virai.;no entanto, não está claro como a transcrição é iniciada e como as transcrições são transformados com a sequência correcta viral. Esta preocupação tem levado ao desenvolvimento de uma alternativa "lançou-ARN" abordagem, em que uma cópia de cDNA do genoma completo de RNA viral é clonado sob um promotor reconhecido por uma E. coli ou ARN polimerase do fago para a produção de ARN sintéticos in vitro com definido 5 'e 3', que se submetem a um ciclo completo de replicação virai quando introduzidos em células hospedeiras. ^{4,5 O} primeiro sucesso com esta abordagem foi relatado para brome vírus do mosaico , ^6,7 um vírus de ARN de cadeia positiva de plantas. Desde então, a abordagem lançada ARN foi desenvolvido para uma grande variedade de vírus de ARN de cadeia positiva, incluindo calicivírus, alfavírus, flavivírus, coronavírus, e arteriv�us. ^1,4,5,8

Em ambos o ADN e ARN-lançado sistemas de genética inversa, a construção de um full-clone de ADNc de comprimento é a chave para a geração de ADN ou ARN infecciosos de vus de ARN de cadeia positiva, mas torna-se um considerável desafio técnico, conforme o tamanho do genoma viral aumenta. ^9-17 Em particular, um grande genoma de ARN de ~ 10 -32 kb apresenta três principais obstáculos para a clonagem de um ADNc de comprimento completo funcional. ¹⁸ A primeira dificuldade é a síntese de um cDNA cópia fiel, uma vez que a fidelidade da RT-PCR é inversamente proporcional ao comprimento do RNA viral. O segundo obstáculo é a presença de sequências potencialmente tóxicos, uma vez que as moléculas de RNA longas são mais prováveis ​​de conter sequências inesperadas capazes de fazer o fragmento de cDNA em plasmídeos instáveis ​​em E. coli. O terceiro e mais importante causa é a disponibilidade de um vector adequado, uma vez que é difícil encontrar um vector de clonagem que pode alojar um inserto de cDNA viral de> 10 kb. Ao longo das últimas três décadas, essas barreiras foram superadas por vários avanços na enzimologia, metodologia, umad vectorology. ^1,4,5,8 Destes, o desenvolvimento mais promissor e inovador é a clonagem de grandes vírus de ARN de cadeia positiva cromossomas artificiais bacterianos (BACs como infecciosas). O vector BAC é um plasmídeo de baixo número de cópias de clonagem (1-2 cópias / célula), com base na E. coli factor de fertilidade, com um tamanho médio de inserção de ADN de ^19-21 kb ~ 120-350 Um fragmento de DNA é inserida no vector BAC de uma forma semelhante à clonagem em vectores de clonagem gerais.; os clones BAC resultantes são estáveis ​​ao longo de muitas gerações, em E. coli. ^22,23 Até à data, a tecnologia BAC foi usado para criar clones de ADNc infecciosos para> 10 membros de três famílias de vírus ARN de cadeia positiva, isto é, Flaviviridae, ^24-29 Arteriviridae, ³⁰ e Coronaviridae. ^{9,16,17 , 31,32}

Usando vírus da encefalite japonesa (JEV) como um exemplo, o presente trabalho relata os procedimentos detalhados que podem serutilizado para construir um de comprimento completo de BAC infeccioso geneticamente estável para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva. JEV é um flavivírus zoonótica ³³ que é transmitida em natureza entre aves, porcos e outros hospedeiros vertebrados por vectores de mosquito. ^34,35 Nos seres humanos, a infecção pode causar o JEV grave doença neurológica encefalite japonesa frequentemente fatal (JE), ^{36 que} ocorre na Ásia e partes do Pacífico Ocidental, ^37,38 com uma incidência anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. ^39,40 O genoma do JEV é uma ~ 11 kb,, molécula de RNA de cadeia simples de sentido positivo e consiste em uma única estrutura de leitura aberta (ORF) flanqueada por duas regiões não codificantes (NCRs) nas extremidades 5 'e 3'. A ORF codifica ^41,42 uma poliproteína que é clivada por proteases do hospedeiro e virais para produzir as proteínas individuais 10, designado C, prM, E, NS1, NS2a, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 na direcção N- para C-terminal. ^34,43,44 Além disso, uma mensagemXtended forma de NS1 (NS1 ") é expresso por -1 frameshifting ribossomal nos codões 8-9 da NS2a. ^45,46 Destes 11 proteínas, as três proteínas estruturais (C, prM e E) são essenciais para a formação de infeccioso viriões, ^47,48 e os restantes oito proteínas não estruturais (NS1 a NS5, e NS1 "), são essenciais para a replicação viral de ARN, a montagem de partícula ^{49-51, 52-56} e ^57-59 a imunidade inata evasão. Tanto a 5 'e 3 'NCRs contêm sequências conservadas estruturas primárias e secundárias de ARN forma terciária / ^60-62, que são importantes para modular a replicação do ARN virai ^63,64.

Este protocolo descreve as ferramentas, métodos e estratégias para a geração de um de comprimento completo de BAC infeccioso do JEV SA ₁₄ -14-2. ²⁸ Este clone de BAC funcional contém uma cópia de cDNA completa do ARN genómico JEV, ^{65, que} é abarcado por um promotor para a polimerase de ARN de SP6 a montantedo vírus da extremidade 5 'e um local de restrição Xbal único a jusante da extremidade 3' viral para a transcrição in vitro run-off. Esta tecnologia BAC é aplicável à construção de um clone molecular de cDNA totalmente funcional para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva.

Protocolo

Nota: A Figura 1 apresenta uma estratégia para a construção de um full-length infectious cDNA JEV como um BAC ²⁸ Tabela 1 fornece uma lista dos oligonucleótidos utilizados neste protocolo ^28..

1. Extrair RNA viral a partir JEV Partículas em cultura celular sobrenadantes

1. Comece com o meio de cultura celular contendo JEV _SA 14 -14-2, um vírus vacina JE ao vivo que exige o Nível de Biossegurança 2 de contenção.
   Nota: O título virai é de aproximadamente 1-3 x 10 ⁶ unidades formadoras de placas / ml.
2. Fazer o treinamento de biossegurança necessária para todas as práticas padrão microbiológicos, equipamento de segurança e instalações de laboratório antes de trabalhar com JEV _SA 14 -14-2.
3. Purifica-se ARN viral a partir de uma aliquota do meio de cultura celular contendo vírus, utilizando uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina ⁶⁶ (Figura 1A).
   1. de Anúnciosd 600 ul de reagente o monofásico a 200 ul de sobrenadante de cultura em um microtubo de 1.7 ml. Homogeneizar a mistura à mão-sacudindo o tubo vigorosamente durante 30 segundos e incubando durante 5 minutos à temperatura ambiente.
   2. Adicionar 160 ul de clorofórmio para a amostra homogeneizada. Misturar bem com a mão-agitando o tubo vigorosamente por 15 segundos e deixá-lo por 2-3 min a RT.
   3. Centrifugar o lisado total a 13.400 x g durante 15 min a 4 ° C, o que resulta numa separação de duas fases líquidas, isto é, uma fase inferior orgânica e uma fase aquosa superior. Transferir a fase aquosa superior (200 ul inferior) contendo o ARN para uma nova microtubo.
   4. Precipitar o ARN por adição de 1 ul de 5 ug / mL de glicogénio e 400 pi de isopropanol a 100% e incubação durante 10 min à temperatura ambiente.
   5. Centrifugar a mistura a 13.400 × g durante 10 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN com 1 mL de etanol a 75% por pulso-vortex 3-5vezes e centrifugação a 13.400 x g durante 5 min a 4 ° C.
   6. Secar o sedimento de ARN em 10 minutos e dissolvê-lo em 40 uL de _dH2O Armazenar o RNA extraído à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.

2. Sintetizar um conjunto de quatro sobreposição cDNA Fragments (F1 a F4) Abrangendo toda a Viral RNA genômico por transcrição reversa (RT) -PCR

1. Executar uma reacção de RT de 20 ul com uma alíquota de 10 ul do ARN viral purificado como um molde e uma forma modificada de Moloney vírus da leucemia murina transcriptase reversa. ⁶⁷
   1. Defina-se uma mistura de 13 ul contendo 10 ul do RNA purificado, 1 ul de mistura de dNTP 10 mM, 1 ul de 4 pmoles / ul iniciador, e 1 ul de _dH2O Use o primer específico do fragmento para cada reação RT: 1RT para F1, F2 para 2RT, 3RT para F3, e 4RT para F4.
   2. Incubar a mistura a 65 ° C durante 5 min, colocar em gelo durante 1 min, e, em seguida, rapidamente a centrifugar para recolher o conteNTS na parte inferior do tubo.
   3. Adicionar 4 uL 5 x tampão de RT, 1 ul de DTT 0,1 M, 1 ul de 40 U / ul de inibidor de RNase, 1 ul e 200 U / ul de transcriptase reversa. Misturar por pipetagem cima e para baixo três a cinco vezes.
   4. Deixe a reacção prosseguir a 50 ° C durante 1 h, depois aquecer-inactivar a amostra a 70 ° C durante 15 min. Armazenar o ADNc de primeira cadeia sintetizado a -20 ° C até à sua utilização.
2. Executar uma reacção de PCR com 100 ul de uma alíquota de 5 ul da reacção de RT inactivado por calor como um molde e um de alta fidelidade da polimerase de ADN termoestável ⁶⁸ (Figura 1B).
   1. Configurar uma reacção 100 ul de PCR em gelo, contendo 5 uL da reacção de RT, 20 uL 5 x tampão de PCR, 4 ul de 10 mM mistura de dNTP, 5 ul de 10 mM de iniciadores para a frente, 5 ul de 10 mM iniciador inverso, 1 ul de 2 L / ul de polimerase de ADN, e 60 uL de dH ₂ O. Use o par de primers específicos do fragmento para cada reactio PCRn: 1F + 1R para F1 (2573 pb), 2F + 2R para F2 (4171 pb), 3F + 3R para F3 (3922 pb), e 4F + 4R para F4 (1798 pb).
   2. Misturar suavemente pelo tubo-sacudindo dedo de três a cinco vezes e centrifugar para recolher rapidamente os seus conteúdos na parte inferior.
   3. Comece a termociclagem com um passo de desnaturação inicial de 30 segundos a 98 ° C, seguido de 25-30 ciclos com o seguinte perfil de PCR: 10 seg a 98 ° C, 30 seg a 60 ° C e 1-2 min (30 s / kb) a 72 ° C. Armazenar os produtos de PCR a 4 ° C até serem analisadas.
3. Executar uma alíquota de 2-5 uL de cada reacção de PCR num gel de agarose a 0,8% contendo 0,5 ug / ml de brometo de etídio (EtBr) (Figura 2).
   CUIDADO: EtBr é um potente mutagênico e requer jalecos, óculos de segurança e luvas a utilizar e extremo cuidado a ser observado durante a sua utilização, armazenamento e eliminação.

3. Subclone cada um dos quatro fragmentos de cDNA (F1 a F4) para um vector BAC criar pBAC / F1 para pBAC / F4 bTécnicas y Molecular Cloning

1. Digerir o vector e inserir ADN com duas endonucleases de restrição apropriadas, como se segue:
   1. Executar uma digestão sequencial de pBAC / PRRSV / FL (vector), ³⁰ um derivado do plasmídeo pBeloBAC11 (7507 pb, número de acesso GenBank U51113), com Pme I e Not I, em um volume total de 60 ul (contendo ~ 500 ng de ADN , 10 U de enzima, 1x tampão de digestão, e 1 × BSA) a 37 ° C durante 12-15 horas, o que origina o fragmento do vector de 15426 bp.
   2. Executar uma digestão sequencial de cada um dos quatro fragmentos amplificados de ADNc (inserção) com Sma I e Not I, em um volume total de 60 ul (contendo ~ 1 ug de ADN, 20 U de enzima, 1 × tampão de digestão, e 1 × BSA) a 25 ° C (Smal) ou 37 ° C (Not I) durante 12-15 h, o que produz os seguintes fragmentos de inserção do tamanho desejado: F1 (2559 pb), F2 (4157 pb), F3 (3908 pb), e F4 (1784 pb).
2. Purifica-se ovector desejado e inserir fragmentos de DNA por gel extraction.
   1. Separa-se os produtos digeridos duplamente em um ponto de fusão baixo ponto de gel de agarose a 1% contendo 0,5 ug / mL de EtBr. Cortar uma banda do fragmento de DNA desejado com uma quantidade mínima de agarose (normalmente ~ 200 mL) sob luz ultravioleta de onda longa.
   2. Adicionar um volume igual de tampão TEM (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, e _MgCl2 10 mM) para o excisado de agarose, num microtubo de 1,7 mL. Incubar a amostra a 72 ° C durante 10-15 min, com vórtex a cada 2-3 minutos até a agarose estar completamente derretida.
   3. Adicionar um volume igual de fenol saturado com tampão pré-aquecido, vortex vigorosamente durante 1 min, centrifugar a 13.400 e × g durante 10 min à temperatura ambiente.
      Nota: A mistura separa-se numa fase orgânica inferior e uma fase aquosa superior. Transferir a fase aquosa superior contendo o ADN para um novo microtubo.
   4. Adicionar um volume igual de clorofórmio: álcool isoamílico (24: 1), vortex durante 1 min, e centrifugar a 13,400 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Transferir a fase aquosa superior para um novo microtubo.
   5. Adicionar 0,5 mL de 10 mg / mL de ARNt de levedura, 1/10 do volume de 3 M acetato de sódio, e 2,5 volumes de etanol a 100%. Manter a mistura em gelo durante 20 min.
   6. Centrifugar a mistura a 13.400 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento de ADN com 1 ml de etanol a 70% por pulso-vortex três a cinco vezes e centrifugação a 13.400 x g durante 10 min.
   7. Secar o sedimento de DNA durante 10 minutos e dissolvê-lo em 20 ul de tampão TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM de EDTA [pH 7,6]).
3. Ligar o vector desejado e inserir fragmentos de ADN utilizando ADN-ligase de T4.
   1. Defina-se uma reacção de ligação de 20 uL contendo 50-100 ng de ADN do vector, um excesso molar de ~ 3 vezes o ADN inserido, 400 U de T4 ADN-ligase, e 1 × tampão de ligação. Incubar a reacção de ligação a 16 ° C durante 12-15 horas.
      Nota: Incluir um contr negativool reação, ou seja, vetor só que sem a inserção, em paralelo.
   2. Realizar quatro ligations separados, cada um juntando o 15426 pb Pme I- Not I fragmento de pBAC / PRRSV / FL com o 2559-pb (para F1), 4157-pb (para F2), 3908-pb (para F3), ou 1784-pb (para F4) Sma I fragmento Not I de um dos quatro produtos de amplificação de cDNA, para gerar subclones de pBAC / F1 para pBAC / F4.
4. Transformar o ADN ligado em E. coli DH10B pelo método de choque -Calor _CaCl2.
   1. Aqui alíquotas de 100 ul do _CaCl2 tenha sido tratada com células DH10B competentes ⁶⁹ armazenado a -80 ° C e descongelar em gelo-los.
      Nota: Use 100 ul de células por transformação.
   2. Adicionar uma alíquota de 10 uL da reacção de ligação de DNA de 100 ul de células descongeladas num microtubo de 1,7 mL, misturar suavemente batendo no tubo, e manter em gelo durante 30 min.
   3. A choque de calor a mistura de células-ADN durante 45 s em 42 ° C uma wabanho de ter, colocar em gelo durante 2 min e, em seguida adicionar 900 ul de caldo LB pré-aquecida até à TA.
   4. Incubar as células chocada ao calor a 35 ° C durante 1 h, com agitação a 225-250 rpm.
   5. Espalhe 50 a 200 mL alíquotas de as células cultivadas em placas de agar LB contendo 10 ug / ml de cloranfenicol (CML). Mantenha as placas à temperatura ambiente, lado direito para cima, até que estejam secos.
   6. Rodar as placas de cabeça para baixo e incubar a 35 ° C durante 15 h.
5. Recuperar o DNA BAC clonado a partir das células hospedeiras através de um método de purificação com base em coluna (Figura 1C).
   1. Escolha de seis a oito colónias bacterianas das placas de agar LB-CML e inocular-los em 3 ml de caldo 2xYT contendo 10 ug / ml de LMC. Incubam-se as culturas a 35 ° C durante 10 horas com agitação vigorosa (225-250 rpm).
   2. Isolar DNAs BAC recombinante 1-1,5 ml das culturas bacterianas usando colunas de giro, como indicado pelo fabricante. ⁷⁰ eluir o DNA extraído (TYPIcamente 100-200 ng) em 20 ul de tampão TE.
   3. Realizar duas digestões com enzimas de restrição analíticas de BACs isolado durante ~ 6 horas, num volume total de 10 uL, uma para identificar a presença do vector com um inserto correcto usando as mesmas enzimas utilizadas para a clonagem (ver protocolo 3.1), e a outra para testar a integridade dos BACs clonados com uma enzima apropriada (por exemplo, BglII, Ncol, PstI ou), gerando um padrão de fragmentos de restrição único.
   4. Propagar o BACs correctamente clonadas por inoculação de 500 ul de culturas bacterianas positivas (de protocolo 3.5.1) em 500 ml de meio 2xYT-Cml e cultivando o inoculo durante 6 h a 35 ° C enquanto agitando a 225-250 rpm. Purifica-se o DNA de BAC (tipicamente 10-20 ug) a partir da cultura de 500 ml utilizando colunas de filtro, tal como recomendado pelo fabricante. ⁷¹
      Nota: Os quatro subclones BAC iniciais, cada um contendo um fragmento de ADNc de ARN genómico de JEV, pode vir a ter sobree ou mutação (ões) mais indesejada quando em comparação com a sequência de consenso do genoma viral ⁴² (que serve como uma sequência de referência). Qualquer mutação precisa ser corrigido por mutagénese dirigida ao local com base em PCR, antes da montagem de um full-length JEV cDNA ^27.

4. Criar um Full-length JEV cDNA com o 5 'SP6 Promotor e 3' Run-off do Site

1. Adicione três modificações genéticas (veja abaixo Protocolos 4.1.1-4.1.3) nos ADNc clonados para permitir a transcrição in vitro de ARN de genoma de comprimento run-off com a autêntica 5 'e 3' do genoma viral.
   1. Introduzir um promotor de SP6 directamente a montante da extremidade 5 'do genoma viral por extensão de sobreposição PCR (Figura 1D, pBAC / F1 ^SP6).
      1. Amplificar dois fragmentos de DNA se sobrepõem através da primeira PCR padrão de pBAC / F1 com os dois pares de primers SP6F + SP6R (tamanho do produto, 173 pb) e F1F + F1R (s produtoize, 676 pb), cada um em uma reacção de 50 ul contendo 1 ul de molde de ADN (~ 200 pg / mL), 10 uL 5 x tampão de PCR, 2 ul de dNTPs 10 mM, 2,5 ul de cada um dos 10 uM para a frente e reverso iniciadores, 0,5 ul 2 U / ul de polimerase de ADN, ⁶⁸ e 31,5 jil _dH2O Realizar a RCP, utilizando o seguinte perfil de ciclos: 98 ° C durante 30 seg, e 25 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 20 seg.
      2. Gel-purificar os dois fragmentos de ADN amplificados por RCP, após a execução de cada um dos dois produtos de PCR sobre um gel de ponto de fusão baixo ponto de agarose a 1,5%, como descrito no protocolo 3.2.
      3. Fundir os dois fragmentos de ADN purificados em gel, através da segunda fusão de PCR utilizando os iniciadores SP6F mais exterior + F1R (tamanho do produto, 821 pb) numa reacção de 100 ul incluindo 1 ul de cada um dos dois fragmentos de ADN purificados (~ 100 pg / mL), 20 ul de tampão de PCR 5 ×, 4 ul de dNTPs 10 mM, 5 jil de cada um dos 10 uM iniciadores directo e inverso, 1 ul2 U de polimerase / mL de ADN, ⁶⁸ e 63 uL de dH ₂ O. Usar o seguinte perfil térmico ciclagem: 98 ° C durante 30 seg, e 25 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg.
      4. Gel-purificar o fragmento amplificado de PCR a partir de um fundido de baixo ponto de fusão do gel de agarose a 1%, como descrito no protocolo 3.2.
      5. Execute o procedimento de clonagem de cinco etapas descritas em protocolos 3,1-3,5 para ligar o 760-bp fragmento Pac I- BsiWI da PCR amplicon fundido purificado em gel com o 9532-bp fragmento Pac I- BsiWI de pBAC / F1 para gerar pBAC / F1 ^SP6.
   2. Remover o pré-existente, local interno Xba I no nucleótido 9131 através da introdução de uma mutação pontual silenciosa (A ⁹¹³⁴ → T) por meio de extensão de sobreposição PCR (Figura 1D, pBAC / F3 ^KO).
      1. Amplificar dois fragmentos de ADN sobrepostos pela primeira PCR padrão de pBAC / F3 com os dois pares de iniciadores X1F + X1R(tamanho do produto, 746 pb) e X2F + X2R (tamanho do produto 316 pb) numa reacção de 50 ul, nas condições experimentais descritas no Protocolo 4.1.1.1.
      2. Gel-purificar os dois fragmentos de ADN amplificados por RCP, após a separação electroforética sobre géis de 1,5% de baixo ponto de fusão de agarose, conforme descrito no protocolo 3.2.
      3. Fundir os dois fragmentos de ADN purificados em gel, através da segunda fusão de PCR utilizando os iniciadores mais exteriores X1F + X2R (tamanho do produto, pb 1033) numa reacção de 100 ul, nas condições experimentais descritas no Protocolo 4.1.1.3.
      4. Gel-purificar o fragmento amplificado pela PCR fundido a partir de um baixo ponto de fusão gel de agarose 1%, conforme detalhado no Protocolo 3.2.
      5. Execute o procedimento de clonagem de cinco etapas descritas em protocolos 3,1-3,5 para ligar o 949-bp Avr II- Não I fragmento da PCR amplicon fundido purificado em gel com o 16245-BP não I- BsiWI e 2141 pb Bsi W I - fragmentos Avr II de pBAC / F3 para produzir pBAC / F3 ^KO.
   3. Engendrar um novo artificial Xba I run-off local imediatamente a jusante do extremo 3 'do genoma virai através de mutagénese dirigida ao local baseada em PCR (Figura 1D, pBAC / F4 ^RO).
      1. Gerar um fragmento de ADN por PCR de pBAC / F4 com iniciadores ROF + ROR (tamanho do produto, 324 pb) numa reacção de 100 ul contendo ADN molde 1 ul (~ 200 pg / pl), 20 ul de 5 × tampão de PCR, 4 ul 10 mM dNTPs, 5 ul de cada um dos 10 � frente e reverso primários, 1 pi 2 U / mL DNA ^polimerase, 68 e 64 mL _dH2O Realizar a RCP, utilizando o seguinte perfil de ciclos: 98 ° C durante 30 seg, e 25 ciclos de 98 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 15 seg.
      2. Gel-purificar o fragmento de ADN amplificado por PCR a partir de um baixo ponto de fusão do gel de agarose a 1%, tal como descrito no protocolo 3.2.
      3. Execute o procedimento de clonagem de cinco etapas descritas em protocolos 3,1-3,5 para ligar o 283-bp Sfi I-Not I fragmento da PCR amplicon purificado em gel com a 16933 pb Sfi I I- Não fragmento de pBAC / F4 para criar pBAC / F4 ^RO.
2. Montar um conjunto de quatro modificado, sobrepondo cDNAs em um único full-length _SA 14 -14-2 BAC (pBAC / _SA 14 -14-2) juntando-se em três locais de restrição naturais (BSR GI, Bam HI, e Ava I ) de uma maneira sequencial utilizando a cinco passos de clonagem procedimentos detalhados nos Protocolos 3,1-3,5 (Figura 1E): F1 ^SP6 → F1 F2 ^SP6 (através da substituição do fragmento de pBAC / F1 ^SP6 Bsr G I- Not I de que com pBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO (por substituição do fragmento de pBAC / F1 F2 ^SP6 BamH I- Not I de que com pBAC / F3 ^KO) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^RO (através da substituição do fragmento de Not I Ava I- pBAC / F1 F2 ^SP6F3 ^KO com a de pBAC / F4 ^RO).

5. Prepare um de alta pureza Maxi-prep da Full-length _SA 14 -14-2 BAC

1. Cresça uma única colônia de E. coli DH10B realização pBAC / SA -14-2 ₁₄ em 3 mL de caldo 2xYT contendo 10 ug / ml Cml durante 10 h a 35 ° C com agitação a 225-250 rpm, e, em seguida, expandir-se pela inoculação de 500 ul de 10 horas a cultura bacteriana em 500 ml de YT 2 ×-Cml médio e cultivando o inoculo durante 6 h a 35 ° C com agitação vigorosa.
2. Centrifugar a cultura bacteriana em dois frascos de 250 ml a 3107 × g durante 15 min a 4 ° C. Ressuspender cada pellet em 30 ml de solução GTE (glucose 50 mM, 25 mM Tris-Cl, 10 mM de EDTA e [pH 8,0]), e, em seguida, adicionar 500 ul de 60 mg / ml de lisozima. Incubar as duas suspensões de células em gelo durante 10 min.
3. Adicionar 60 ml de solução de lise feita recentemente (NaOH 0,2 N e 1% de SDS) a cada suspensão de células, misture bem até ficar transparente, e manter os lisadosà TA durante 10 min.
4. Adicionar 45 ml de solução de neutralização (100 ml, consistindo em 60 ml de 5 M de acetato de potássio, 11,5 ml de ácido acético glacial e 28,5 ml _de dH2O) a cada frasco e misturar bem, invertendo as garrafas, e incubam os lisados ​​neutralizados em gelo durante 10 min.
5. Centrifugar os lisados ​​neutralizado a 18.566 × g durante 20 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante de ambos os frascos em dois novos frascos de 250 ml; adicionar 0,6 volume de isopropanol a 100% para cada um, e mantê-los em gelo durante 20 min.
6. Girar as precipitados em 18.566 × g durante 20 min a 4 ° C. Dissolve-se cada sedimento em 5 ml de tampão TE, combiná-las num tubo de 50 mL (10 mL no total), e precipitar o ARN por adição de um volume igual de 5 M de cloreto de lítio. Incubar a mistura em gelo durante 10 min.
7. Centrifugar o ARN precipitado a 14.636 × g durante 20 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 250 ml e precipitar o ADN por adição de 2 volumes de isopropanol a 100%.Incubar a mistura em gelo durante 20 min.
8. Girar o precipitado de ADN a 18.566 × g durante 20 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento de DNA em 9,5 ml de tampão TE (pH 7,6), e adicionar 10 g de cloreto de césio (CsCl) e 390 ul de 10 mg / mL de EtBr.
9. Carregar a solução de CsCl-DNA-EtBr para um tubo de polipropileno 16 x 76 mm selável usando uma seringa equipada com uma agulha de 18 G. Girar o gradiente de CsCl em uma ultracentrífuga selado em 401.700 × g durante 16 h a 20 ° C (Figura 3).
10. Recolha uma banda de ADN de BAC de plasmídeo a partir do gradiente de CsCl utilizando uma agulha de 18 G para criar uma abertura de ventilação de ar no topo do gradiente e uma de 20 L equipada com agulha de seringa para recuperar o DNA de BAC do lado do gradiente.
11. Adicionar 2,5 volumes de dH ₂ O-butanol saturado com a amostra de DNA de BAC EtBr-coradas e misturar por vortex. Centrifugar a mistura a 13,400 x g durante 1 min e transferir a fase aquosa inferior para um novo 1,7 ml de MICrotube. Repita este procedimento seis vezes.
12. Precipitar o DNA de BAC EtBr-livre pela adição de 1/10 de volume de acetato de sódio 3M e 2,5 volumes de etanol a 100% para o DNA de BAC extraiu-butanol e incubação durante 10 min em gelo. Centrifugar o precipitado a 13.400 × g durante 10 minutos, lava-se a pelete de ADN com 1 ml de 70% de etanol, e re-sedimentar-o por centrifugação.
13. Secar o sedimento de DNA durante 10 minutos e dissolvê-lo em 200 ul de tampão TE (pH 7,6).
    Nota: A Figura 4 mostra uma visão geral do sistema de genética reversa para JEV _SA 14 -14-2.

6. Transcrever RNAs sintéticos in vitro a partir de um Full-length DNA JEV BAC Linearized

1. Executar uma digestão de grande escala com enzimas de restrição de pBAC / SA ₁₄ -14-2 com Xbal em um volume total de 100 ul (contendo 3 ng de ADN, 60 U de enzima, 1 × tampão de digestão, e 1 × BSA) a 37 ° C durante 12-15 horas. Examinar uma aliquota de 3 uL de a digestion reacção sobre um gel de agarose a 0,8% contendo 0,5 ug / mL de EtBr.
2. Incubar a reacção de digestão com mais de 25 U de nuclease de feijão Mung (NBM) a 30 ° C durante 2 horas (Figura 4A).
3. Levar o volume da Xbal digerido, amostra tratada com NBM até 300 ul com _dH2O Adicionar um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1) para a amostra diluída, vortex vigorosamente durante 1 min, centrifugação a 13.400 x g durante 10 min, e, em seguida, transferir a fase aquosa superior para um novo 1,7 ml microtubo. Adicionar um volume igual de clorofórmio e repetir o procedimento de extracção.
4. Recuperar o fenol / clorofórmio-extraiu-se, BAC linearizado por precipitação com etanol: Adicionar 1/10 volume de acetato de sódio 3 M e 2,5 volumes de etanol a 100%, e incuba-se em gelo durante 20 min. Centrifugar o precipitado a 13.400 × g durante 10 minutos, lava-se a pelete de ADN com 1 ml de etanol a 70%, e, em seguida, girá-lo para baixo por re-centrifugação.
5. Ar seco o DNA pelleT durante 10 min e dissolvê-lo em 30 uL de _dH2O Examina-se uma alíquota de 1 ul do BAC recuperado num gel de agarose a 0,8% com 0,5 ug / mL de EtBr (Figura 5A).
6. Executar uma transcrição do DNA de BAC linearizado escoamento num volume total de 25 ul (contendo ~ 200 ng de molde de ADN, 0,8 mM de tampão analógico [m ⁷ G (5 ') ppp (5') A], rNTP 1 mM, 40 U de inibidor de ARNase, 20 U de ARN-polimerase de SP6, tampão de transcrição 1 × ⁷² e) a 37 ° C durante 1 h (Figura 4B). Incluir 0,5 uM ^de [3H] UTP para quantificação de ARN a partir de ^[3 H] UTP incorporação, como monitorizado por adsorção a DE-81 de papel de filtro. ⁶⁹
7. Executar uma alíquota de 1-2 uL da reacção de transcrição run-off de um gel de agarose a 0,6% contendo 0,5 ug / mL de EtBr (Figura 5B).

7. Determinar ARN infectividade e Vírus Rendimento

1. Cultivar células BHK-21 em 150 mm culture pratos a uma densidade de 3 x 10 ⁶ células / prato durante 24 horas à temperatura de 37 ° C com 5% de CO _2.
   Nota: Manter as células BHK-21 em meio essencial mínimo alfa suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 2 mM, vitaminas, e penicilina / estreptomicina.
2. Lavar a monocamada de células com 10 ml de solução fria A (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 8,1 mM de Na ₂ HPO _4, 1,5 mM e KH _{2 PO 4).} Separe as células a partir das placas por tratamento com 4 ml de tripsina-EDTA (0,25%), e recolher-los por centrifugação a 270 x g numa centrífuga de mesa durante 2 min.
3. Ressuspender o sedimento de células com 50 ml de solução fria A num tubo de 50 ml e centrifugar a suspensão de células a 270 x g durante 2 min. Repita este procedimento de lavagem três vezes; Após a última lavagem, ressuspender o sedimento de células, a uma densidade de 2 x 10 ⁷ células / ml em Sol A.
4. Mistura-se uma alíquota de 400 ul de suspensão de células com 2 μg de ARN sintéticos em um intervalo cuvete de 2 mm, e prontamente electroporate a mistura com um electroporador sob condições óptimas de electroporação: comprimento 980 V, 99 ms de pulso, e 5 impulsos (Figura 4C).
   Nota: Utilize a ³ marcado com H RNA sintetizado no Protocolo 6.5 diretamente para eletroporação sem purificação adicional.
5. Deixar as células electroporadas a TA durante 10 min e transferir para um microtubo de 1,7 mL contendo 600 uL de meio de cultura completo.
6. Prepara-se uma diluição em série de 10 vezes de células electroporadas em 1 mL de meio de cultura completo e a placa de uma alíquota de 100 ul de cada diluição sobre as monocamadas de unelectroporated células BHK-21 (5 x 10 ⁵⁾ numa placa de 6 poços.
7. Após 4-6 h de incubação, sobrepor as células com 0,5% de agarose em meio mínimo essencial contendo 10% de soro fetal bovino. Incubar as placas durante 4 dias a 37 ° C com 5% de CO _2.
8. Visualize o centro infecciosas (placas) por fixação com 7% de formaldeído e coloração com violeta de cristal a 1% em etanol a 5% ²⁷ (Figura 6A).
   1. Opcional: Examinar as células electroporadas ARN-a 18-20 horas após a transfecção para a expressão da proteína JEV por imunofluorescência ^27,73 (Figura 6b), e colher os sobrenadantes das células electroporadas ARN a 22 e 40 h pós-transfecção pelo vírus titulação por ensaios de placa ^27,63 (Figura 6C).

Resultados

Para todos os vírus de ARN de cadeia positiva, a fiabilidade e eficiência de um sistema de genética inversa dependerá da estabilidade genética de um ADNc de comprimento completo clonado, cuja sequência é equivalente à sequência de consenso do ARN genómico virai. ²⁷ A Figura 1 mostra uma de cinco passo estratégia para a construção de um cDNA infeccioso de comprimento completo como um BAC para o JEV SA -14-2 ₁₄ ^28: Passo 1, a purificação do RNA virai a partir do sobrenadante de cultura de células de JEV-infectadas células BHK-21 (Figura 1A); Passo 2, a síntese de quatro fragmentos amplificados de ADNc que se sobrepõem (F1 a F4) abrangendo todo o genoma viral (Figura 1B); Passo 3, subclonagem de cada um dos quatro fragmentos de ADNc contíguos num vector BAC, criando pBAC / F1 para pBAC / F4 (Figura 1C); Passo 4, a modificação de ADNc clonados para transcrição in vitro run-off com a ARN-polimerase SP6, isto é, colocando um SP6sequência de promotor imediatamente a montante da extremidade 5 'virais (pBAC / F1 ^SP6), eliminação de uma pré-existente sítio interno Xba I no nucleótido 9131 através da introdução de uma mutação pontual silenciosa, ⁹¹³⁴ Um → T (pBAC / F3 ^KO), e inserindo um local de run-off novo artificial Xbal imediatamente a jusante da extremidade 3 'viral (pBAC / F4 ^RO) (Figura 1D); ²⁸ e Passo 5, um conjunto de comprimento completo _SA-14 -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (Figura 1E). A Tabela 1 lista os oligonucleótidos utilizados neste procedimento de clonagem.

Para a construção de um JEV ADNc funcional, o primeiro passo importante é a síntese de quatro fragmentos de ADNc sobrepostos usando o RNA viral purificado como um molde para a RT-PCR. A Figura 2 proporciona um resultado representativo para os quatro produtos de RT-PCR que eram a electroforese em 0,8%em gel de agarose. Este gel demonstra claramente que um de comprimento completo JEV ADNc é amplificado em quatro fragmentos de ADNc que se sobrepõem. Ocasionalmente, as reacções de RT-PCR pode produzir um ou mais produtos adicionais específicos do vírus ou não específicos que são principalmente menor do que o produto esperado, porque o recozimento de inespecífica de iniciadores durante a síntese de cDNA / amplificação. Por outro lado, pouco ou nenhum produto esperado de RT-PCR será amplificado por causa da contaminação com RNase acidental durante o isolamento de ARN viral ou desempenho inadequado do RT-PCR.

O próximo passo chave é a clonagem e modificação de um comprimento total de ADNc parcial ou JEV em BAC, que é um procedimento relativamente simples que utiliza técnicas de ADN recombinante convencionais. ⁶⁹ A Figura 3 apresenta um resultado representativo para a purificação do clone de BAC contendo um cDNA de comprimento total de JEV _SA 14 -14-2 por faixas em um gradiente de CsCl-EtBr.Nesta experiência, após a centrifugação durante 16 horas a 401.700 × g, duas bandas distintas, ou seja, a E. coli ADN cromossómico de cima e o ADN super-enrolado plasmídeo BAC abaixo, são visíveis no meio do tubo sob luz ultravioleta de onda longa. Um volume mínimo (~ 400 mL) a banda de DNA de BAC inferior foi cuidadosamente recolhido por abrir um furo com uma seringa, no lado do tubo. Subsequentemente, o EtBr foi extraída a partir do DNA de BAC por extracção com butanol, e o DNA de BAC livre de EtBr foi concentrado por precipitação com etanol.

O passo final é a determinação da infecciosidade específica dos ARN transcritos sintéticos in vitro a partir de comprimento completo SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / SA -14-2 ₁₄₎ após transfecção de ARN em células permissivas (Figura 4). Este passo envolve três passos sequenciais: 1, Passo de linearização de comprimento completo SA ₁₄ -14-2 cDNA no extremo 3 '-end do genoma viral (Figura 4A); Passo 2, a produção de RNAs sintéticos a partir do cDNA linear, através do escoamento de transcrição (Figura 4B); e Passo 3, salvamento dos vírus recombinantes em células BHK-21 transfectadas com os ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dois clones independentes de pBAC / SA ₁₄ -14-2 foram linearizado com Xbal e tratado com digestão NBM para remover a quatro bases 5 'saliência gerada pela digestão com Xbal. Os BACs linearizados foram limpos por extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. A linearização dos dois BACs purificados foi demonstrada em um gel de agarose a 0,8% (Figura 5A). A extracção com fenol-clorofórmio deve ser feito com cuidado para assegurar que os BACs linearizados são isentos de RNase. Cada um dos dois BACs linearizados serviu como molde cDNA para a transcrição run-off com a ARN-polimerase SP6 em presença do m ^{7 G} (5 ') ppp (5') Um análogo cap. A integridade dos RNAs sintéticos foi mostrado através da execução aliquotas das duas misturas de reacção de transcrição em um gel de agarose a 0,6%, juntamente com uma referência de 1 kb escada de ADN (Figura 5B). Neste ensaio simples, a principal banda de ARN proeminente sempre migrado apenas abaixo dos 3 kb referência banda de DNA e parecia estar afiado. No entanto, o RNA degradado teria uma aparência manchada no mesmo gel.

Um ensaio centro infecciosa é o padrão ouro para determinar a infecciosidade específica dos RNAs sintéticos. Este ensaio foi realizado por electroporating células BHK-21 com amostras de ARN, semeando alíquotas iguais de 10 vezes de células electroporadas diluídos em série em placas de 6 poços contendo naive células BHK-21 (3 x 10 ⁵ células / poço), e da sobreposição de agarose sobre as monocamadas de células. Após incubação durante 4 dias, as células sobreviventes foram fixadas com formol e coradas com violeta de cristal um solution para quantificar o número de centros infecciosos (placas), que corresponde ao número de moléculas de ARN infecciosos entregues nas células (Figura 6A). Uma vez que o molde de ADNc utilizada para a transcrição in vitro foi demonstrado ser não-infeccioso, ^{27 de} um alíquota da mistura de reacção de transcrição foi utilizado directamente para a electroporação. A electroporação é o método preferido para a transfecção de ARN; Alternativamente, os ARN podem ser transfectadas por outros métodos que utilizam lipossomas de DEAE-dextrano e catiónicos. ARN electroporação é muito eficaz, mas "formação de arco" do impulso eléctrico ocorre raramente se sais estão presentes na reacção de electroporação ou, se o cuvete de electroporação é reutilizado. A expressão de proteínas virais em células transf ectadas com ARN foi analisada por ensaios de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho anti-NS1 (Figura 6B). A produção de partículas virais acumulados nos sobrenadantes de células transfectadas com ARN foi umalyzed por ensaios de placas (Figura 6C). Os resultados destas experiências mostram claramente que os RNAs sintéticos derivados de ADNc infeccioso são permissivas em células BHK-21, gerando um título elevado de vírus recombinantes.

Oligonucleotide	Sequência A (5 'para 3')	Posição b	Polaridade
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisense
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	Sentido
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisense
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	FormigaiSense
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Sentido
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisense
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisense
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Sentido
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisense
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10.952-10.977	Antisense
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Sentido
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10.956-10.977	Antisense
SP6F	cataccccgcgtattcccac ta		Sentido
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	Antisense
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	Sentido
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisense
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Sentido
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisense
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Sentido
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisense
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10.670-10.694	Sentido
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10.954-10.977	Antisense
uma sequência JEV são mostrados em letras maiúsculas, e as sequências BAC são indicados em letras minúsculas. posição b Nucleotide refere-se à sequência completa do genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acesso Genbank JN604986).

Tabela 1: Os oligonucleótidos utilizados para a síntese de ADNc, amplificação por PCR, e mutagénese de BAC.

Figura 1.0; Estratégia para a construção de um ADNc de comprimento completo do JEV SA ₁₄ -14-2 como um BAC (A) Isolamento de RNA viral a partir de partículas de JEV.. É mostrado um diagrama esquemático do ARN genómico de JEV SA ₁₄ -14-2. (B) Síntese de quatro fragmentos de ADNc que se sobrepõem (F1 a F4) que cobre todo o genoma viral. (C) A subclonagem de fragmentos de ADNc que se sobrepõem quatro num vector BAC, criando pBAC / F1 para pBAC / F4. (D) A modificação dos cDNAs clonados para transcrição run-off in vitro. pBAC / F1 ^SP6 é um derivado de pBAC / F1 que contém a sequência do promotor SP6 a montante da extremidade 5 'virai. pBAC / F3 ^KO é um derivado de pBAC / F3 que contém uma mutação silenciosa ponto (A ⁹¹³⁴ → t, asterisco). pBAC / F4 ^RO é um derivado de pBAC / F4 que contém um local artificial Xbal de escoamento a jusante da extremidade 3 'virai. (E strong>) O conjunto inclui um full-length _SA 14 -14-2 BAC (pBAC / _SA 14 -14-2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Síntese de quatro fragmentos de cDNA sobrepostas (F1 a F4) que mede o RNA genómico de tamanho completo de JEV _SA 14 -14-2. Os quatro produtos de RT-PCR são avaliados por electroforese em gel de agarose a 0,8%. H, 1 kb escada de DNA. Os tamanhos esperados dos quatro fragmentos de cDNA estão indicados na parte inferior da imagem do gel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Purificação de BAC contendo um ADNc de comprimento completo do JEV SA ₁₄ -14-2. O plasmídeo BAC é isolado a partir de E. coli DH10B pelo método de lise alcalina-SDS e ainda purificado por bandagem num gradiente de CsCl-EtBr. Apresentado é um exemplo do gradiente de CsCl-EtBr usando um 16 × 76 milímetros tubo de polipropileno selado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Resumo da recuperação de vírus infecciosos a partir de um de comprimento completo JEV SA ₁₄ -14-2 ADNc montado num BAC. (A) A linearização do modelo de cDNA. O full-length JEV BAC é cortado comXbal e tratado com NBM. (B) Síntese dos transcritos de ARN. O ADNc linear é transcrito pela ARN-polimerase SP6 em presença do m ⁷ G (5 ') ppp (5') Um análogo de tampão. (C) A recuperação do JEVs sintético. Os RNAs transcritos in vitro são transfectados em células BHK-21 por eletroporação, que gera um elevado título de vírus sintético. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Síntese dos ARN por transcrição in vitro utilizando um de comprimento completo JEV BAC como um modelo de cDNA. (A) Produção do corpo inteiro linearizado JEV BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2. Dois clones independentes de pBAC/ SA ₁₄ -14-2 (Cl.1 e CL.2) são linearizados por digestão com Xba I e por tratamento subsequente com NBM. Os BACs linearizados são examinados por electroforese em gel de agarose a 0,8%. (B) A produção dos RNAs sintéticos por transcrição run-off. Cada um dos dois BACs linearizado é utilizado como um molde para a RNA-polimerase SP6 de transcrição run-off. Alíquotas das duas reacções de transcrição são corridos num gel de agarose a 0,6%. M, 1 kb DNA ladder. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. infecciosidade específica dos ARN transcritos a partir de um sintéticos JEV BAC de comprimento completo e a recuperação do vírus sintético. Células BHK-21 electroporadas são falsamente (Mock) ou electroporadas com os transcritos de ARN derivados from cada um dos dois clones independentes de todo o comprimento do JEV BAC (Cl.1 e CL.2). (A) a infectividade de ARN. As células são cobertas com agarose e coradas com violeta de cristal a 4 dias após a transfecção. Infectividade de ARN é determinada por ensaios de centros infecciosos para estimar a quantidade de ARN infeccioso electroporada para dentro das células (painel esquerdo). Além disso, imagens representativas de centros infecciosos são mostradas (painel direito). (B) A expressão de proteína. As células são cultivadas em lâminas de câmara de 4 poços. A expressão de proteína virai em células electroporadas ARN a 20 horas após a transfecção (HPT) é analisada por ensaios de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho anti-NS1 e um primário de cabra conjugado com Cy3 secundário anti-IgG de coelho (vermelho). Os núcleos são contrastadas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (azul). As imagens são sobrepostas em imunofluorescência as suas imagens de contraste de interferência diferencial correspondente. (C) o rendimento virai. As células são cultivadas em 150 pratos mm cultura. A produção de viriões infecciosos acumuladas nos sobrenadantes de cultura de células electroporado RNA em 22 e 40 hpt é examinado por ensaios de placa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo corrente foi utilizado com sucesso para gerar full-length clones de ADNc infecciosos de duas estirpes diferentes (CNU / LP2 ²⁷ e ₁₄ SA -14-2 ²⁸⁾ do JEV, um flavivírus cujo ADNc funcional demonstrou ser inerentemente difícil de construir e propagar por causa da toxicidade da célula hospedeira e a instabilidade genética do ADNc clonado ^8,74-76 Este protocolo envolve três componentes principais:. em primeiro lugar, maximizando a síntese / amplificação de uma cópia fiel ADNc do ARN viral de alta fidelidade utilizando transcriptase reversa / ADN-polimerase; Em segundo lugar, a clonagem da região prM-E viral contendo sequências de codificação tóxicos (dados não publicados) ^74,77,78 em um nível muito baixo número de cópias do vector BAC de cDNA inicial de subclonagem para os passos de comprimento completo de ADNc de montagem final; e em terceiro lugar, utilizando um vector de clonagem BAC que pode acomodar um ADN estranho com uma dimensão média de 120-350 kb, que, aparentemente, ^19-21 tolera maiores ADN InSerts do que os outros vectores de clonagem. Esta abordagem de clonagem será geralmente aplicável a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva, particularmente aqueles com um grande genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Geração de um ADNc de clone infeccioso é um passo chave no desenvolvimento de um sistema de genética inversa de vírus de ARN, especialmente para vírus de ARN de cadeia positiva, porque o seu genoma actua como ARNm viral que é traduzido em proteínas por ribossomas da célula hospedeira. Assim, a replicação virai pode ser iniciada pela introdução de um genoma de comprimento molécula de ARN derivado de ADNc numa célula hospedeiro susceptível. A disponibilidade de um clone infeccioso de cDNA JEV, quando combinado com a tecnologia de ADN recombinante, tem aumentado a compreensão dos vários aspectos do ciclo de vida virai, a nível molecular, tais como a expressão de genes e replicação do genoma ^{73,79. 63,64} Além disso, uma de comprimento completo JEV clone de ADNc tem provado ser uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de vacinas antivirais ²⁸ e vectores de entrega de genes. ^80,81

Tal como acontece com todos os vírus de ARN de cadeia positiva, existem vários passos críticos na construção de um ADNc funcional de confiança para o JEV a partir do qual os ARN altamente infecciosas podem ser sintetizados in vitro. Idealmente, a sequência dos ARN transcritos sintéticos a partir de um clone do ADNc de comprimento completo deve ser idêntico ao do ARN genómico viral, particularmente os 5'- e 3'-terminal de sequências que são necessárias para a iniciação da replicação de ARN viral . ^60-62 No protocolo actual, o autêntico 5'- e 3'- extremidades foram assegurada colocando a sequência de promotor SP6 a montante do primeiro nucleótido adenina do genoma viral e o posicionamento de um local de restrição único artificial Xbal a jusante do último timina nucleótidos do genoma virai, respectivamente. Tampado RNAs sintéticos com o autêntico 5 'e 3' foram produzidos por transcrição de um Xba I-linearizado e tratou-MBN cDNA te run-offmplate utilizando polimerase SP6 ARN preparado com o m ⁷ G (5 ') ppp (5') Um análogo de tampão. Este protocolo pode ser modificado de várias maneiras. Para transcrição in vitro, uma outra polimerase de ARN do bacteriófago (por exemplo, T3 ou T7) pode ser utilizado em conjunto com a sua sequência promotora bem definida. ²⁷ Como um local de escoamento, um local de restrição diferente pode ser utilizada se não está presente em do genoma viral e de ARN sintética se a partir do ADNc linearizado termina com o autêntico extremidade 3 '. A importância da sequência de nucleótidos da extremidade 3 'foi demonstrado por uma diminuição ~ 10 vezes na infectividade de ARN, quando uma ARN sintético contém três ou quatro nucleótidos de vírus não relacionados, na sua extremidade 3'. ²⁷ Em uma reacção de transcrição in vitro, tanto o m ⁷ G (5 ') ppp (5') A e m ⁷ G (5 ') ppp (5') G tampa analógico podem ser utilizados igualmente bem, embora o último lugares um não relacionado nucleótido G adicional a montante do viral 5 '-end, mas issodisso não altera a capacidade de infecção ou replicação de RNA sintético. ²⁷ Além disso, a remoção do molde de ADNc a partir dos transcritos de ARN por digestão com DNase I não é necessário para testes de ARN de infecciosidade, porque o modelo de cDNA em si não é infecciosa. ²⁷

A tecnologia BAC foi agora aplicada à construção de clones de cDNA infecciosos para um punhado de vírus ARN de cadeia positiva, ou seja, dois JEVs, CNU / LP2 ^{27 e} _SA 14 -14-2 ^{28 (tamanho} do genoma, ~ 11 kb); dois vírus da dengue, BR / 90 ^{26 e} NGC ²⁹ (~ 11 kb); o vírus da diarréia viral bovina, SD1 (~ 12 kb); ²⁵ dois vírus da peste suína clássica, C e Paderborn (~ 12 kb); ²⁴ o vírus da doença da fronteira, Gifhorn (~ 12 kb); ²⁴ o vírus suíno síndrome reprodutiva e respiratória , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); ³⁰ o vírus da gastroenterite transmissível, PUR46-MAD (~ 29 kb); ¹⁶ o felino vírus da peritonite infecciosa,DF-2 (~ 29 kb); ³² a grave coronavírus Síndrome Respiratória Aguda, Urbani (~ 30 kb); ⁹ do Oriente Médio respiratória síndrome coronavírus, a EMC / 2012 (~ 30 kb); ¹⁷ eo coronavírus humano, OC43 (~ 31 kb) ³¹ A principal vantagem da utilização de BACs para a construção de cDNA é a elevada estabilidade genética das grandes, 1- ou 2-cópia BAC plasmídeos.; No entanto, a natureza intrínseca da sua número extremamente baixo número de cópias é também uma grande desvantagem, devido a rendimentos muito baixos de DNA de BAC e a consequente redução na pureza do DNA de BAC com respeito à sede de ADN cromossómico. No protocolo atual, o rendimento de DNA BAC é maximizada pela crescente E. coli DH10B transformada com o pBAC BAC infecciosa / _SA 14 -14-2 em um meio rico em nutrientes, 2xYT. Apesar deste esforço, o rendimento médio é de apenas ~ 15 ug de DNA BAC a partir de 500 ml de caldo de 2xYT. Além disso, a pureza do DNA de BAC é melhor conseguido através da utilização de CsCl-EtBr centrifugação de gradiente de densidade para a purificação, Em vez do plasmídeo de isolamento à base de coluna utilizada. No entanto, é importante ter em mente que a E. transformado BAC- coli não deve crescer demais porque pode pôr em perigo a estabilidade genética do cDNA clonado, e um crescimento mais elevado não conduz necessariamente a maiores rendimentos ou DNA BAC maior pureza.

O protocolo descrito aqui é um, e método aerodinâmico eficiente otimizada para a construção e propagação de um full-length cDNA infeccioso clone geneticamente estável como um BAC para JEV, um procedimento que se pensava praticamente impossível. Esta mesma estratégia de clonagem pode também ser aplicado a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva. Em geral, os clones de ADNc infecciosos permitir-nos introduzir uma variedade de mutações (por exemplo, deleções, inserções e mutações pontuais) num genoma de ARN viral para estudar as suas funções biológicas na replicação virai e patogénese. Este sistema de genética inversa à base de ADNc faz com que seja possível desenvolver e TESt vacina e candidatos terapêuticos que visam um factor de virulência (s) de um vírus de ARN de cadeia positiva de interesse particular. Além disso, esta tecnologia de cDNA infeccioso pode também ser utilizado como um vector virai, capaz de expressar um gene estranho (s) de interesse para muitas aplicações na investigação biomédica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Caldo de Clonagem Molecular
2xYT	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radioativo
Tubo de 50 ml	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
Garrafa de 250 ml Beckman	Coulter	356011
Agarose	Lonza	50004
Agarose (Baixo Ponto de Fusão)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	Novo Inglaterra BioLabs	R0575S
Butanol Fisher	Scientific	A399-1
Cloreto de Césio	Fisher Scientific	BP1595-1
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	C2432	Carcinogênico
DE-81 Papel de Filtro	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Brometo de Etídio	Sigma-Aldrich	E7637	Coluna de Filtro Tóxico e altamente mutagênico
(Kit Maxiprep de Plasmídeo)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Ácido Acético Glacial	Sigma-Aldrich	A6283	Glicose
Irritante	Sigma-Aldrich	G5400
Glicogênio	Roche	10901393001
DNA Polimerase de Alta Fidelidade	New England BioLabs	M0491S
Álcool Isoamílico	Sigma-Aldrich	I9392
Isopropanol Inflamável	Amresco	0918	Caldo LB inflamável
	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
Cloreto de lítio	Sigma-Aldrich	L9650
Lisozima	Amresco	0663
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Transcriptase reversa	Life Technologies (Invitrogen)	18080-044
Nuclease de feijão mungo	New England BioLabs	M0250S
Agulha (18G, 20G)	BD	305196, 305175	de risco biológico (resíduos perfurocortantes)
NotI	New England BioLabs	R0189S Oligonucleotídeo
	Integrado DNA	Technologies Síntese
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Fenol (saturado por tampão)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Tóxico e altamente corrosivo
Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico	Life Technologies (Invitrogen)	15593-031	Tóxico e altamente corrosivo
Fenol:Isotiocianato de guanidina	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Tóxico, corrosivo e irritante
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Acetato de Potássio	Amresco	0698
Inibidor de RNase	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
Conjunto rNTP Tubo	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
(16 &vezes; 76 mm)& nbsp;	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Acetato de Sódio	Sigma-Aldrich	S2889
Dodecil Sulfato de Sódio	Amresco	0227
Hidróxido de Sódio	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 RNA Polimerase	Coluna de Rotação New England BioLabs	M0207S
(Kit Miniprep de Plasmídeo)	Life Technologies (Invitrogen)	Seringa K2100-11
	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (levedura)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Nome	Empresa	Número de catálogo<	strong>Comentários
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	12561-049
Tubo Cônico (50 mL)	VWR	21008-242
Cristal Violeta	Prato de Cultura Sigma-Aldrich	C0775
(150 mm)	TPP	93150
Cubeta (Gap de 2 mm)	Aparelho Harvard	450125
Soro Fetal Bovino	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldeído	Sigma-Aldrich	F1635	Glutamina tóxica e cancerígena
	Life Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicilina/Estreptomicina	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato de potássio monobásico	Sigma-Aldrich	P9791
Placa de seis poços	TPP	92006
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato de sódio dibásico	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies ( Gibco)	25200-056
Vitaminas	Sigma-Aldrich	M6895
Nome<	strong>Empresa	Número de Catálogo	Comentários
3. Equipamento
Gel Electrophoresis System	Mupid	MPDEXU-01
CO2 Incubadora	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrífuga de Mesa	Thermo Scientific	ST16R
Electroporator	Harvard Apparatus	ECM 830
Lâmpadas Ultravioleta de Onda Longa (Portátil)	UVP	UVGL-58
Centrífuga de Mesa	Beckman Coulter	368826
Thermocycler	Life Technologies (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Scientific Industries	G-560
Banho-maria	Jeio Tech	WB-10E