Este manuscrito descreve um modelo de roedor para estudar a dor neuropática do trigêmeo. Os métodos descritos incluem procedimentos cirúrgicos para realizar uma lesão de constrição crônica do nervo infraorbital do rato e os testes comportamentais pós-cirúrgicos para medir as mudanças no comportamento espontâneo e evocado que são indicativas de dor persistente e alodinia.
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Artigo de método
Crônica lesão por constrição de Infraorbital Nerve do Rato (Ion-CCI) para o Estudo do trigêmeo Dor neuropática
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os modelos animais são importantes ferramentas para estudar a fisiopatologia e farmacologia da dor neuropática. Este manuscrito descreve os procedimentos cirúrgicos e comportamentais para estudar a dor neuropática trigeminal em ratos. Para atender a especificidade de trigeminais síndromes de dor neuropática, o nervo infra-orbital (ION) é submetido a uma lesão por constrição crónica (CCI) do nervo do ligando frouxamente. Uma abordagem intra-orbital é apresentado aqui para expor e ligar o íon na cavidade orbital. Depois de íon de ligação, os ratos apresentam alterações no comportamento espontâneo e em resposta a von Frey cabelo estimulação que são indicativos de dor persistente e alodinia mecânica. Duas fases pode ser definida no desenvolvimento das mudanças de comportamento. Durante a primeira semana seguinte íon-CCI (fase 1), ratos mostram uma atividade aliciamento rosto aumentou e assimétrica, ou seja, com a lavagem da cara Strokes direcionado principalmente para o território Ion com lesão do nervo. É feita uma distinção entre o rosto grooming comportamento que faz parte de um comportamento corpo preparação mais geral, que permanece em grande parte afetada pelo íon-CCI, e cara preparação que não é antecedida nem seguida de aliciamento corpo, o que é significativamente aumentada após íon-CCI. Durante este período, a capacidade de resposta à estimulação mecânica do território de iões é reduzido. Este hiporeactividade é abruptamente substituído por uma hiper-reatividade extrema pela qual ainda muito fracas intensidades de estímulo provocar comportamento nocifensive (fase 2). As semelhanças fenomenológicas entre estas alterações comportamentais e relataram sinais de dor facial (ou seja, as respostas ao estímulo nocivo da face) sugerem a presença de disestesia / parestesia e alodinia mecânica no território Ion ligado.
Introdução
A lesão dos nervos somatossensoriais na maioria das vezes conduz à perda de sensibilidade. Ele não é muito bem compreendido por que e como, em alguns casos, danos nos nervos periféricos leva à dor crônica. Como resultado, neuropatias dolorosas continuam a ser um desafio para tratar a condição 1 e resultam em reduções substanciais na qualidade de vida dos pacientes 2-3. Os modelos animais são uma ferramenta importante para examinar a eficácia dos medicamentos existentes e recentemente desenvolvidas e identificar os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento e manutenção da dor neuropática. Entre os principais desafios para a investigação dor translacional é identificar e mensurar a dor espontânea em animais (ou seja, fisiológica, manifestações comportamentais ou de outros que indicam a presença de dor em animais que não estão sendo desafiados com estímulos que são agudamente sobrepostas na condição basal do sujeito sondando ). O objetivo geral deste procedimento é o de induzir uma cirurgicamenteA lesão do nervo infra-orbital em um rato que leva ao desenvolvimento de ambos espontânea e evocada nocifensive comportamento que pode ser usado para estudar os mecanismos envolvidos na dor neuropática trigeminal e o seu tratamento.
Dirigido, isolado rosto aliciamento é uma medida única de dor neuropática espontânea em ratos. Após lesão crônica constrição (CCI) do nervo infra-orbital (Ion), os ratos apresentam alterações no comportamento espontâneo e em resposta à estimulação tátil que são indicativos de dor persistente e alodinia mecânica 4. Na sequência de íon-CCI, ratos mostram uma atividade aliciamento rosto aumentou e assimétrica, ou seja, com a lavagem da cara Strokes direcionado principalmente para o território Ion com lesão do nervo. Em contraste com a estimulação nociva da face (por exemplo, a injecção de formalina) 5, não dolorosa distúrbios sensoriais (isto é, corte vibrissas unilateral do nervo infra-orbital do bloqueio anestésico, a aplicação de óleo mineral em vibriSSAE) não, ou apenas muito brevemente (ou seja, os primeiros minutos após o início) induzir uma alteração significativa no comportamento de limpeza cara 6. Concluiu-se que esta preparação anormal depois de íon-CCI é uma manifestação comportamental de espontâneas, sensações fortemente aversivos no território do nervo lesionado. Esse comportamento em ratos íon-CCI carrega forte semelhança com dor espontânea observada em pacientes. Mais estudos identificaram uma diferença importante entre comportamento de limpeza rosto que faz parte de um comportamento de limpeza corpo mais geral (ou seja, "aliciamento rosto durante corpo aliciamento"), que permanece em grande parte afetada pelo íon-CCI, eo rosto nocifensive preparação que não é nem precedida nem seguida de corpo aliciamento (ie, "isolado rosto aliciamento"), que é significativamente aumentada após íon-CCI 7-9. Farmacologicamente, preparação do rosto durante a preparação do corpo constitui uma medição de controle excelente para efeitos não específicos de droga ( por exemplo, sedação) que pode prejudicar a função motora. Movimentos dos membros superiores durante os dois tipos de rosto aliciamento são exatamente os mesmos.
Na sequência de íon-CCI, os ratos também apresentam mudanças em resposta à estimulação tátil que são indicativos de alodinia mecânica 4, 10. Durante a primeira semana (s) depois de íon-CCI, os ratos já não respondem ao tátil leve ou moderada (ie, von Frey estímulos). Este hiporeactividade é então substituído abruptamente por uma hiper-reatividade extrema em que até mesmo muito fracas intensidades de estímulo provocar comportamento nocifensive. O início da hiper-responsividade pode variar entre ratos, mas a maioria dos ratos se tornaram hiperresponsivas após três a quatro semanas de pós-operatório.
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Protocolo
Declaração de ética: Os animais são tratados e cuidados de acordo com as orientações do Comité de Investigação e Questões Éticas da IASP 11. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional.
1. Temas
- Utilizar ratos machos Sprague-Dawley (250-300 g, à chegada).
- Casa ratos nas gaiolas de fundo sólido em uma sala de colônia com uma umidade de 40-60% e um IR de 21 ± 1 ° C.
- Faça água e alimentos disponíveis no libitum.
- Mantenha ratos sob uma invertida 00:12 hr escuro / ciclo de luz (luzes acesas às 20 h).
2. Cirurgia
- Por rato, preparar duas partes de ligadura intestino crómico (5-0) de aproximadamente 6 cm de comprimento e colocá-los em solução salina estéril para evitar a secagem e a tornar-se rígida e quebradiça.
- Anestesiar os animais com pentobarbital (60 mg / kg, ip) e trata-se com atropina (0,1 mg / kg, ip). Monitorar o nível de anestesia, estendendo uma perna e pinching a teia de pele entre os dedos com uma unha para garantir a pressão adequada é aplicada. Certifique-se de que o animal não flexionar seu membro. Se necessário, administrar pentobarbital adicional.
- Raspar a cabeça do rato de modo que uma linha média do couro cabeludo incisão pode ser feita de, aproximadamente, 25 mm, com distâncias iguais anterior e posterior para o centro dos olhos.
- Fixe a cabeça do rato em um quadro estereotáxico ou não fixar a cabeça do rato. Colocar o rato em uma almofada aquecida para manter a temperatura corporal.
- Aplicar pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar danos causados por secagem.
- Esfregue a área cabeça raspada com álcool, em seguida, betadine.
- Faça uma linha média do couro cabeludo incisão, expondo o crânio e do osso nasal.
- Use um microscópio de operação para executar passos 2,9-2,16.
- Dissecar a borda da órbita livre, formado pelo maxilar, frontal, lacrimal e ossos zigomática, utilizando um cotonete e um par de fórceps Dumont. Use o cotonete para assimak-se sangue de possíveis sangramentos.
- Para dar acesso à ION, desviar suavemente o conteúdo orbital com um cotonete de algodão de precisão, tomando cuidado para não esticar o nervo etmoidal anterior, que atravessa superior ao íon. Dissecar o íon livre do tecido conjuntivo circundante, usando um cotonete precisão e um par de fórceps Dumont usando um movimento de propagação. Use o cotonete para absorver o sangue de possíveis sangramentos.
- Para realizar uma ligação, empurrar uma extremidade de um único pedaço de intestino crômico para baixo ao longo do osso frontal, medial à ION e avançar alguns milímetros paralelo e inferior ao do íon. A ligadura é agora realizada no local entre o íon e do osso frontal.
- Deslize a ponta de uma de 45 graus fórceps Dumont em ângulo sob o íon para colocá-lo em estreita proximidade com a ligadura. Suavemente retrair o ION lateralmente para revelar a ligadura e ponta da pinça. Segure a ligadura com a pinça e retirar a pinça lateralmente debaixo da ION.
- Puxe a ligadura da cavidade orbital até que ambas as extremidades da ligadura são mais ou menos equidistantes da ION.
- Faça um "nó corrediço" a partir das duas extremidades da ligadura para permitir o controle perfeito sobre o grau de constrição e deslize o nó contra o ION. Deslize o nó adicional para contrair o Ion de modo que o diâmetro do nervo é reduzido por uma quantidade apenas perceptível. Adicione um nó normais no topo do nó de deslizamento de modo a que a quantidade de constrição permanece constante (isto é, para impedir que o nó de deslizamento fenda).
- Corte as ligaduras de deixar cerca de 2 mm de extremidades livres a partir do nó.
- Repita o mesmo procedimento (etapas 2,11-2,15) para fazer uma segunda ligadura 2 de distância do primeiro.
- Para a cirurgia sham, execute os passos 2,2-2,10.
- Fechar a incisão no couro cabeludo utilizando suturas de poliéster (4-0) e permitir que o rato para recuperar numa almofada aquecida. Não deixe o animal sem supervisão até que ele recuperou contras suficientesciousness para manter decúbito esternal e não devolver o animal para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Para evitar efeitos analgésicos de preferência sobre o desenvolvimento da dor neuropática, não administrar analgesia para dor pós-cirúrgica.
3. Procedimento de Teste Comportamental
- Permitir ratos para se aclimatar por pelo menos 8 dias para as condições de habitação antes do teste pré-operatório.
- Habituar ratos para o procedimento de teste pelo menos uma vez por dia durante três dias antes do teste pré-operatório.
- Conduta testes numa sala escura, com luz fornecida por uma luz vermelha de 60 W suspensa lâmpada 1 m acima do centro da área de teste de iluminação do centro, mas deixando a circunferência fraca e o resto da sala escura.
- Verifique se há ruído de fundo suficiente para diminuir a interferência de estimulação auditiva súbita. Se necessário, forneça ruído branco.
- Observação de comportamento de limpeza rosto
- TRANSPORTES um único rato da colônia para a sala de teste em uma gaiola de plástico coberto, sem roupa de cama. Nota: O ideal é que esta deve ser uma curta viagem com estímulos externos mínimas.
- Coloque o rato em uma coberta, gaiola de plástico transparente, sem roupa de cama (cxlxa: 24 cm x 14 cm x 17 cm) com um backup espelhado na frente de uma câmera de vídeo.
- Adicione uma gravação de 10 minutos o comportamento do animal. Durante a gravação, verifique se o experimentador não está presente na sala de prova.
- Limpar a gaiola de observação antes de colocar o próximo animal.
- Certifique-se o comportamento registrado é analisada por um experimentador que é cego à condição experimental do rato.
- Faça um registro de cada episódio rosto aliciamento durante os 10 min de gravação. Nota: aliciamento de rosto está definido como padrões de movimento em que as patas dianteiras são trazidos em contato com áreas faciais.
- Faça uma distinção entre dois tipos de comportamento rosto grooming. Se uma sequência não é antecedida nem seguida decorpo aliciamento (ou seja, a preparação de uma área do corpo que não seja a face), classificar o episódio como isolado rosto grooming. Se aliciamento corpo é realizada imediatamente antes ou após rosto grooming, classificar o episódio como aliciamento rosto durante a preparação do corpo.
- Determinar o número de episódios rosto grooming.
- Categorizar um período de tempo entre as acções cara aliciamento que não exceda 4 s como um espaço intra-episódio (ou seja, uma pausa entre as acções cara aliciamento dentro de um único episódio).
- Categorizar um período de tempo entre preparação ações cara que exceda 4 s como um espaço inter-episódio (ou seja, uma interrupção completa de ações cara preparação entre dois episódios).
- Testes de estimulação mecânica
- Ratos de transporte em grupos de até 6 animais da colónia para a sala de teste em uma gaiola coberta com roupa de cama. Certifique-se de que esta é uma viagem curta com estímulos externos mínimas.
- Coloque oratos individualmente em gaiolas de plástico transparente com roupa de cama (CxLxA: 24 cm x 14 cm x 17 cm) com uma tampa articulada de modo que possa ser facilmente aberta e fechada.
- Usar uma série graduada de cinco filamentos de von Frey. Nota: A força necessária para dobrar os cabelos é de 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 g e 2.150 g.
- Habituam os ratos para a gaiola de observação e movimentos que alcançam para 10 min. A cada 30 seg, abrir a tampa e suavemente tocar a parede da gaiola com uma vareta de plástico.
- Quando o animal está em um sniffing / nenhum estado locomoção (ou seja, com quatro patas colocado no chão, nem em movimento nem congelação, mas exibindo sniffing comportamento), aplique a primeira cabelos von Frey no território Ion perto do centro da almofada de vibrissas , na pele peluda torno do vibrissas mystacial.
- Conseguir a resposta do animal ao estímulo de pertencer a uma das seguintes categorias de resposta 4.
- Categorizar uma completa falta de resposta comoescore 0.
- Categorizar um estímulo detecção (ou seja, o rato vira a cabeça em direção ao objeto estimulante eo objeto estímulo é, então, explorada) como uma pontuação.
- Categorizar uma reação de retirada (ie., O rato vira a cabeça lentamente ou puxa-o rapidamente para trás quando o estímulo é aplicado, por vezes, um único rosto limpe ipsilateral à área estimulada ocorre) como marcador em 2.
- Categorizar um escape / resposta ataque (ie., O rato evita ainda mais contato com o objeto de estímulo, de forma passiva, movendo seu corpo para longe do objeto estimular a assumir uma posição de agachamento contra a parede da jaula, ou ativamente, atacando o objeto estímulo, tornando- mordendo e agarrando movimentos) como marcador em 3.
- Categorizar rosto assimétrico aliciamento (ou seja, o rato exibe uma série ininterrupta de pelo menos três acidentes vasculares cerebrais face-lavagem voltadas para a área facial estimulada) como nota 4.
- Dentro de cada animal, aplicar Stimuli em uma ordem crescente de intensidade. Depois de uma intensidade do estímulo foi aplicado para um lado, aplicá-lo para o outro lado antes de passar para a próxima intensidade do estímulo. Aleatória a ordem em que os lados ipsilateral e contralateral são estimulados. Note-se que o animal deve estar em um sniffing / nenhum estado locomoção antes de cada estimulação.
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Resultados
Ratos íon-CCI mostram um forte aumento pós-operatório na quantidade de tempo gasto no rosto isolado aliciamento (Figura 1). O aumento picos no final da primeira semana de pós-operatório e em seguida, diminui durante as semanas seguintes. A maioria dos estudos recentes descobriram rosto aliciamento para ser significativamente aumentada por até três semanas. Cara comportamento de limpeza em ratos sujeitos a operação simulada é mais ou menos inalterados.
Ratos íon-CCI também mo...
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Discussão
O aspecto mais interessante do modelo de íon-CCI é que ele fornece uma medida única de (neuropática) dor espontânea, não evocado. A maioria dos estudos com animais de dor neuropática, utilizando modelos do nervo espinhal, abordar exclusivamente comportamentos nocifensive (por exemplo., Vocalização e respostas de retirada), reflectindo a hipersensibilidade a estímulos mecânicos ou térmicos 12. No entanto, a queixa clínica principal em pacientes é dor em curso, não hiperalgesia ou alodinia 13.
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o trabalho que foi feito pelo primeiro autor do modelo IoN-CCI, Bart Vos†.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Categute crômico | Dynek | CG504 | |
| Nembutal (pentobarbital) | Farmácia | ||
| Atropina | Farmácia | ||
| Clippers para pequenos animais - Favorita II | Aesculap | GT104 | |
| Instrumento estereotáxico | Stoelting | 51600 | |
| Pomada oftálmica (Liposic) | Sistema | ||
| Harvard Apparatus | PY8 50-7221-F | ||
| Aplicador de algodão | Farmácia | ||
| Cotonete de precisão | Qosina | 10225 | |
| Microscópio de operação | Kaps | SOM 62 | |
| Dumont # 5 fórceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont fórceps - Pontas micro-embotadas (# 5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Tesouras - pontas | rombasFine Science Tools | 14574-09 | |
| Suturas de poliéster - Mersilene (4-0) | Ethicon | R871H | |
| Câmera de vídeo digital | Sony | HDR-CX330E | |
| Semmes-Weinstein Von Frey Kit de estesiômetro | Stoelting | 58011 |
Referências
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Reimpressões e permissões
