Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.
Artigo de método
Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.
Células dendríticas plasmocit�des (PDCs) são poderoso tipo I interferon (IFN-a) que produzem células que são activados em resposta a infecção ou durante as respostas inflamatórias. Infelizmente, estudo da função PDC é prejudicada pela sua baixa freqüência em órgãos linfóides, e os métodos existentes para a geração in vitro DC predominantemente favorecer a produção de CDCs sobre pDCs. Aqui nós apresentamos uma abordagem única para gerar de forma eficiente pDCs de progenitores linfóides comuns (CLPs) in vitro. Especificamente, o protocolo descrito detalhes como purificar os CLPs de medula óssea e geram pDCs por coculturing com AC-6 células alimentadoras irradiadas com y na presença de ligando Flt3. Uma característica única do presente sistema de cultura é que as CLPs migrar sob o AC-6 e as células tornam-se as células formadoras de área de paralelepípedo, um passo crítico para a expansão pDCs. DCs morfologicamente distintas, a saber pDCs e CDCs, foram gerados após cerca de 2 semanas com uma composição de 70-90% pDCs em condições óptimas. Tipicamente, o número de pDCs geradas por este método é cerca de 100 vezes do número de CLPs semeadas. Portanto, este é um novo sistema com o qual gerar robustamente o grande número de pDCs necessárias para facilitar estudos adicionais sobre o desenvolvimento e a função destas células.
As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais, que desempenham um papel importante no controlo da resposta imunitária 1. Enquanto as DCs são heterogéneos, eles podem ser classificados em duas populações, as DCs convencional (CDCs) e DCS plasmocitoides (PDCs) 2,3. Além de órgãos linfóides, CDCs pDCs e também são encontradas em tecidos incluindo o pulmão, intestino, pele e 2. A morfologia dos CDCs e pDCs difere, com CDCs expositoras projeções dendríticos-like e forma de pDCs ser como célula-mais de plasma. Além disso, o DC marcador rato comum, CD11c, é mais altamente expresso em CDCs que em pDCs. Al....
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Murganhos C57BL / 6 de tipo selvagem foram adquiridos a partir do Centro Nacional de Animais de Laboratório (NLAC), Taiwan. Todos os ratinhos foram criados e mantidos sob condições isentas de agentes patogénicos específicos. Protocolos e procedimentos de uso dos animais foram revisadas e aprovadas pelo cuidado e uso de animais Comitê Institucional da National Taiwan University College of Medicine (Permit Number: 20120075). Além disso, os pesquisadores fizeram todos os esforços para reduzir o potencial de dor, sofrimento, angústia ou nos animais durante a realização de experimentos. Todos os procedimentos descritos foram realizados à temperatura ambiente usando luvas.
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Um total de 7 4-6x10 células de MO são tipicamente isoladas a partir de fémures e tíbias de um 6-8 semanas de idade, de tipo selvagem C57BL / 6 mouse. Para resolver CLPs, células totais BM estão manchadas com anticorpos PE-conjugada contra marcadores de linhagem (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119, e MHC-II), anti -C-PerCP-Kit / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analisadas e classificadas com um classificador de células. A estratégia de triagem para CRE é mo.......
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Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para a geração robusta de DCs, e pDCs em particular, a partir de um pequeno número de CLPs. A singularidade deste sistema de cultura é devido ao uso de AC-6, células de uma linha celular de estroma, como alimentadores. Esta abordagem tem sido mostrado para fornecer não só as citocinas, tais como IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, mas também o contacto célula-célula 21, necessário para suportar o desenvolvimento DC. AC-6 células têm sido usados ante.......
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Os autores não têm nada a divulgar.
Somos gratos a Drs. Markus Manz e Irving Weissman para a prestação de reagentes. Reconhecemos também o serviço prestado pela Citometria de Fluxo de Análise e Seleção celular Núcleo Facilidade da Primeira e Segunda laboratório central no National Taiwan University College of Medicine e NTU hospital, respectivamente. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e os Institutos Nacionais de Investigação de Saúde, Taiwan (INDH-EX102-10256SI e INDH-EX103-10256SI).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anti-rato Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | marcador de linhagem |
| Anti-rato NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | marcador de linhagem |
| Anti-rato CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | marcador |
| de linhagem Anti-rato CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | marcador |
| de linhagem Anti-rato B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend | 103208 | marcador de linhagem/FACS |
| Anti-rato CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | marcador de linhagem |
| Anti-rato CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | marcador de linhagem |
| Anti-rato MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | marcador |
| de linhagem Anti-rato Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | marcador |
| de linhagem Anti-rato Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | marcador de linhagem |
| Anti-rato M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| Kit anti-rato c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-rato Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-rato IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-rato CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-rato CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Classificador | |
| de células FACS tubo de classificação | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Análise de fluxo sofrware |
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