Artigo de método

Rápido

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 de setembro de 2015

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um método de hibridização in situ rápido e simplificado, ideal para cérebro com prefixo de paraformaldeído, reduzindo assim a necessidade de etapas complexas prolongadas ao usar tecidos frescos congelados. O método é validado usando a identificação do gene do receptor de serotonina 5-HT2A htr2a em ratos.

Resumo

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3,4-Metilenodioximetanfetamina (MDMA; ecstasy) a toxicidade pode causar alterações específicas da região na expressão do mRNA serotoninérgico devido à síndrome aguda da serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT). Essa hipótese pode ser testada usando hibridização in situ para detectar o gene do receptor de serotonina 5-HT2A htr2a. No passado, esses procedimentos, utilizando ribossonda radioativa, eram difíceis devido ao fluxo de trabalho complicado que precisa de vários dias para ser executado e à dificuldade adicional de que a técnica exigia o uso de tecidos frescos congelados mantidos em um ambiente livre de RNase. Recentemente, o desenvolvimento de sondas curtas de oligonucleotídeos simplificou os procedimentos de hibridização in situ e permitiu o uso de seções cerebrais prefixadas com paraformaldeído, que estão mais amplamente disponíveis em laboratórios. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado usando sondas de oligonucleotídeos não radioativos nos tecidos cerebrais prefixados. As sondas de hibridização usadas para este estudo incluem dapB (um gene bacteriano que codifica a dihidrodipicolinato redutase), ppiB (um gene de manutenção que codifica a peptidilprolil isomerase B) e htr2a (um gene de serotonina que codifica os receptores 5-HT2A). Este método é relativamente simples, barato, reproduzível e requer menos de dois dias para ser concluído.

Introdução

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A síndrome da serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) é um distúrbio neurológico agudo causado por drogas promotoras de 5-HT, como antidepressivos1, enquanto também ocorre em situações de uso de MDMA para fins recreativos2. Os mecanismos moleculares responsáveis por alterações de humor, déficits de aprendizagem e memória que ocorrem em associação com a síndrome aguda não são bem compreendidos3,4. A hibridização in situ é uma poderosa ferramenta de pesquisa que permite a detecção e quantificação de mRNAs específicos expressos potencialmente em um único nível de célula. A maneira convencional de realizar a hibridização in situ é utilizar uma ribossonda marcada com radioatividade que hibridiza especificamente o gene de interesse. No entanto, uma grande desvantagem é que o método requer etapas complicadas e demoradas de preparação e hibridização da sonda, bem como acesso a tecidos frescos congelados mantidos em um ambiente livre de RNase5,6.

As sondas de oligonucleotídeos foram recentemente desenvolvidas para hibridizar fragmentos de RNA mais curtos do que os necessários para ribofróides7. Além disso, as sondas produzem um sinal de fundo baixo sem sacrificar a especificidade8. Esta tecnologia de sonda recém-desenvolvida pode ser usada em hibridização in situ em tecidos cerebrais prefixados com paraformaldeído, comumente disponíveis em laboratórios imunocitoquímicos.

Aqui, descrevemos um protocolo para hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos em cérebro de rato com prefixo de paraformaldeído e comparamos os achados com os observados em um cérebro fresco congelado5,6. Este protocolo é usado para testar a hipótese de que o abuso de substâncias MDMA causa alterações no gene do receptor 5-HT2A htr2a mRNA no cérebro. Iniciou-se o procedimento com tratamento com MDMA seguido de perfusão tecidual com paraformaldeído do animal, hibridização in situ da sonda thr2a e análise dos dados. Observe que dapB (o gene bacteriano que codifica a dihidrodipicolinato redutase) é usado como controle negativo e o ppiB (gene de manutenção que codifica a peptidilprolil isomerase B) como controle positivo.

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Protocolo

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Procedimentos de uso de animais descritos abaixo foram aprovados pelo o cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Ross e Florida Atlantic University. Embora são necessárias técnicas e luvas estéreis, o ambiente livre de RNase não é necessário ao usar este protocolo.

1. Preparação

  1. Preparação de tecidos e de seccionamento
    1. Atribuir ratos aleatoriamente em três grupos: fresca / salina (SAL; 0,9% NaCl), prefixados / SAL e prefixados / 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA; veja detalhes na Tabela 1).
    2. Administrar três doses de 1 ml / kg de Sal e de 10 mg / kg por via intraperitoneal MDMA, respectivamente, para os grupos SAL e MDMA no intervalo de 2 h. Permitir que os animais sobrevivem ao tratamento durante 6 dias.
    3. No dia 7, administrar 100 mg / kg de cetamina em combinação de 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente aos ratos para uma anestesia profunda (ou seja, perda de piscar da córnea e TAil beliscar reflexos).
    4. Para o grupo fresco / SAL, decapitar ratos e remover rapidamente o cérebro para o teste de cérebro fresco (ver detalhes na referência 5).
    5. Para os grupos / MDMA prefixados / SAL e prefixadas, faça um corte ao longo do esterno de cerca de 10 -12 cm e, em seguida, expor a extremidade do esterno.
    6. Segurar o final do esterno com uma pinça hemostática e cortar o diafragma lateralmente em ambos os lados com uma tesoura afiada e em seguida cortado para cima entre as nervuras e paralelo para os pulmões.
    7. Com uma mão, segure a ponta ventral do coração com pequenas pinças. Com a outra mão, perfurar o ventrículo esquerdo com 18 G agulha de seringa (observe o lado do adaptador da agulha está conectada com uma mangueira de silicone em forma de Y para o Sal e paraformaldeído recipientes geladas e bombas peristálticas, ver a referência 9).
    8. Ligar a bomba de SAL ao nível médio do caudal (~ 5 ml / min) e punção do átrio direito com a pinça para permitir o escape de retorno circlação. Manter SAL perfusão durante 30 minutos.
    9. Ligar a bomba de paraformaldeído a nível médio e permitir que o paraformaldeído a 4% em gelo para perfundir o animal durante 30 min.
    10. Remover instrumento perfusão e decapitar o animal. Adicione uma póstero corte através da linha média do crânio, e, em seguida, a aba do crânio para expor a cavidade do crânio 10.
    11. Remover o cérebro com uma espátula a partir da cavidade do crânio e colocar o cérebro em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de paraformaldeído a 4%. Mantenha o cérebro dentro do tubo contendo paraformaldeído a 4 ºC geladeira por 24 horas.
    12. Mover o cérebro para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de solução de sacarose a 30% a 4 ° C durante 3 dias. Finalmente, armazenar o cérebro dentro de sacos de plástico a -80 ° C até utilização.
    13. Monte o cérebro em um mandril com a mídia de incorporação e congelar os meios de comunicação incorporação contendo cérebro em um criostato à temperatura de -26 ºC. Corte o congelou frescoN cérebro em 20 um secções do cérebro e paraformaldeído prefixado em secções de 10 um. Transfira a seção para uma lâmina de microscópio RT tocando o slide para a seção.
    14. Ar seco à TA durante 4 h. Armazenar as lâminas secção de um saco estanque selado a -80 ° C até utilização.
  2. Desidratação
    1. Tome slides da freezer -80 ° C e atribuir seções em um dos três testes: HT2A, PPIB (controle positivo) ou dapB (controle negativo); marca e seções de etiqueta com uma caneta esferográfica (não use um lápis). Submerge lâminas em 100% de álcool à temperatura ambiente durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 5 min numa hotte.
  3. Pré-tratamento
    1. Pipetar 20 ul de reagente de Pré-tratamento (1-inactivação de fosfatase alcalina) para as secções em lâminas. Colocar as lâminas em um trilho da cremalheira num tabuleiro de humidade (note que o tabuleiro é coberto com uma tampa para manter uma elevada humidade para evitar a evaporação a partir da reacção solution).
    2. Agite suavemente a bandeja de umidade num agitador horizontal a uma velocidade baixa para 10 min. Lavar as lâminas duas vezes com água bidestilada (ddH2O) durante 2 min. Mergulhe o slide em uma proveta de 200 ml contendo 150 ml da pré-tratamento-2 reagente (quebra das ligações cruzadas induzidas pela fixação paraformaldeído). Ferver as lâminas por um total de 5 min a 100 ° C (restauração induzida pelo calor da estrutura de ARN 11).
    3. Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min. Colocar as lâminas em álcool a 100% durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 5 min no exaustor de fumos. Utilize uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em torno da área seleccionada na secção de tecido (por exemplo, estruturas não-corticais, incluindo tálamo e hipotálamo, conforme descrito na Figura 2).
    4. Pipeta 10 ml de reagente pré-tratamento-3 (aumentos na penetração de sonda) para cada área selecionada, e cobrir a bandeja de umidade com a tampa. Coloque a bandeja no forno de hibridaçãoequipado com o agitador horizontal e ajustar a temperatura do forno a 40 ° C; agitar suavemente a bandeja para 30 min. Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min.

2. A hibridação e amplificação

  1. Pipeta 10 ml de HTR2A, PPIB e dapB reagentes de sonda, respectivamente, nas áreas selecionadas. Cobrir a bandeja de humidade com a tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite no agitador horizontal definida em uma velocidade baixa. Incubar as lâminas a 40 ° C no forno durante 2 horas.
  2. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul do reagente de amplificação-1 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 30 min.
  3. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-2 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 15 min.
  4. Lavar as lâminas duas vezes wom um tampão de lavagem por 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-3 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 30 min.
  5. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul da amplificação 4-reagente sobre cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 15 min.
  6. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul da amplificação 5-reagente sobre cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min.
  7. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-6 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 15 min. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min.

3. Detecção de Sinais

  1. Pipetar 10 ul do reagente Vermelho para cada área seleccionada (Note-se que o reagente é uma mistura de vermelho e vermelho-B-A com uma proporção de 1:60 e deve ser utilizado immediately). Coloque o slide na bandeja de umidade no agitador horizontal à TA e agitar suavemente a uma velocidade baixa para 10 min.
  2. Lavar as lâminas duas vezes com (ddH2O), durante 10 min. Seque as lâminas a 60 ºC no forno por 15 min. Colocar as lâminas em xileno sob o exaustor durante 5 min. Pipetar 20 ul de meio de montagem à base de xileno em cada área seleccionada e cobrir com uma lamela.

Captura 4. Imagem

  1. Tome microfotografias digitais das áreas selecionadas (por exemplo, o hipotálamo, Figuras 1 e 3) com uma ampliação de 4 × e 20 × lentes objetivas. Salve o arquivo de imagem.

Análise de Partículas 5. Imagem

  1. Arraste e solte o arquivo de imagem para a janela ImageJ principal. Vá para a barra de menu e selecione 'Imagem', próxima escolha 'Tipo' a partir do menu drop-down e selecione '8-bit'.
  2. Selecione 'Ajustar', em seguida, selecione 'Threshold 'para abrir a caixa de diálogo. Ajuste o valor da barra inferior da caixa de diálogo para que o fundo não desejado é removido. Vá para a barra de menu e selecione "Analisar", em seguida, selecione "Analisar Partículas 'para abrir uma segunda caixa de diálogo.
  3. Defina o tamanho de partícula de 10, ao lado selecione "Show apresenta 'e selecione' Mostrar resultados" e "caixas Resumir". Por fim, clique em 'OK' para ver os dados de partículas nas caixas de diálogo.

6. Planilha de Cálculo

  1. Entre os dados para a folha de Excel e calcular a média dos números de partículas no grupo SAL como uma linha de base. Calcula-se a percentagem do nível de cada secção e fazer um gráfico em conformidade (Figura 4).

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Resultados

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Utilizando as sondas de ARN de oligonucleótidos (<25 NT), a hibridação pode ser detectada como pontos vermelhos em células hipotalâmicas preparados a partir dos cérebros congelados prefixado-paraformaldeído e frescas. As moléculas de mRNA HTR2A estão presentes em algumas células (indicadas pelas setas sólidas), mas não outros (setas abertas). Observou-se que não existe qualquer diferença entre o os tecidos congelados frescos-prefixo e paraformaldeído (Figura 1). Uma hibridização bem sucedida...

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Discussão

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Uma das principais preocupações do teste de hibridização in situ é escolher técnicas apropriadas usadas para preservação de RNA por causa das enzimas RNase. É bem sabido que essas enzimas estão amplamente presentes nas células e no ambiente, o que pode afetar os resultados. No entanto, a atividade enzimática pode ser rapidamente distinguida pela colocação do tecido na solução de gelo seco/álcool5,12. Embora a preservação rápida seja crítica para a hibridização usando uma ribossonda13, pouco...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pela concessão NIH (R15DA029863), a concessão Florida Atlantic University iniciação científica (M30014) e da Escola de Medicina Veterinária bolsa de investigação da Universidade Ross. Gostaríamos de agradecer ao Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (Rockville, MD) para fornecer (±) 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sonda de controle negativo RNAscope-DapBDiagnóstico celular avançado, INC310098
RNAscope Pré-tratamento 4Diagnóstico celular avançado, INC320046
RNAscope 2.0 HD Kit de reagentes - VermelhoDiagnóstico avançado de células, INC310036
Sonda RNAscope - Rn-PpibDiagnóstico celular avançado, INC313921
Rat Htr2aDiagnóstico celular avançado, INC300031
CriostatoLeicaCM 1850
Agitador horizontalVWR88032-088
Forno de hibridizaçãoThermo Fisher Scientific222000
Superfrost Plus lâmina de microscópioFisher Scientific12-550-15
Caneta hidrofóbicaVectorH-4000
MicroscópioOlympusProvis AX70

Referências

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