Desvendando Aceleração Entropic Taxa Induzida por solventes Dynamics na membrana Enzimas

Resumo

Os canais para o transporte de moléculas de água em enzimas influenciar local solvatação e catálise activa. Aqui apresentamos um protocolo para a engenharia de estes motivos catalíticos adicionais com base em modelagem computacional silico e experimentos. Isto irá melhorar a nossa compreensão da influência da dinâmica de solventes na catálise enzimática.

Resumo

A catálise enzimática evoluiu em um ambiente aquoso. A influência da dinâmica do solvente na catálise é, no entanto, atualmente pouco compreendida e geralmente negligenciada. O estudo da dinâmica da água em enzimas e as consequências termodinâmicas associadas é altamente complexo e envolveu simulações computacionais, experimentos de ressonância magnética nuclear (RMN) e calorimetria. Os túneis de água que conectam o sítio ativo com o solvente circundante são fundamentais para o deslocamento e a dinâmica do solvente. O protocolo aqui apresentado permite a engenharia desses motivos para o transporte aquático, o que afeta a especificidade, a atividade e a termodinâmica. Ao fornecer uma estrutura biofísica baseada em teoria e experimentos, o método aqui apresentado pode ser usado por pesquisadores sem experiência prévia em modelagem computacional ou química biofísica. O método avançará nossa compreensão da catálise enzimática no nível molecular, medindo as alterações entálpicas e entrópicas associadas à catálise por variantes enzimáticas com túneis de água obstruídos. O protocolo pode ser usado para o estudo de enzimas ligadas à membrana e outros sistemas complexos. Isso aumentará nossa compreensão da importância da reorganização de solventes na catálise, bem como fornecerá novas estratégias catalíticas no design e engenharia de proteínas.

Introdução

A água constitui uma pedra angular para a química da vida ^1. Padrões de água e solvatação de sítios ativos da enzima afetar tanto a entalpia e entropia de ligação ^1,2 e catálise ³ em uma forma altamente complexa que se estende para além do efeito hidrofóbico ^2,3 ligando. NMR ^4, calorimetria ² e modelagem molecular de proteínas solvatadas foram utilizados para lançar luz sobre o papel das moléculas de água explícitas no fornecimento de uma força motriz para a associação ligando ^5-8, especificidade e atividade ^2,9,10. Apresentamos aqui uma metodologia única para a avaliação experimental do impacto termodinâmico de deslocamento de solvente na catálise enzimática (Figura 1). Nossa estratégia combinada é baseado no uso de simulações de computador em conjunto com a engenharia de enzimas e análise termodinâmico (Figura 1). Isto permite lançar luz adicional sobre o impacto da dinâmica de solventes em catalise, que atualmente é pouco compreendida.

Estabilizando interações entálpicos, fornecidos por ligações de hidrogênio mediada por água em sítios ativos da enzima solvatado, podem ser compensados ​​através de sanções entrópicos ^1. Estes custos entrópica estão associados com a diminuição dos graus de liberdade exibida por moléculas de água confinados no interior das cavidades de proteína, em comparação com a água em grandes quantidades ^5. A liberação de moléculas de água ordenados podem, assim, proporcionar uma força motriz entrópico para a associação ligando ¹ e ³ catálise. Um aspecto chave da dinâmica de solventes é o deslocamento de moléculas de água entre o interior das proteínas e o solvente exterior ^4. As mudanças que a acompanham em energia de ativação, entalpia e entropia ¹¹ não são completamente compreendidos no nível molecular. Ao obstruir túneis individuais responsáveis ​​pelo transporte de água em enzimas, a importância da dinâmica de solventes e a sua contribuição para a activaçãoa energia pode ser avaliada (Figura 1). Além disso, através da realização de um pote ensaios cinéticos a diferentes temperaturas, os parâmetros de activação termodinâmicas relativas dos vários substratos pode ser extraído a partir de um reduzido número de experiências (Figura 1, direita). Nosso método interdisciplinar é validado por enzimas triterpene ciclase complexos ligados à membrana que geram terpenos policíclicos de elevada importância para a vida ^12. O protocolo permite a recuperação de grandes quantidades de proteína da membrana (10-20 mg / L), utilizando um padrão do centrifugador.

Embora enzimas evoluiu em água, o papel do solvente para a promoção da catálise é geralmente negligenciada. Além de dinâmica de proteínas ^13,14 que forma pré-organizados sites ativos com complementaridade eletrostática para o estado de transição ^15, dinâmica da água poderia ser de grande importância para a catálise enzimática eficiente. Forjando várias técnicas interdisciplinares, a nossaobjectivo é facilitar o estudo altamente complexo de dinâmica da água e termodinâmica. Fazendo essas ferramentas mais acessível à comunidade científica vai levar ao desenvolvimento de novas estratégias em engenharia e design enzima proteína para actividades alterados e especificidades.

Protocolo

Modelando 1. In Silico computador

1. Baixe uma estrutura APO da proteína de interesse a partir do banco de dados de proteínas (PDB). Preparar a estrutura através da remoção de excesso de subunidades e, em seguida, adicionando em falta átomos de hidrogénio e solvente explícito usando o "Neutralização celular e p K _{uma previsão"} experiência em YASARA ^16. Para membrana ligada ciclases triterpene, dimensões adequadas da caixa de água são 91x67x77 Å. Ajustar o estado de protonação dos aminoácidos cataliticamente activas manualmente.
   Nota: Se necessário, um análogo de substrato no arquivo PDB pode ser modificado para um substrato real usando a "Editar | Troca | Atom" comando.
2. Minimizar a estrutura pelo comando "Energia de Minimização" usando a suíte campo de força AMBER ^17. Use a abordagem Ewald malha de partículas (PME) ¹⁸ para explicar as interações eletrostáticas de longo alcance. Defina o ponto de corte para van der Waals de acordopara as definições padrão.
   Nota: O comando "Energia de Minimização" remove o stress conformacional por uma minimização curta íngreme descida, em seguida, um recozimento simulado (timestep 2 FSEC, as velocidades atômicas escalados para baixo de 0,9 a cada 10 ^{º passo)} é realizada até que a convergência é atingido (ou seja, a melhoria da energia pelo menos de 0,012 kcal / mole por átomo de passos durante 200).

2. Modelo de site do Active Solvation e Acesso à água

1. Após o recozimento simulado, executar uma trajetória de 20 de dinâmica molecular NSEC (MD) e gerar pelo menos 10 snapshots pelo "File | Simulação Snapshot | Salvar como" comando seguido de "Simulação On". Executar as simulações em um computador padrão, com condições de contorno periódicas no âmbito do conjunto canónico. Manter a temperatura a 298 K utilizando um termostato Berendsen.
2. Prepare os instantâneos obtidos a partir de 2.1 excluindo todas as moléculas de água e ligantes eventuais / substratos utilizando o4; Editar | Apagar | Resíduo "comando Superpose cada instantâneo individualmente no PDB-estrutura original pelo." Superpose | comando Object "para garantir que todas as estruturas compartilham a mesma posição espacial Salve cada snapshot preparado desta forma como uma nova APO. -file (usando o "Arquivo | Salvar como | PDB" de comando).
   Nota: Para os modeladores experientes: Escreva um script para automatizar esse processo de acordo com o modelo dado no Código Complementar Arquivo 1.
3. Use os instantâneos preparados (APO) de 2,2 que foram alinhados em 3D-espaço como entradas para o software CAVER 3.0 ^19. Para a análise de um número limitado de instantâneos, CAVER correr num computador normal. Use de um raio de sonda de 0,7 ^a 19 para assegurar a detecção de túneis que são específicos para o transporte de moléculas de água.
4. Visualize os túneis gerados por CAVER 3.0 em um software gráfico molecular. Para facilitar a visualização dos túneis, use a macro mostrado na Suplementar Código FilE 2.

3. Em Engenharia Enzyme Silico modificar os padrões da água e água Dynamics

1. Identificar os túneis maior classificados de acordo com o cabeçalho "ID" listados no arquivo de saída "summary.txt" gerado a partir do software CAVER 3.0.
2. Identificar os aminoácidos que revestem os túneis com classificação mais alta (3.1) e que exibem uma pequena cadeia lateral apontando para o interior do canal por inspeção visual (utilizando o modelo obtido a partir de 2,4). Identificar as substituições de aminoácidos únicas que irão bloquear o túnel pelo aumento impedimento espacial usando o comando "Trocar Resíduo". Verifique se o túnel está obstruída por inspeção visual e, em seguida, repetindo os passos 1,2-3,1 do protocolo.

4. Expressão dos genes mutados

1. Introduzir mutações no gene do tipo selvagem por mutagénese por PCR utilizando iniciadores que se sobrepõem ^não-20.
2. Adicionar ADN plasmídeo contendo o gene de interesse para o tubos com células competentes de uma estirpe de clonagem adequado e incubar em gelo durante 30 min. Executar uma transformação de choque térmico durante 45 segundos num banho de água com a temperatura ajustada para 42 ° C. Adicionar 500 ul de um meio rico fresco (2YT, 16 g / L de triptona, 10 g / L de extracto de levedura, 5 g / L de NaCl) e incubar a 37 ° C, 200 rpm durante 45 min. Faça uma seleção por plaqueamento das células transformadas em placas de agar suplementado com antibióticos apropriados.
3. Após verificação da sequência de ADN do gene mutante, transformar o ADN de plasmídeo numa estirpe de expressão usando o choque de calor, conforme descrito acima. Para a expressão de membrana ligada adenilato triterpenos, usar BL21 (DE3).
4. Iniciar uma cultura de 5 ml O / N a 37 ° C, da estirpe de expressão em 2YT-meios suplementados com os antibióticos apropriados.
5. Inocular um balão de agitação perplexo 2 L, contendo 300 ml de 2YT-meios suplementados com antibióticos adequados, a uma OD final 0,05-0,09 (medido a 600 nm). Após a indução a uma DO de 0,6-0.8 e a expressão da proteína, congelar o sedimento celular e armazenar a -80 ° C.
   1. Para adenilato triterpenos ligadas à membrana em um vector pD861, induzir com 0,5 a 2 mm ramnose e 4 h de expressão, a 37 ° C para se obter rendimentos elevados de proteína ^21.

5. Membrana de extracção utilizando uma centrífuga normal e Purificação de Proteínas

1. Preparar os seguintes tampões: tampão de ressuspensão (fosfato de potássio 100 mM, pH 7,5 suplementado com inibidores da protease comprimidos), tampão de detergente (1% (v / v) de Triton X-100, fosfato de potássio 50 mM, pH 7,5) e tampão de reacção (0,2 % de Triton X-100, fosfato de potássio 50 mM, pH 7,5).
   1. Para esqualeno ciclases-hopene ou outras enzimas ligadas à membrana, com um óptimo de pH mais baixo, substituir o fosfato de potássio em tampão de ressuspensão com o citrato. Para as enzimas que usam os seguintes tampões: tampão de detergente (1% de Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) e tampão de reacção (0,2% de citrato de Triton-X 100, 60 mM, pH 6,0).
      Nota: Se um His-tag for utilizado para a purificação, complementar o tampão de ressuspensão com 20 mM de imidazol (concentração final).
2. Pesar um sedimento celular congelado em um copo de vidro. Ressuspender as células em tampão de ressuspensão utilizando um homogeneizador a uma concentração final de 0,3 g de células / ml. Lisar as células ressuspensas por ultra-sons com uma amplitude de 80% e um impulso de 1 segundo em 1 segundo e fora. Use três ciclos de repetição de 50 seg cada.
3. Adicionar tampão detergente a uma concentração final de 0,2% (v / v) de detergente. Equilibrar pela mistura a 4 ° C durante 1 h extremidade-sobre-extremidade. Recuperar a fracção de proteína de membrana por guardando o sobrenadante após um único passo de centrifugação a 39.000 xg durante 50 min a 4 ° C.
   Nota: Se purificação His-tag for utilizado, adicionar cerca de 1,5 ml de agarose Ni-NTA células / g e incubar durante 1 h.
4. Executar uma primeira purificaçãopasso por qualquer troca iônica ou His-tag purificação ^21. Suplemento de equilíbrio e os tampões de eluição com 0,2% de Triton X-100. Concentra-se a proteína purificada cinco vezes usando filtro Unidades centrífugas com um corte de 10 kDa.
   Nota: O tamanho das Triton X-100 micelas resulta numa concentração de detergente a uma concentração final de aproximadamente 1%.
5. Finalização de purificação por um passo de polimento de filtração em gel, utilizando a proteína concentrada e uma matriz compatível com uma gama de fraccionamento para proteína globular de 2 x 10 ⁴ x 10 -8 ^6. Utilizar o tampão de reacção como tampão de corrida. Medir a quantidade de proteína purificada usando o kit de ultra Bradford de acordo com o protocolo do fabricante.

6. Cinética

1. Fazer uma nova solução estoque de 5 mM em tampão de substrato de reacção. Obter uma emulsão homogénea por ultra-som em 30% da amplitude de 2-5 min.
2. Equilibrar uma termomisturadorà temperatura de reacção desejada. Verificar a temperatura dentro de um frasco de vidro contendo água com um termómetro externo.
3. Para a cinética de um único substrato, dilui-se o substrato emulsionados em, pelo menos, cinco frascos de vidro para a mesma concentração final de substrato.
   1. Para um pote cinética relativos com vários substratos, preparar pelo menos cinco frascos de vidro idênticos através da mistura de todos os substratos em cada frasco. Para triterpenos hidrofóbicos, usar concentrações finais de substrato na faixa de 10-200 uM.
4. Pré-incubar os frascos de vidro do termomisturador durante 10 min. Inicie a reacção pela adição da enzima. Um volume de reacção total de 1 ml é adequado. Use uma velocidade de agitação de pelo menos 1.200 rpm.
5. Parar as reacções nos diferentes pontos de tempo por adição de 500 uL de acetato de etilo com 100 cravado decanol uM como um padrão de integração.

7. Extracção e análise termodinâmica

1. Extrair as misturas de reacção atravésvórtex e agitação manual, os frascos de vidro vigorosamente durante 1 min. Centrifugar os frascos de vidro a 9.600 xg numa centrífuga de topo de mesa durante 10 min à TA. Transferir a camada superior (fase orgânica) para um tubo vazio. Adicionar mais 500 mL de solvente de extracção para os tubos de reacção e repetir o procedimento de extracção.
2. Secam-se as misturas de reacção extraída _com Na 2 SO _4. Vortex durante 5 segundos e deixar os tubos descansar por 10 min. Executar um passo final de centrifugação a 9.600 xg durante 1 min à temperatura ambiente usando uma centrífuga de topo de mesa. Transferir as amostras extraídas de cromatografia gasosa (GC) frascos para injectáveis.
3. Repetir os passos em 6,1-7,2 para cada variante de enzima de interesse, utilizando, pelo menos, quatro concentrações diferentes do substrato inicial (para a cinética de substrato individuais) e quatro temperaturas diferentes (para ambos os único substrato e cinética competitivos).
4. Executar A análise CG como previamente descrito ^3. Usar uma coluna não-polar para a análise de hydrophobic produtos pentacíclicos. Ajustar a temperatura do forno inicial até 120 ° C e utilizar um gradiente de temperatura de 5 ° C / min, dependendo dos produtos e a coluna.
5. Integrar as áreas de pico do produto (s) e transformar as áreas dos picos de produto para as concentrações de produtos correspondentes, utilizando a área do padrão de integração (correspondente a 100 uM). Traça-se a concentração de cada produto ([P]) versus o tempo de reacção (t). Realizar regressão linear dos pontos de dados correspondentes a conversão inferior a 10%. A velocidade de reacção inicial (V ₀₎ é dada pela inclinação da linha ajustada de acordo com:
   
   Nota: Para um pote cinéticas relativas com vários substratos, ₀ V é a velocidade inicial de um substrato particular, sob a influência de outros substratos.
6. Para cinética de substratos individuais, lote V ₀ / [E] em função das concentrações de substrato correspondentes. A aparente _k cat / K _M valor é dada pela inclinação da parte linear do gráfico de acordo com:
   
   [S] é a concentração de substrato e [E] a concentração de enzima utilizada na transformação _k cat. / K _M equivale à constante catalítica sobre a constante de Michaelis. Repetir a análise para cada temperatura e cada variante de enzima.
7. Para cinética de substratos individuais, realizar uma análise termodinâmico de acordo com a teoria do estado de transição ²²
   
   K _{b é a} constante de Boltzmann, h a constante de Planck, T a temperatura em Kelvin, e R a constante dos gases. Realize uma análise de regressão linear da trama de ln ((k _{cat / K M) / ((K b * T) / H))) em função de 1 / T. A entalpia de activação (Δ ^‡ H) é dada por (-slope) * R e a entropia de activação (Δ ^‡ S) é dada por (intercepto) * R.
   Nota: Da mesma forma, uma análise de saturação sob a concentração do substrato pode ser realizada utilizando como kcat taxa constante na equação 3.}
8. Para um pote cinética relativos com vários substratos, obtenha o parente aparente
   k _{cat /} K _{m de} valores ^23:
   _(K cat / K _{M) A / (k} cat / K _{M) B} = _{0 V, / V 0, B} * [B] / [A] (4)
   para os quais _{0 V, A refere-se} à taxa inicial de substrato A em competição com o substrato B.
9. Por um pot-ki relativanetics com vários substratos, obter os parâmetros termodinâmicos relativos de activação de B, em comparação com uma referência como, por regressão não-linear:
   
10. Calcular os parâmetros de ativação absolutos de substrato B da entalpia e entropia de ativação de referência composto A:
    

Resultados

A importância da dinâmica da água em catálise enzimática polycyclization está implicado por análise in silico e visualização posterior de túneis detectados (usando o script no Código Complementar arquivo 2). Seguindo a secção 3 do protocolo, S168 é encontrado para ser um resíduo de aminoácido "hot spot" revestem um dos túneis da enzima ciclase triterpene de Alicyclobacillus acidocaldarius (Figura 1, centro-esquerda). Ao introduzir a mutação S168F in silico, o túnel está obstruído como visto por inspecção visual (Figura 1, canto inferior esquerdo).

A velocidade de reacção para a formação de produtos policíclicos indicadas pela enzima ciclase é triterpeno altamente sensíveis à temperatura (Figura 2A). Seguindo o protocolo (secção 4-7), verifica-se que a aparente _k cat / K _{H exibida pela enzima do tipo selvagem para a formação de produtos pentacíclicos cinquenta vezes aumenta quando a temperatura é elevada até 25 ° C (Figura 2A). Bloqueio de túneis individuais através da introdução de uma mutação de ponto único tem um efeito significativo sobre as absoluta cat aparente k valores determinados experimentalmente K / M, bem como sobre a sua dependência da temperatura (Figura 2A).}

A partir dos parâmetros cinéticos determinados experimentalmente, parcelas termodinâmicas lineares são gerados pela equação 3 seguinte e pela secção 6-7 do protocolo para a cinética de substrato individuais (Figura 2B). As grandes mudanças na entropia e entalpia de ativação observadas para as variantes que abrigam túneis bloqueados implica um papel fundamental para a dinâmica da água em promover a cascata polycyclization (Figura 2C, os cálculos com base na Figura 2B). Além disso, As variantes com túneis de água alterados exibir uma energia livre de Gibbs alterada de ativação ^(‡ Δ G = Δ H ^‡ - T * Δ S ^‡, figura 2B-C). Por exemplo, a 303 K o túnel S168F variante exibe uma energia livre de Gibbs da activação de 14 kcal / mole em comparação com 16 kcal / mol para a enzima de tipo selvagem.

Seguindo o protocolo no capítulo 7, a equação 4 permite o cálculo dos valores _gato aparente k / K _M para substratos adicionais a partir de um pote experimentos cinéticos (Figura 3A). Além disso, uma parcela termodinâmico linear (Figura 3B) pode ser construído através da execução do ensaio de concorrência, em diferentes temperaturas (equação 5). Em analogia com a cinética de substratos individuais, a entalpia de ativação e entropia relativa para substratos adicionais em comparação com um composto de referência são readily acessível a partir da origem e do declive linear da cabe aos dados experimentais. Os valores absolutos de parâmetros termodinâmicos de activação pode ser avaliada a partir da adição aritmética através da utilização de dados termodinâmicos associados com o composto de referência (Equação 6). Usando o protocolo aqui, gerado resultados mostram claramente que a enzima membrana variantes com túneis de água bloqueados exibir fundamentalmente diferentes parâmetros termodinâmicos de ativação para substratos de diferentes tamanhos (Figura 3C).

Figura 1. Resumo do Protocolo:. Em modelagem computacional silico em concerto com design proteína experimental e análise termodinâmica permite uma melhor compreensão da influência da dinâmica de solventes na catálise enzimática favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. parâmetros termodinâmicos de ativação do tipo selvagem e variantes túnel de cinética de substrato de solteiro. (A) Aparente k _{cat /} K _M valores obtidos a partir de dados experimentais e utilizando equações 1 e 2. (B) Análise termodinâmica usando a teoria do estado de transição e ajuste linear dos dados experimentais à equação 3. (C) os parâmetros termodinâmicos de activação calculadas a partir das parcelas em (B). O substrato esqualeno prefolded é mostrado com laços formados / quebrado como linhas pontilhadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. parâmetros termodinâmicos de ativação do tipo selvagem e túnel variantes para diferentes substratos. (A) k Relativa _{cat /} K _M valores obtidos de cinética de um pote por meio da equação 4. (B) parcelas termodinâmicas dos dados cinéticos na diferente temperaturas utilizando a equação 5. parâmetros termodinâmicos absolutos de activação calculados pela equação 6 e utilizando o substrato de esqualeno na Figura 2 como referência (C). Bonds formado / quebrados nos substratos são mostrados como linhas pontilhadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os passos mais críticos em conseguir dados experimentais termodinâmicos de alta qualidade para o tipo selvagem de enzimas membrana e túnel variantes são: 1) geração do modelo de computador; 2) as proteínas purificadas de forma homogénea; 3) os estoques de substrato emulsificados; 4) controle de temperatura durante a cinética; 5) extracção de misturas reaccionais utilizando um padrão interno.

A geração do modelo de computador é muito facilitada pelo uso de um software com uma interface fácil de usar que suporta uma variedade de plataformas. Assim, este protocolo tem como premissa a suíte de modelagem YASARA ¹⁶ para tornar a nossa estratégia acessível, mesmo para modelar os não-especialistas. Um modelo de computador para identificação túnel de água devem, idealmente, ser baseada numa estrutura de cristal da enzima de interesse ^24. Para este efeito, a grande variedade de estruturas cristalinas disponíveis no banco de dados de proteínas é muito benéfico. Em nossa experiência, um aspecto fundamental na preparação bem sucedida de TEMplacas de identificação túnel é manter águas cristalográficas. É de igual importância para usar uma caixa de enzima solvatado ao realizar simulações de dinâmica molecular, que podem ser executados em um computador normal. O ciclase triterpene de Alicyclobacillus acidocaldarius é estável em água durante as simulações ^MD 3. No entanto, mantendo detergentes cristalográficos e / ou da membrana celular usando imita seria, talvez, ser necessária para enzimas potencialmente instáveis ​​para permitir a simulação MD prolongados. Prevê-se que a estrutura de cristal minimizado de alvos altamente exigentes poderia proporcionar importante visão mecanicista utilizando o protocolo, embora isto não capturar aspectos dinâmicos de organização do túnel.

CAVER ¹⁹ no modo básico, com um único ou um número limitado de instantâneos como entrada, podem ser usados ​​por não-especialistas em um laptop padrão. Com base na nossa experiência ^3, túneis com um raio de gargalo (ou seja, o raiono ponto mais estreito) menor do que 1 a pode ser altamente relevante para a água, especialmente se as moléculas de água cristalográficas residem dentro do túnel previsto (Figura 1, centro-esquerda). Por outro lado, um maior raio de gargalo poderia implicar um túnel para o transporte do substrato dentro e para fora do local activo ^10. O script no Código Complementar 2 do arquivo pode ser usado por não-especialistas para a visualização dos túneis previstos. Experiências futuras irá revelar se modelos de homologia serão de resolução suficientemente alta para permitir o estudo atomizado de redes de água e dinâmicas. Lançando luz sobre como realizar simulações de dinâmica molecular, com e sem um ligando presente no sítio ativo, influencia o processo de identificação do túnel também seria de importância.

Cinética de proteínas de membrana pode constituir um desafio formidável ^25. O protocolo aqui baseia-se num protocolo de extracção simples de membranapara se obter a enzima da membrana, sem o uso de equipamento caro, tal como uma ultracentrífuga. A utilização de filtração em gel como um passo final de polimento remove partículas potenciais de membrana residual e permite a definição de um ambiente de detergente adequado ^25.

Um aspecto essencial na obtenção de resultados reprodutíveis cinéticos a partir do protocolo é a de emulsionar a solução stock de substrato por meio de ultra-sons. Vórtex simples de substratos hidrofóbicos diluídos no tampão de reacção dá-substrato misturas de detergentes não homogéneos. A pipetagem das soluções de substrato não-emulsionados leva a concentrações irreproduzíveis (confirmada por GC quantitativa), que impede a determinação exata das taxas iniciais. Em contraste, a pipetagem das soluções de reserva apropriadamente emulsionadas deve resultar em análise de regressão linear das taxas iniciais com R ² na gama de 0,98-0,99. Outro aspecto importante de substratos hidrófobos é o substrato solubilidade aparentee disponibilidade nas misturas substrato detergentes. De facto, não foi possível saturar a ciclase de esqualeno triterpeno com o substrato de referência. Por esta razão aparente k _{cat /} K _M valores são aqui apresentados, que poderia conter contribuições de ambos vinculativos e química. No entanto, demonstrou-se que a química é limitadora da velocidade para _k cat / K _{M para a} cascata polycyclization conduzida por adenilato triterpenos ^3.

É de grande importância para verificar a temperatura real dentro de um frasco de vidro de reacção com um termómetro externo. Ainda assim, ajustes lineares podem ser mais pobres para as variantes com constantes essencial aparente k _{cat /} K _M valores em diferentes temperaturas. Esta é forçada para a variante S168F aqui (Figura 2A) com uma entalpia de activação próximo de zero (Figura 2B e 2C). Muito small mudanças de temperatura-dependentes em aparente k _cat / K _M, poderia induzir a incerteza na entropia activação observada Δ ^‡ S (ou seja, a intercepção nas parcelas lineares na Figura 2B). Em princípio, a entropia de activação observado também pode ser afectada por uma abundância de enzimas activas diferentes para diferentes variantes, as quais não seriam detectados medindo a concentração de proteína. Espera-se que os erros experimentais são reduzidas quando a mistura de vários substratos em uma panela. Isto porque todos os diferentes substratos de interagir com a mesma quantidade de enzima nestas circunstâncias (equação 4). A utilização de um solvente de extracção enriquecida com um padrão interno é importante para ter em conta diferenças durante a extracção e / ou GC-injecção.

Teoria do estado de transição tem sido usado com sucesso em ^{26 de} enzimologia. Este quadro teórico importante foi originalmente desvolvido para unimoleculares reacções em fase gasosa. No entanto, tem sido demonstrado que as enzimas funcionam principalmente através da redução da barreira de energia de activação ²⁶ clássica. O coeficiente de transmissão assumido como sendo um aqui poderia afectar a entalpia de activação medidos e / ou entropia. A contribuição de encapsulamento, e outros efeitos não-clássicos tais como recruzando do estado de transição, pode contribuir aproximadamente 1000 vezes a catálise ²⁶ correspondente a aproximadamente 4 kcal / mol em energia. Pode ser visto que a entropia de activação exibida pela enzima de tipo selvagem (16 kcal / mol a 328 K, Figura 2C) é muito maior do que tais efeitos não clássicos causadas por um coeficiente de transmissão não-uniforme. A incidência do coeficiente de transmissão deve diminuir ao comparar parâmetros termodinâmicos de ativação para o tipo de túnel e as variantes selvagens usando o protocolo.

O Gibbs energia livre de ativação ^(‡ Δ G) é composed de ambos um entálpica (Δ H ^‡) e um entrópica (- T * Δ S ^‡) prazo. Reorganização solvente em enzimas durante a catálise pode influenciar ambos os parâmetros. Se espera que o presente protocolo para facilitar o estudo desses fenômenos reunindo uma caixa de ferramentas de ferramentas computacionais relevantes e de fácil utilização in silico com o quadro experimental biofísica necessário. Prevê-se que o método seja útil para o estudo de uma grande variedade de processos enzimáticos, incluindo catálise por enzimas ligadas a membranas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
YASARA	YASARA Biosciences	http://www.yasara.org/	Programa de modelagem e simulação molecular
CAÇADOR	CaverSoft	http://caver.cz/	Ferramenta para análise de túneis em proteínas, licença gratuita para uso académico
Bradford Ultra	Expedeon	BFU1L, BFU05L	Quantificação de proteínas em soluções contendo até 1% de detergente
Homogeneizador Potter-Elvehjem	VWR	432-0205, 432-0217	Homogeneização de pellets de células congeladas
Comprimidos de cocktail inibidores de protease	Roche	4693159001	Unidades de
Filtro Centrífugo	Millipore	UFC901008	Unidades de filtro centrífugo para a concentração de proteínas, MWCO 10 kDa
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer para incubação de amostras

Inibidor de Protease