Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Resumo

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Resumo

As mitocôndrias do músculo esquelético desempenham um papel específico em muitas patologias de doenças. Como tal, a medição do consumo de oxigênio como indicador da função mitocondrial neste tecido tornou-se mais prevalente. Embora existam muitas tecnologias e ensaios que medem as vias respiratórias mitocondriais em uma variedade de células, tecidos e espécies, atualmente há um vazio na literatura em relação à compilação desses ensaios usando mitocôndrias isoladas do músculo esquelético de camundongos para uso em tecnologias baseadas em microplacas. É importante ressaltar que o uso de ensaios respirométricos baseados em microplacas está crescendo entre os biólogos mitocondriais, pois permite medições de alto rendimento usando quantidades mínimas de mitocôndrias isoladas. Portanto, foi desenvolvida uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas capazes de avaliar mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio em um modelo animal comumente usado. Os métodos aqui apresentados fornecem instruções passo a passo para realizar esses ensaios com uma quantidade ideal de proteína mitocondrial e reagentes e alta precisão, conforme evidenciado pela variação mínima na faixa dinâmica de cada ensaio.

Introdução

O principal papel fisiológico das mitocôndrias do músculo esquelético é produzir ATP a partir de ¹ de fosforilação oxidativa. É importante ressaltar que as mitocôndrias musculares esqueléticas desempenhar um papel específico na capacidade de exercício ^{2, 3} envelhecimento, doença degenerativa ^{4 e} diabetes tipo II ^5. Como o envelhecimento da sociedade, e diabetes Tipo II sendo o ^7º principal causa de morte nos Estados Unidos ^6, a necessidade de métodos para avaliar a função mitocondrial tornou-se cada vez mais prevalente na investigação biomédica ^7,8. Especificamente, a medição do consumo de oxigênio tem utilidade excepcional na avaliação da função mitocondrial, uma vez que representa a função coordenada entre os genomas mitocondriais e nucleares para expressar os componentes funcionais da fosforilação oxidativa ^9.

Várias tecnologias existem que permitem a medição do consumo de oxigénio em células intactas e isolard mitocôndrias ^7-10. Além disso, os ensaios foram desenvolvidos para vários tipos de células e tecidos, e uma variedade de espécies que permitem a medição das vias respiratória mitocondrial e controlo ^9,11,12. No entanto, não existe actualmente um vazio na literatura no que diz respeito à compilação de todos estes ensaios utilizando mitocôndrias isoladas de rato músculo esquelético para utilização em tecnologias de consumo de oxigénio em microplacas. É importante ressaltar que o uso de microplacas ensaios respirométricos está crescendo entre os biólogos mitocondriais e permite medições de alto rendimento, utilizando quantidades mínimas de mitocôndrias isoladas ^9. Portanto, uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos foram desenvolvidos que permitem identificar de onde anomalias e / ou adaptações podem estar ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons (ETC). Além disso, dois ensaios respirométricos em microplacas adicionais foram desenvolvidos que permitem a avaliação da coordenação between o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e do ETC, e entre ß-oxidação eo ETC. É importante ressaltar que os métodos apresentados fornecem uma maneira clara e concisa para medir mudanças mecânicas em função mitocondrial em um modelo animal comumente usados.

Protocolo

NOTA: Este protocolo começa depois de se ter isolado mitocôndrias de músculo esquelético vermelho. As mitocôndrias foram isoladas como descrito anteriormente a partir de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético vermelho ^13. Entre 5 - 10 mg / mL de proteína mitocondrial vai ser atingido a partir desta quantidade de tecido por ressuspensão do sedimento final em mitocondrial ≤50 ul de tampão de isolamento para as mitocôndrias (IBM) 2 (Ver Frisard et ai ^13).

1. Setup

1. Preparar soluções de trabalho (Tabela 1) e uma solução de ensaio mitocondrial (MAS) misturas (Tabela 2) para os ensaios subsequentes.
   Nota: A maior parte da preparação para os ensaios pode ser efectuada previamente, como a maioria das soluções stocks e mas pode ser armazenado.
2. Hidratar um cartucho de ensaio respirométrico em 1 ml de solução de calibração a noite anterior à experiência numa incubadora sem CO ₂ a 37 ° C.
3. No dia da experiência, take fora stocks congelados (substratos e moduladores mitocondriais, mistura MAS, MAS w / o BSA, a Tabela 1) e descongelamento em temperatura de 37 ° C banho ou incubadora.
4. Prepare todas as soluções de substrato (Tabela 3) e injeções (Tabela 4-5) e ajustar o pH como desejado (pH 7,4). Depois de o pH é ajustado, armazenar em gelo.
5. Programa a máquina multi-bem medição do consumo de oxigênio para mistura adequada, esperar, e parâmetros de medida (ver Tabela 6) e fundo do rótulo e poços grupo / condição por entrar pela primeira vez o software de análise, seguido do modo "Standard".
   1. Entre no fórum "Guest" e clique em "Ensaio Wizard". Uma vez no "Ensaio Wizard", clique em "Protocolo" para alterar a mistura, espere, e medir parâmetros. Rotular os poços de fundo sob a "Voltar. Correção "guia e certifique-se de destacar" Faça correcção de fundo ".
   2. Etiqueta conditions primeiro clicando na aba "Grupos & Labels", seguido do separador "Info Grupo". Após esses parâmetros são inseridos, clique em "Finalizar", seguido por "Salvar modelo".

2. O ensaio de Run

1. Coloque as soluções para injecção em um cartucho de teste de ensaio e iniciar a calibração por entrar pela primeira vez o software de análise, seguido por entrar no modo "Standard". Entre no fórum "Convidado". Abra o modelo salvo na etapa 1.5 sob o drive "XF", sob a guia "Modelos". Uma vez aberta, clique em "Start" para iniciar a calibração.
   Nota: O cartucho de teste de ensaio deve ser introduzido na máquina com o canto marcado para o canto inferior esquerdo. Isso leva cerca de 30 min. Tome cuidado para injetar soluções nas portas apropriadas. Injeções na Tabela 4-5 são listados em ordem de carregamento.
2. Gentilmente, mas misture bem o mitochondestoque Ria por agitação da solução com uma pipeta de ponta de 200 ul, seguido por trituração do estoque suavemente com uma pipeta de ponta de 200 mL que tenha tido o seu orifício alargado cortando ~ 3 mm da extremidade da ponta com uma tesoura.
3. Realizar um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) para determinar a concentração de proteína do estoque mitocondrial.
4. Usando a concentração de estoque adquirido a partir do passo 2.3, ressuspender 10 ug de proteína mitocondrial / 200 ul da mistura de substrato de succinato / rotenona (Tabela 3). Ressuspender 14 ug de proteína mitocondrial / 200 ul das misturas de substrato restantes (Isto deve ser feito para cada mistura de substrato) (Tabela 3). Coloque tudo mitocondrial proteína / substrato mistura em gelo.
   Nota: A quantidade óptima de proteína mitocondrial por poço para cada ensaio foi determinado como anteriormente descrito ^9. Determinou-se que o piruvato / malato, palmitoil carnitina / malato, glutamato / malato de umd Os ensaios de fluxo de electrões utiliza 3,5 ug de proteína mitocondrial, enquanto o ensaio de succinato / rotenona utiliza 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço. Portanto, o pesquisador precisa para voltar a suspender proteína mitocondrial suficiente para 4 repetições nesta etapa já que qualquer um de 2,5 mg ou 3,5 mg por 50 ul é carregado por poço (Veja o passo 2.6).
5. Misturar as soluções de mitocôndrias / substrato suavemente, mas completamente por agitação da solução com uma pipeta de ponta de 200 ul, seguido por trituração do estoque suavemente com uma pipeta 200 uL da ponta que tem tido ~ 3 mm da sua extremidade cortada.
6. Colocar uma placa de cultura de células em gelo e em triplicado, carga de 50 ul / poço de cada uma das misturas de mitocôndrias / substrato. Os desenvolvedores do microplacas ensaio respirométrico recomendável deixar um mínimo de dois em branco (sem mitocôndrias) poços, de preferência em ambos os lados na placa de cultura de células.
7. Girar a placa de cultura de células a 2000 g durante 20 min a 4 ° C. Enquanto a placa é Sfixar, aquecer as soluções de substrato num banho de água a 37 ° C.
8. Após a centrifugação é completa, carregar cuidadosamente 450 ul de cada solução de substracto em cima dos respectivos poços (isto é, carregar o piruvato / malato de substrato para os poços que têm mitocôndrias inicialmente ressuspensas nesta solução substrato). Certifique-se de carregar a placa à temperatura ambiente. Nota: poços do branco deve ser carregado com 500 ul de substrato. Poços designados em branco para o ensaio de fluxo de electrões devem ser carregados com o fluxo de electrões do substrato (Piruvato / Malato + FCCP), enquanto que o ensaio em branco juntamente poços podem ser carregados com qualquer substrato de ensaio de acoplamento.
   Nota: Se a realização dos ensaios de fluxo acoplados e eletrônica na mesma placa, o pesquisador deve realocar poços de fundo para os respectivos ensaios após o ensaio de funcionamento está completo utilizando a plataforma "XF Reader" por meio da guia "Instrumento". Uma vez dentro do ambiente "Instrumento", clique em "Administração"guia, seguido por "correcção de fundo". Hit "End Modo Configuração do Instrumento" quando completa. Isto é porque a combinação de ascorbato / TMPD pode consumir _O2, assim, é necessária uma correcção de fundo separada para cada tipo de ensaio.
9. Após a 450 ul de substrato é adicionada a cada poço, ver a camada de mitocôndrias no poço para assegurar as mitocôndrias são dispersos uniformemente em uma única monocamada (ampliação de 20X [Ver Rogers ^9, Figura 4]). Wells que não aparecem para ter uma monocamada distribuído uniformemente pode ser removido post hoc.
10. Depois de verificar a aderência mitocondrial, insira a microplaca no instrumento ensaio respirométrico e iniciar o ensaio executado, clicando em "OK".
    Nota: A calibração do passo 2.1 deve ser concluída antes do prazo começará. Uma vez que o pesquisador clica em "OK", a máquina irá ejetar a placa utilitário que foi utilizado para a calibragem.
    1. Remova a placa de utilidade e colocar a placa de cultura celular que contém a mitocôndria na bandeja. O entalhe azul na placa de cultura celular deve ser colocado no canto inferior esquerdo da bandeja. Clique em "continuar" para iniciar o ensaio de execução.
11. Após a corrida é completa, retire a placa de cultura de células e cartucho pressionando "Eject" na tela.
    1. Uma vez que a placa é ejetado, retire e descarte a placa de cultura de células e cartucho e clique em "Continuar" na tela. A corrida será automaticamente salva como um arquivo .xls no arquivo "Dados".
12. Abra esse arquivo e alterar a exibição de "O2" para "OCR" batendo na seta para baixo sob a "Y1:" marcador.
    1. Próxima mudança "Middle Point" para "Point-to-Point Rates" sob a "Data Rate exibido como:" opção. Clique em "OK" para aplicar estas mudanças.
13. Clique na guia "Modo Grupo Bem" na parte inferior esquerda da tela para poços grupo de condições semelhantes. Por fim, clique no botão "Amostra Média Standard / Error" guia em direção ao centro da tela, à esquerda. Alternativamente, esses comandos podem ser configurado antes do ensaio começa no ajuste "Assistente de Ensaio".
    Nota: Cada condição terá uma média ± desvio padrão para cada taxa exibida e cada condição. Existem medidas tomadas taxa por condição (estado 2 [Coupling] / State3u [Electron Fluxo] respiração seguido por quatro injeções). Use a média da taxa de estado 2 da segunda medição, determinar Estado 4o no ponto mínimo após oligomicina injecção, utilize o ponto máximo de Estado 3 e 3U Estado após ADP e injeção FCCP, respectivamente, e usar o ponto mínimo para Antimicina A respiração induzida Para os ensaios de ligação. Use o ponto máximo para o piruvato / malato induzida respiração 3U Estado, use o mínimoponto para rotenone induzida respiração, usar o ponto máximo para succinato induzida 3U Estado respiração e usar o ponto mínimo para Antimicina A respiração induzida para o ensaio Electron Flow. Todas as experiências foram realizadas 3 vezes e os dados são mostrados os resultados de um traçado representativo.

Resultados

A Figura 1 representa as taxas de consumo de oxigénio (OCR) para o piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, glutamato e / malato ensaios (ensaios de acoplamento). Estes traçados de ensaio são apresentados como taxa de consumo de oxigénio ou OCR, em função do tempo, estão correceted fundo, e são apresentados como as taxas de ponto-a-ponto. Cada painel representa o consumo de oxigênio em diferentes estados mitocondriais, como descrito por acaso e Williams ^14. O primeiro painel representa o consumo de oxigénio basal, ou Estado 2. O segundo painel, após a injecção de ADP, representa máxima acoplado respiração, ou Estado 3. O terceiro painel, após a injecção de oligomicina A (um inibidor de Complexo V), representa a respiração devido ao vazamento de prótons, ou Estado 4o. O quarto painel, após a injeção de FCCP, representa máxima respiração desacoplado, ou 3U Estado. Finalmente, o quinto painel, após a injecção de antimicina A, representa a inibição da respiração oxidativo. Notavelmente, all estados mitocondriais têm desvio padrão mínimo. Isto é devido a uma mistura completa do estoque mitocondrial e as misturas mitocôndrias / substrato, e a realização de uma única monocamada de mitocôndrias Após a centrifugação de aderência (Passo 2.6). Por outro lado, o carregamento mitocôndrias desiguais em cada poço e não atingir uma única monocamada de mitocôndrias no poço da microplaca leva ao aumento do desvio padrão em cada estado como apresentado na Figura 2.

Os traçados em Figura 1 exibição planaltos para cada estado mitocondrial e para cada substrato. O patamar alcançada após dois ciclos de medição sugere boa qualidade mitocondrial e as mitocôndrias que permanece aderida ao poço durante toda a duração do ensaio. Além disso, a obtenção de taxas máximas plateaued pode ser mais desejável uma vez que este permite que o investigador a tomar o OCR média nestes estados mitocondriais, reduzindo assim a tendência que pode ocorrerpor arbitrariamente selecionar um ponto.

A quantidade de mitocôndrias por poço foi determinada por meio de ensaios de optimização. A quantidade óptima de mitocôndrias por poço deverá resultar no estado 2 taxas entre 100-200 pmol / min / cavidade e as taxas de estado 3 <1500 pmol / min / cavidade, uma vez que estes valores estão dentro da alcance de detecção de oxigénio dinâmica do multi-poços de oxigénio máquina de medição de consumo. Carregando demasiada proteína mitocondrial por poço pode resultar em OCRs além da gama dinâmica do instrumento (Figura 3A). A Figura 3 representa o carregamento 3,5 ^ g de proteína mitocondrial por poço (rastreio azul), em comparação com a carga de 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço (vermelho rastreamento) para o ensaio de succinato / rotenona. Carregando demasiada proteína mitocondrial por poço pode também conduzir ao esgotamento do oxigénio dentro da microcâmara do poço, impedindo, assim, uma medição precisa do OCR para cada medição sucessiva ⁹ (Figura 3B </ strong>). Ponto-a-ponto de OCR é a taxa de variação instantânea do OCR. Se plana, o OCR é constante / estável, mas se a diminuir, então pode haver um problema biológico ou técnica. O declínio acentuado em OCR em estado 3 e respiração 3U Estado (Figura 3A) é causado pela mitocôndria esgotar o fornecimento de oxigênio antes do fim da medição (Figura 3B).

A Figura 4 representa OCR em função do tempo para o ensaio de fluxo de electrões. O traçado é corrigida e exibidos como descrito para a Figura 1. O primeiro painel neste ensaio representa respiração 3u Estado em piruvato / malato por meio de I. Complexo O segundo painel, após a injecção de rotenona, representa a inibição do complexo I respiração mediada. O terceiro painel, após a injeção de succinato, representa substrato estimulou 3U Estado com elétrons entrar no ETC no Complexo II (Complexo II respiração mediada). O quarto painel, após a injecção de Antimycin A, representa a inibição de Complexo III e, assim, a respiração total. Finalmente, o quinto painel, após a injecção de ascorbato / TMPD, representa Complexo IV respiração mediada. Similar aos traçados da Figura 1, todos os estados têm mitocondriais desvio padrão mínimo, e cada taxa tem ou quase atingiu um patamar.

Figura 1. Ensaios de acoplamento. (A), 10 mM de piruvato / malato 5 mM, (B) succinato 10 mM / 2 uM rotenona, (C) 40 uM palmitoil carnitina / 1 mM de malato, e (D) glutamato 10 mM / 10 mM malato acoplado mitocondriais traçados ensaio respiração conforme determinado por multi-poços medição do consumo de oxigénio. Os valores são expressos como média ± DP. Proteína mitocondrial carregado por poço foi de 3,5 ug para todos os ensaios excepto succinato / rotenona, que utiliza 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço. Os dados representam n = 3 repetições biológicas emparelhados. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = carbonílico cyanide- 4 - (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = Pyruvate; SUCC = Succinate; ROT = Rotenone; PAL-C = palmitoyl carnitina; GLUT = glutamato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. altamente variável piruvato / malato de Ensaio. Altamente variável 10 mM de piruvato de 5 mm / ensaio malato causada pela mistura incompleta mitocôndrias do estoque mitocondrial no substrato / MAS mistura, levando assim a pró mitocondrial variáveltein carregamento em cada poço. Proteína mitocondrial carregado por poço foi de 3,5 ug. Os dados representam n = 3 repetições biológicas emparelhados. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = carbonílico cyanide- 4 - (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = Pyruvate. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Sobrecarga Mitocondrial Proteína para o Succinate / Rotenone Ensaio. (A) As taxas de consumo de oxigénio fora do intervalo dinâmico da máquina de medição do consumo de oxigénio multi-poços causado pelo carregamento 3,5 ^ g de proteína mitocondrial por poço (rastreio azul), em comparação com a carga de 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço (traçado vermelho). (B ) OxyGen tensão próximos de zero seguinte ADP e injeções FCCP causados ​​pela carga de proteína mitocondrial excessiva (3,5 mg) por poço (traçado azul) em relação ao carregamento de uma quantidade ideal (2,5 mg) de proteína mitocondrial por poço (traçado vermelho). Os dados representam N = 3 repetições biológicas emparelhados por quantidade de proteína mitocondrial. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = carbonílico cyanide- 4 - (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; Anti-A = antimicina A; SUCC = Succinate; ROT = Rotenone; _O 2 = Oxigênio; mm Hg = milímetros de mercúrio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Ensaio de Fluxo de electrões. 5 mM de piruvato / 1 mM de malato + 4 uM FCCP, f electrõesbaixo mitocondrial rastreio tal como determinado por multi-poços medição do consumo de oxigénio ensaio de respiração. Os valores são expressos como média ± DP. Proteína mitocondrial carregado por poço foi de 3,5 ug. Os dados representam n = 3 repetições biológicas emparelhados. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; Anti-A = antimicina A; Asc = ascorbato; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- p fenilenodiamina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagente	Da Concentração	MW	O volume final	Mass Adicionado	Comentários / Descrição
	(H)	(g / mol)	(ml)	(g ou ml)
EGTA, pH 7,2	0,1	380,35	100 ml de 1 M de Tris Base de Dados	3,801 g	Armazenar a 4 ° C
HEPES	1	238.3	250 ml de H2O DIH	59. 57 g	Armazenar a 4 ° C
MgCl2, hexa-hidrato de	1	203,31	250 ml de H2O DIH	50,82 g	Armazenar a 4 ° C
Piruvato pH 7,4	0,1	88.06 (Vem como solução 14,11 M)	40 ml de H2O DIH	0,283 ml de ácido pirúvico	Faça alíquotas de 1 ml e armazenar a -20 ° C, fazer nova a cada duas semanas
Succinato de pH 7,4	0,5	118,09	100 ml de H2O DIH	9,4 g de suácido ccinic	Faça alíquotas de 1 ml e armazenar a -20 ° C
Malato, pH 7,4	0,5	134,09	100 ml de etanol a 95%	6,7 g de ácido málico	Faça 200 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C
TMPD	0,01	164,25	10 ml	0,0164 g	Faça 300 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C; Misturar com uma quantidade equimolar de ascorbato de manter TMPD reduzida
Cloreto de palmitoil-L-carnitina	0,01	436,07	1,14 ml de 95% etanol	0,005 g	Faça 40 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C
A oligomicina	0,006	791,06	0,987 ml de 95% etanol	0,005 g	Faça 20 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C
FCCP	0,01	254,17	3,9 ml de 95% etanol	0,01 g	Faça 40 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C
Rotenone	0,001	394,4	10 ml de etanol a 95%	0,0039 g	Armazenar a -20 ° C
Antimicina A	0,005	548,63	9,12 ml de 95% etanol	0,025 g	Armazenar a -20 ° C
K + ADP	0,5	501,32	3,9 ml de H2O DIH	1,0 g	Armazenar a -20 ° C
Ácido málico, pH 7,4	0,5	134,09	40 ml	2,68 g	Faça 200 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C

Soluções de Stock

Reagente	Da Concentração	Mass Adicionado	Molarity final / Percent
	(H)	(g ou ml)
Sacarose	-	11,98 g	70 mM
Manitol	-	20,04 g	220 mM
Fosfato de potássio monobásico	-	0,34 g	5 mM
MgCl2, hexa-hidrato de	1	2,5 ml	5 mM
HEPES	1	1,0 ml	2 mM
EGTA	0,1	5,0 ml	1 mM
Essencialmente Ácidos Graxos Free- BSA	-	1,0 g	0.20%

. Tabela 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: alíquota de 25 ml e armazenar a -20 ºC * Nota: Excluir BSA para MAS mistura usada para injeções de ensaio.

Substrato Médio	Concentração final	Quantidade de ações (ul)	Quantidade de MAS * (ml)
Pyruvate / Malate	10 mM / 5 mM	Piruvato: 1000	9
		Malate: 100
Succicinate / Rotenone	10 mm / 2 uM	Succinato: 200	10
		Rotenone 20
* Pyruvate / Malato + FCCP	5 mM / 1 mM / 4? M	Piruvato: 500	10
		FCCP: 4
		Malato: 20
Palmitoil-L-carnitina / Malato	40 jiM / 1 mM	Palmitoylcarnitine: Malato 40: 20	10
Glutamato / malato	10 mM / 10 mM	Glutamato: 400	10
		Malato: 200

Tabela 3. Soluções de substrato pH 7,4: Adicione fresco o dia do experimento. * A solução ensaio de escoamento Electron.

td>MAS (ml)

Injeção Médio	Concentração	Quantidade de ações (ul)	Quantidade injectada no cartucho	Concentração final
					(Depois de injectados em placa)
ADP	50 mM	300 ul	3	50 ul	5,0 mM
A oligomicina	20 uM	10 ul	3	55 ul	2,0 mM
FCCP	40 uM	12 ul	3	60 ul	4,0 mM
Antimicina A	40 uM	24 ul	3	65 ul	4,0 mM

< O montante do

Tcapazes 4. As injecções para ensaios acoplados pH 7,4:. Adicione fresco o dia do experimento. * Os ensaios de acoplamento incluem (mas não estão limitados a) piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, glutamato e / malato.

Injeção Médio	Concentração	Quantidade de ações (g ou ul)	Quantidade de MAS (ml)	Quantidade injectada no cartucho	Concentração final (após injetado na placa)
Rotenone	20 uM	60 ul	3	50 ul	2,0 mM
Succinate	50 mM	300 ul	3	55 ul	5,0 mM
Antimicina A	40 uM	24 μ;eu	3	60 ul	4,0 mM
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 ul	3	65 ul	100 uM, 10 mM
		Ascorbato: 0,059 g

Tabela 5. As injecções para Electron Ensaio de Fluxo de pH 7,4:. Adicione fresco no dia do experimento

Comando	Tempo (min)	# De ciclos
Calibrar
Aguarde	10 min (para permitir que a placa para aquecer a partir do passo a aderência)
Misturar	1 minuto	2
Euasure	2 min
Injectar A
Misturar	1 minuto	2
Medida	2 min
Injectar B
Misturar	1 minuto	2
Medida	2 min
Injectar C
Misturar	1 minuto	2
Medida	2 min
Injectar D
Misturar	1 minuto	2
Medida	2 min

Tabela 6. Instrumento Executar protocolo.

Discussão

Os métodos apresentados neste artigo fornecem instruções passo-a-passo para a realização de uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos utilizando mitocôndrias isoladas 75-100 mg de rato músculo esquelético. Estes ensaios podem ser realizados com grande precisão como evidenciado pelo desvio padrão apertado entre poços em triplicado. É importante ressaltar que estes ensaios permitem identificar respirométricos de onde anomalias e / ou adaptações podem estar ocorrendo na ETC, ciclo TCA, via β-oxidação, transportadores de substrato, etc. em um modelo animal comumente usados.

É importante destacar a justificativa para o uso vários combustíveis e inibidores utilizados neste protocolo. O piruvato / malato e glutamato / malato respirométricos ensaios permitem a avaliação de respiração mediada Complexo I, bem como a avaliação dos respectivos transportadores, e, no caso de o glutamato, a desaminase ^15. Alternativamente, a combinação desuccinato / rotenone permite a avaliação de fluxo respiratória mitocondrial através Complexo II da ETC desde rotenone inibe complexo I e succinato fornece elétrons para Complex II através da redução da flavina adenina dinucleotídeo (FADH ₂₎ ^15. Estes ensaios fornecem informações específicas de substrato como a eficiência de acoplamento e respiração máxima. O ensaio de fluxo de electrões é único na medida em que a combinação dos substratos e inibidores permite a avaliação de complexos de múltiplas durante o fluxo respiratório mitocondrial ^9. A mistura de substrato inicial de piruvato / malato + FCCP permite a avaliação da respiração máxima impulsionado por Complexo I, enquanto que a injecção de rotenona seguido por succinato permite a respiração para a avaliação máxima impulsionado por complexo II. A injecção de antimicina A, um inibidor do complexo III, seguindo-se a injecção de ascorbato / TMPD permitir que o para a avaliação da respiração impulsionado por complexo IV uma vez que o ascorbato / TMPD é umdoador de elétrons para citocromo C / Complexo IV. Embora nenhuma informação sobre a eficiência de acoplamento é obtido, o método é ideal para amostras muito pequenas que impedem a execução de vários substratos de forma independente. Finalmente, a utilização de palmitoil carnitina / malato permite a avaliação da coordenação entre β-oxidação e a etc desde o equivalente reduzindo produzido a partir da oxidação do ácido palmítico (β-oxidação) alimentar o ETC através do electrão transferência flavoproteína ^15. Deve notar-se que os ensaios de fluxo de acoplamento de electrões e também poderiam ser usados ​​em conjunto para identificar alterações na função mitocondrial devido a alguma intervenção (tratamento da toxicodependência, manipulação genética).

A elevada precisão alcançadas para estes ensaios é principalmente devido a uma mistura completa das mitocôndrias, quer seja antes da determinação da proteína, ou com as soluções de substrato. Ao longo destas linhas, uma vez que a mitocôndria é resuspendend no solutio substratoNS, que é crítico para misturar esta solução cuidadosamente antes de carregar a placa de cultura celular tal como descrito na etapa 2.2, com uma ponta de pipeta de orifício alargado. A falha em misturar cuidadosamente as mitocôndrias irá conduzir a grande variação dentro do ensaio. Além disso, usando uma pipeta de orifício de ponta estreita vai criar forças de cisalhamento durante a mistura a mitocôndria e aumenta o potencial para danificar as membranas mitocondriais e libertação do citocromo C. O passo de aderência (2.7) é também um passo crítico neste protocolo. A falha para girar a placa de cultura celular carregado longa / suficientemente rápido resultará na adesão incompleta das mitocôndrias para o poço, levando, assim, aumentada a variabilidade entre poços e medições.

O protocolo descrito foi otimizado para incluir: carregar uma quantidade ideal de proteína mitocondrial por poço, utilizando as concentrações / métodos de preparação corretos para fazer soluções de reserva e de substrato, alterando o ensaio de execução para garantir pla estado mitocondrialteaus, ea mistura adequada das ações e mitocondrial / substrato mitocondriais misturas. Antes destes esforços de otimização, os autores encontraram armadilhas no ensaio de execução. A seguir discute métodos de resolução de problemas / modificações que foram úteis na otimização deste protocolo. Com relação à carga ideal, carregamento muito pouco mitocôndrias não vai provocar uma resposta robusta, ao carregar demais mitocôndrias irá esgotar o oxigênio dentro do microc�ara e levar a medições imprecisas. Rogers et ^al 9 fornece exemplos de determinação dos montantes de carregamento ideais de mitocôndrias por poço para microplacas ensaios respirométricos. Mais frequentemente, demasiado mitocôndria é carregado por poço como evidenciado pelo estado 2 taxas sobre 100-200 pmol / min / bem e estado 3 Taxas> 1500 pmol / min / poço. Se ocorre ao longo de carregamento, realizar uma experiência com concentrações variáveis ​​de proteína mitocondrial (por exemplo, entre 1 -. 10 ^ g) para induzir OCRs dentro do r dinâmicaange da máquina de medição do consumo de oxigênio. Preparação e colocação das concentrações corretas de substratos e estoques é de extrema importância. Sempre utilizar a forma de ácido de substratos / injecções e ajustar o pH com hidróxido de potássio ou HCl; buffers de sódio / soluções não são recomendados. Além disso, substratos ressuspensão / stocks em DMSO ou etanol 100% resultará em falha de medição ou erro. Certifique-se de usar etanol a 95% onde indicado. É comum para palmitoil carnitina para precipitar para fora do etanol a 95% após o descongelamento do lote congelado, causando, assim, uma grande variabilidade. Certifique-se de aquecer o estoque palmitoyl carnitina e vortex bem antes de usar. Além disso, uma altamente variável piruvato / malato resultado do ensaio pode ser devido ao ser da piruvato> 2 semanas de idade. Certifique-se de refazer alíquotas congeladas de piruvato a cada 2 semanas. A corrida ensaio foi modificado para 2 mínimo de medidas para assegurar planaltos estaduais mitocondriais. Se a observação de exaustão de ADP é desejado, o pesquisador podeestender o tempo de medição sob a guia "Protocolo" no âmbito do fórum "Assistente de Ensaio". Finalmente, uma grande variabilidade ocorre quando o banco de soluções e mitocôndrias mitocondrial mais substrato não são homogeneizadas totalmente antes do carregamento. Se variabilidade entre os poços é alta após o ensaio de funcionamento, certifique-se misturar completamente a solução de substrato antes do próximo experimento. Nunca vortex as soluções mitocôndrias / substrato, em vez agitar, mash, e triturar delicadamente com uma pipeta de ponta orifício alargado.

Existem algumas limitações desta técnica que são dignos de nota. Em primeiro lugar, o número de poços na placa de cultura de células utilizado para estes ensaios é relativamente baixa (isto é., De 24 poços e, pelo menos, 2 designado para poços em branco). Se for desejado para executar todos os 5 desses ensaios sobre um prato, o pesquisador só é capaz de analisar as respostas de um rato de cada vez. No entanto, deve notar-se que 96 de instrumentos também estão disponíveis para higher taxa de transferência. Em segundo lugar, há pontos fortes e fracos inerentes na avaliação da disfunção mitocondrial em mitocôndrias isoladas em comparação com ¹ em células intactas. Algumas fraquezas incluem ter relevância fisiológica menos em comparação com células intactas e induzindo artefatos do processo de isolamento. Finalmente, o sucesso deste método depende da qualidade do processo de isolamento mitocondrial.

Embora alguns destes ensaios foram ambos desenvolvidos em sistemas diferentes ou ter sido validada em outros modelos animais, os métodos aqui apresentados são os primeiros a sintetizar todos os ensaios acima mencionados para a utilização óptima de um multi-poços máquina de medição do consumo de oxigénio utilizando rato músculo esquelético. Mais importante, todos os 5 desses ensaios podem ser realizados com a quantidade de mitocôndrias isoladas de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético do rato, proporcionando assim material de alto rendimento com um mínimo. De grande importância, a capacidade de multi-poçostecnologias de consumo de oxigénio para executar os ensaios com quantidades mínimas de mitocôndrias, combinada com um método de isolamento optimizado, permite ao investigador para executar uma multiplicidade de outras experiências com o resto do tecido do músculo esquelético (por exemplo., Western blots, RT-PCR, ensaios enzimáticos, etc.), que muitas vezes é uma luta com este modelo animal.

Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem instruções passo-a-passo para a realização de uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos usando quantidades mínimas de rato músculo esquelético. Mais importante, os métodos apresentados requerem quantidades mínimas de tecido e mitocôndrias. Uma vez dominado, as técnicas aqui descritas irão permitir que os investigadores a determinar um mecanismo potencial de um composto ou produto do gene mitocondrial no consumo de oxigénio em um modelo animal utilizado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sacarose	Sigma Aldrich	S7903	Loja na RT
D-Manitol	Sigma Aldrich	63559	Loja na RT
Fosfato de potássio monobásico, mínimo 99,0%	Sigma Aldrich	P5379	Loja na RT
Cloreto de magnésio hexahidratado, reagente ACS, 99,0-102,0%	Sigma Aldrich	M9272	Loja na RT
HEPES titulação	mínima de 99,5%Loja Sigma Aldrich	H3375	na RT
EGTA	Loja Sigma Aldrich	E4378	na RT
Essentially Fatty	Loja Sigma Aldrich	A6003	em 4 °
Livre de Ácido C- Ácido Pirúvico BSA
, 98%	Sigma Aldrich	107360	Loja em 4 ° C
Ácido Succínico	Sigma Aldrich	S9512	Loja na RT
L(-) Ácido Málico, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Loja na RT
Ácido L-glutâmico	Sigma Aldrich	G1251	Loja na RT
N, N, N ′, N ′ -Tetrametil-p-fenilenodiamina	Sigma Aldrich	T7394	Loja na RT
99%, pó [TMPD]
Cloreto de L-carnitina palmitoil	Sigma Aldrich	P1645	Loja em -20 ° C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Loja a -20 ° C
Cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)	Sigma Aldrich	C2920	Armazenar em 2 - 8 &graus; C
fenilhidrazona
≥ 98% (TLC), pó [FCCP]
Antimicina A de streptomyces sp.	Loja Sigma Aldrich	A8674	a -20 ° C
Adenosina 5′-difosfato monopotássio sal desidratado [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Armazenar a -20 &graus; C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Loja na RT
Pierce™ Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Scientific	23225	N/A