É fundamental em neurobiologia e neurovirologia ter um sistema in vitro confiável e replicável que sirva como um modelo translacional para o que ocorre in vivo em neurônios humanos. Este protocolo descreve como cultivar e diferenciar células de neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios viáveis para uso em aplicações in vitro.
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Artigo de método
A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ter sistemas in vivo e in vitro apropriados que forneçam modelos translacionais para doenças humanas é um aspecto integral da pesquisa em neurobiologia e neurociências. Os modelos experimentais in vitro tradicionais usados em neurobiologia incluem culturas neuronais primárias de ratos e camundongos, linhagens de células de neuroblastoma, incluindo células B35 de rato e Neuro-2A de camundongo, células PC12 de rato e culturas de fatias de curto prazo. Embora muitos pesquisadores confiem nesses modelos, eles carecem de um componente humano e os efeitos experimentais observados podem ser exclusivos das respectivas espécies e podem não ocorrer de forma idêntica em humanos. Além disso, embora essas células sejam neurônios, elas podem ter cariótipos instáveis, tornando seu uso problemático para estudos de expressão gênica e estudos reprodutíveis de sinalização celular. Portanto, é importante desenvolver modelos mais consistentes de doenças neurológicas humanas.
O procedimento a seguir descreve um método reprodutível e fácil de seguir para obter culturas neuronais humanas homogêneas e viáveis, diferenciando a linha celular de neuroblastoma humano cromossomicamente estável, SH-SY5Y. Este método integra vários métodos descritos anteriormente1-4 e baseia-se na remoção sequencial do soro do meio. A linha do tempo inclui a falta gradual de soro, com introdução de proteínas da matriz extracelular e fatores neurotróficos. Isso permite que os neurônios se diferenciem, enquanto as células epiteliais são selecionadas, resultando em uma cultura neuronal homogênea. Resultados representativos demonstram a diferenciação bem-sucedida de células de neuroblastoma SH-SY5Y de um fenótipo inicial de células epiteliais para um fenótipo neuronal mais expansivo e ramificado. Este protocolo oferece uma maneira confiável de gerar populações homogêneas de culturas neuronais que podem ser usadas para análises bioquímicas e moleculares subsequentes, o que fornece aos pesquisadores um modelo translacional mais preciso de infecções e doenças humanas.
Introdução
A capacidade de utilizar em sistemas modelo in vitro melhorou substancialmente nos domínios da neurobiologia e as neurociências. Células em cultura fornecer uma plataforma eficiente para caracterizar a funcionalidade de proteínas e mecanismos moleculares subjacentes fenômenos específicos, para entender a patologia de doenças e infecções, e para realizar avaliações preliminares de testes de drogas. In Neurobiology, os principais tipos de modelos de culturas de células neuronais primárias incluem culturas derivadas de ratos e murganhos, e linhas celulares de neuroblastoma, tais como células B35 de rato 5, Neuro-2A 6, células de rato, e cé....
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Protocolo
1. Considerações Gerais
- Veja a Tabela de materiais / equipamentos para uma lista de reagentes necessários. Execute todas as etapas sob condições assépticas rigorosas.
- Use de soro fetal bovino inactivado pelo calor (hiFBS) para todos os meios de comunicação que incluem preparações de FBS. Para aquecer-inactivate, aquecer uma aliquota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invertendo a cada 10 min (ver também a Tabela 1).
Nota: Quando é utilizado FBS sem calor inactivação, o fenótipo epitelial semelhante progride mais rapidamente ao longo culturas de células SH-SY5Y. - Antes de usa....
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Resultados
Neste momento, existem muitos casos na área da neurobiologia e neurovirology onde as células SH-SY5Y indiferenciadas estão sendo usados como um modelo funcional para os neurônios humanos 27-36 e, mais importante, as células indiferenciadas podem não ter fenótipos, tais como a absorção viral óptima 2, que são necessário para a interpretação precisa. É crítico que, ao usar células SH-SY5Y ou qualquer outro sistema neuronal in vitro, as células são apropriadamente diferenciadas em neurónios.......
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Discussão
O protocolo acima fornece um método simples e reprodutível para gerar culturas neuronais humanos homogéneos e viáveis. Este protocolo utiliza técnicas e práticas que integram vários métodos publicados anteriormente 1-4 e tem como objetivo delinear as melhores práticas de cada um. Diferenciação de células SH-SY5Y depende de privação de soro gradual; a adição de ácido retinóico, factores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular; e divisão de série para seleccionar para os neurônios maduros aderentes dif.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Somos gratos pelas contribuições de Yolanda Tafuri na otimização das condições para a diferenciação SH-SY5Y e pelo apoio da Dra. Lynn Enquist, em cujo laboratório este trabalho foi iniciado. Y. Tafuri contribuiu com as imagens mostradas na Figura 3. Este trabalho foi apoiado pelo NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR), Bioinformatics Resource Center (MLS e L. Enquist) e K22 AI095384 (MLS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Consulte Tabela 1 para preparação |
| Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ g) | Consulte Tabela 1 para preparação |
| de AMP cíclico dibutiril (db-cAMP) | Sigma | D0627 | Consulte Tabela 1 para preparação |
| DMSO | ATCC | 4-X-Minimum | |
| Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650-Fetal | |
| Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Consulte Tabela 1 para preparação |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061-Glutamina | |
| Hyclone | SH30034.01-Cloreto de | ||
| potássio (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | Consulte Tabela 1 para preparação |
| Solução de matriz extracelular (ECM) | MaxGelSigma | E0282 | Veja a etapa 11 do protocolo |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049-Penicilina | |
| /Estreptomicina (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122-Ácido | |
| retinóico (RA) | Sigma | R2625 | Deve ser armazenado no escuro a 4 &graus; C porque este reagente é sensível à luz |
| Células SH-SY5Y ATCC | CRL-2266-0.5 | ||
| % Tripsina + EDTA | Life Technologies | 15400-054-Falcon | |
| 35 mm TC pratos | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
Referências
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J.
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Reimpressões e permissões
