Abstract
Onlangs hebben iPSCs aandacht getrokken als een nieuwe bron van cellen voor regeneratieve therapieën. Hoewel de eerste werkwijze voor het iPSCs aangevoerde huidfibroblasten verkregen door invasieve biopsie en retrovirale genoom inbrengen van transgenen zijn er veel pogingen om deze nadelen te vermijden zijn. Humane perifere T-cellen zijn een unieke cel bron voor het genereren van iPSCs. iPSCs afgeleid van T-cellen bevatten herrangschikkingen van het T cel receptor (TCR) genen en zijn een bron van antigen specifieke T-cellen. Daarnaast T-celreceptor omlegging in het genoom heeft het potentieel om afzonderlijke cellijnen label en onderscheid maken tussen getransplanteerde en donorcellen. Voor een veilige klinische toepassing van iPSCs, is het belangrijk om het risico van blootstelling van nieuw gegenereerde iPSCs aan schadelijke agentia minimaliseren. Hoewel foetaal runderserum en voedingscellen essentieel voor pluripotente stamcellen celkweek zijn, verdient het de voorkeur om ze van het kweeksysteem te verwijderen om het risico te verminderenonvoorspelbare pathogeniciteit. Om dit aan te pakken, hebben we een protocol opgesteld voor het genereren iPSCs uit humane perifere T-cellen middels Sendai virus het risico van blootstelling iPSCs op undefined ziekteverwekkers te verminderen. Hoewel de behandeling van Sendai-virus vereist apparatuur met de juiste bioveiligheid niveau Sendai virus infecteert geactiveerde T-cellen zonder genoom inbrengen, maar met een hoog rendement. In dit protocol tonen we het genereren van iPSCs uit humane perifere T-cellen in voedingsvrije met gebruikmaking van een combinatie van geactiveerde T-celkweek en Sendai virus.
Introduction
iPSCs hebben aanzienlijke aandacht getrokken als een baanbrekende bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde 1-3. Tot op heden hebben diverse werkwijzen voor het genereren iPSCs gemeld 4,5. Hiervan iPSCs gegenereerd uit humane T-cellen zijn van bijzonder belang vanwege de minder invasieve methode van celbemonstering 6-8. Bovendien iPSCs afgeleid van T-cellen bevatten herrangschikkingen van het T cel receptor (TCR) genen en derhalve een bron van antigen specifieke T-cellen 9,10. Daarom is het genereren van T-cel afgeleid iPSCs veilig is nuttig voor vordert regeneratieve geneeskunde.
Deze methode is gebaseerd op het concept van het risico van onvoorspelbare pathogeniciteit. Voor een veilige klinische toepassing van iPSCs is het belangrijk om het risico op blootstelling aan pathogenen 11. Eerder in verschillende kweeksystemen van pluripotente stamcellen hebben foetaal runderserum en voedingscellen gebruikt essentieel reagenss 12. Het wegnemen van beide reagentia uit het kweeksysteem voorkeur dat iPSC genereren om het risico op onvoorspelbare pathogeniciteit verminderen.
Bovendien heeft deze werkwijze het voordeel dat invasieve celbemonstering van patiënten en moeizame bereiding van voedingscellen. Omdat T cel afgeleid iPSCs reeds met succes toegepast bij ziekteonderzoek 13,14, deze werkwijze is ook toepasbaar en nuttig voor het genereren van ziektespecifieke iPSCs van patiënten.
Onder T cel herprogrammering werkwijzen, met het Sendai-virus (SeV) vector een gen voertuig een methode die iPSCs kan genereren met een hoog rendement 7,16. Bovendien, omdat SeV is een enkelstrengs RNA-virus en geen DNA fase nodig voor replicatie, zijn gebruik in iPSC generatie voorkomt het breken van het gastheergenoom 17-19. Daarom hebben we vastgesteld protocollen voor het genereren iPSCs van humane perifere T-cellen in serum-free en voedingsvrije met gebruikmaking van een combinatie van Matrigel, mTeSR medium en SeV vectoren.
Protocol
1. Bereid geactiveerde menselijke T-cellen
- Verzamel 10 ml gehepariniseerd volbloed dat bij een donor door venapunctie.
- Verkrijgen geïnformeerde toestemming van donoren van tevoren venapunctie. Venapunctie moet worden uitgevoerd door gekwalificeerd en opgeleid personeel.
- Handvat verkregen bloedmonsters met steriele apparatuur en na een passende bioveiligheid richtlijnen.
- Verdun 10 ml gehepariniseerd volbloed met 10 ml D-PBS (-).
- Put 15 ml Ficoll-oplossing (Ficoll-Paque PREMIUM) in een nieuwe 50-ml conische buis.
- Laag het 20-ml bloed bereid in stap 1.2 op de Ficoll-oplossing in stap 1,3. Met behulp van een elektrische pipet, laat bloed bereid in stap 1.2 run langzaam langs de binnenwand van de buis. Wees niet naar de bloed-oplossing en Ficoll- oplossing te mengen.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Stel de centrifugale vertraging snelheid "langzaam".
Let op: Na het centrifugeren, een witte dunnelaagje ontstaat tussen een bovenste melkachtig plasma laag en een minder duidelijke Ficoll laag. Deze witte dunne laag bevat mononucleaire cellen. - Breng de laag eenkernige cellen in nieuw 50-ml conische buis met een pipet 1 ml. Wees voorzichtig Ficoll oplossing niet op te nemen.
- Voeg D-PBS (-) aan de mononucleaire cellen tot een totaal volume van 10 ml en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant. Voeg 10 ml D-PBS (-) aan de mononucleaire cellen en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, voeg 1 ml medium KBM502 de verzamelde mononucleaire cellen en telling van de cellen met een hemocytometer. Meer dan 5 x 10 6 mononucleaire cellen kunnen worden verkregen uit 10 ml gehepariniseerd volbloed met behulp van Ficoll passende scheiding.
- Bereid een anti-humaan CD3-antilichaam oplossing met een concentratie van 10 ug / ml in D-PBS (-). Voeg anti-humaan CD3-antilichaam oplossing voor een 6-wells plaat, geniet de brandingace van elk putje en incubeer de schaal bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende ten minste 30 min.
- Verwijder het anti-humaan CD3-antilichaam oplossing uit elk putje en eenmaal wassen met D-PBS (-) net voor de cellen te zaaien.
- Seed mononucleaire cellen die werden bereid in Stap 1,9 bij een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen / cm2 op het anti-humaan CD3-antilichaam beklede 6-putjesplaten in KBM502 medium. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator gedurende 3-7 dagen zonder mediumverversing tot de T-cellen confluentie bereiken. T-cellen in deze periode zijn beide geschorst en hechtende cellen.
2. Infect menselijke T-cellen met SeV Vectoren
- Na 3-7 dagen cultuur, het verzamelen van de geactiveerde T-cellen met bestaande medium door pipetteren. Overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 1 ml vers KBM502 medium. Tel de cellen en de plaat 1.5 x 10 6 cellen (in 2 ml vers medium KBM502) in elk putje van een anti-CD3-antilichaam beklede 6-wells plaat.
- Ontdooi de SeV oplossingen van Oct3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF, en c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF op ijs.
- Voeg de SeV oplossingen die Oct3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF en c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF afzonderlijk aan de putjes, elk bij een multipliciteit van infectie (MOI) 10. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator voor een verdere 24 uur.
3. Verwijder SeV vectoren van menselijke T-cellen
- 24 uur na infectie, het verzamelen van de geïnfecteerde cellen met een pipet. Als er hechtende cellen, kunnen ze gemakkelijk worden losgemaakt ze herhaaldelijk pipetteren en neer. Overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof met de SeV vectoren en voeg 2 ml vers KBM502 medium. Replate cellen in each van de putjes. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator gedurende nog 24 uur.
4. reseed Cellen op een Matrigel Layer
- Bereid basaalmembraan matrix oplossing ontdooien matrix gel (zie de lijst Materialen voor het specifieke merk in deze studie) bij 4 ° C en oplossen van 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12 medium.
Opmerking: Matrix gel (zie de lijst Materialen voor het specifieke merk gebruikt in deze studie) moet ontdooien O / N bij 4 ° C volledig worden ontdooid. Houd het op ijs tot vlak voor gebruik. - Plate 5 ml basaalmembraan matrix oplossing per plaat in 100-mm schalen en laat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min voor het zaaien cellen. Tenminste twee 100-mm schalen zijn nodig voor een experiment.
- Verzamel SeV-geïnfecteerde cellen door pipetteren, overbrengen naar een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 1 ml vers KBM502 medium. Tel het aantal ceLLS met behulp van een hemocytometer, verwijder het basaal membraan matrix-oplossing van 100-mm gerechten bereid in stap 4.2 en plaat 1 x 10 5 en 1 x 10 6 cellen (in 10 ml vers mTeSR gemiddeld) op een 100-mm basaal membraan matrix-gecoat gerechten. Tot slot, gebruik maken van de plaat waarin kolonies gemakkelijk worden geplukt.
- Incubeer de schotel bij 37 ° C in een 5% CO 2 incubator O / N.
- Verander het medium tot 10 ml vlees mTeSR medium elke andere dag.
Opmerking: Ongeveer 20-30 dagen na infectie kolonies die sterk embryonale stamcellen (SER) weergegeven.
5. Vouw T-cel afgeleid iPSCs
- Bereid basaalmembraan matrix oplossing ontdooien matrix gel (zie de lijst Materialen voor het specifieke merk in deze studie) bij 4 ° C en oplossen van 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12 medium.
- Plaat 1 ml van de basaalmembraan matrix oplossing per putje in een 6-wells plaat en laat bij kamertemperatuur gedurendetenminste 30 min alvorens ze kolonies.
- Vul een 96-wells plaat met 20 ul mTeSR medium per putje.
- Selecteer kolonies die SER onder de stereomicroscoop met een pipet 20 ul lijken.
Opmerking: De kolonies van de SER en iPSCs zijn rond en plat, zoals weergegeven in figuur 1B. - Transfer geselecteerde kolonies in de 96-well plaat gevuld met mTeSR medium in stap 5,3.
- Voeg 200 ul mTeSR medium aan elk putje en zorgvuldig pipet op en neer om de kolonie breken in kleine klontjes onder de stereomicroscoop met een pipet 200 ul. Verwijder de basaalmembraan matrix oplossing uit de goed bereid in 5,2 en zet elke kolonie in een putje van de basaalmembraan matrix beklede 6-wells plaat met 2 ml mTeSR medium per putje.
- Verander de middellange tot 2 ml vlees mTeSR medium elke andere dag.
6. Zorg voor T-cel afgeleid iPSCs
De T-cel afgeleide iPSCs kan worden gehandhaafden opgeslagen met behulp van dezelfde technieken als voor menselijke iPSCs en menselijke SER. Zodra iPSC kolonies groeien, uit te breiden hen in grotere gerechten door het herhalen van dezelfde procedure.
- Wijzig de mTeSR medium om de 1-2 dagen.
- Wanneer de kolonies confluent elke 5-7 dagen, passage van de cellen met behulp dissociatie oplossing voor menselijke iPSCs en menselijke SER's volgens de instructies van de fabrikant.
Representative Results
Met behulp van dit protocol, kunnen gebruikers iPSCs uit menselijke perifere T-cellen stabiel te genereren. iPSC opwekking van T-cellen met SeV en matrigel vertoonden ongeveer 0,002% -. 0,005% rendement cel herprogrammering tussen verschillende donoren zaken en SeV werden niet gedetecteerd na een aantal passages 16 Figuur 1A toont een schema van het protocol voor het genereren van T cel-afgeleide iPSCs in feeder-vrije omstandigheden met behulp matrigel en mTeSR medium. Ongeveer 20-30 dagen na infectie met SeV worden iPSC kolonies te herkennen aan hun ESC kolonie-achtige morfologie (Figuur 1B). Immunofluorescentiekleuring onthulde uiting van typische pluripotente cel markers (NANOG, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, en TRA-1-81) in T-cel afgeleid iPSCs gegenereerd onder-feeder vrije omstandigheden (figuur 1C).
"Width =" 700 "/>
Figuur 1. (A): Een schema van het protocol voor herprogrammering T cellen onder voedingsvrije omstandigheden in deze studie. (B): Een normale ESC-achtige iPSC kolonie op dag 27 na bloedafname onder feeder vrije omstandigheden. (C): ALP kleuring en immunofluorescentiekleuring voor pluripotentie en oppervlakte markers (NANOG, Oct3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, en TRA-1-81) in T-cel afgeleid iPSCs gegenereerd onder-feeder-vrije omstandigheden. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende of tegenstrijdige belangen te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi en Rei Ohno van de Keio University School of Medicine voor technische ondersteuning. Dit werk werd deels gefinancierd door een R & D Systems programma ter ondersteuning van het praktische gebruik van de gezondheid van onderzoeksresultaten te versnellen, en de snelweg programma voor de realisatie van de regeneratieve geneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Gonzalez, F., Boue, S., Izpisua Belmonte, J. C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming a la carte. Nat Rev Genet. 12, 231-242 (2011).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8 T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Sampsell-Barron, T. Xeno-free adaptation and culture of human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1001, 81-97 (2013).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Minegishi, Y., et al. Enhanced optineurin E50K-TBK1 interaction evokes protein insolubility and initiates familial primary open-angle glaucoma. Hum Mol Genet. 22, 3559-353367 (2013).
- Tanaka, A., et al. Endothelin-1 induces myofibrillar disarray and contractile vector variability in hypertrophic cardiomyopathy-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Am Heart Assoc. 3, e001263 (2014).
- Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Kishino, Y., et al. Derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells from human peripheral T cells in defined culture conditions. PLoS One. 9, e97397 (2014).
- Masaki, I., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer to vasculature: a new class of efficient gene transfer vector to the vascular system. FASEB J. 15, 1294-1296 (2001).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Ikeda, Y., et al. Recombinant Sendai virus-mediated gene transfer into adult rat retinal tissue: efficient gene transfer by brief exposure. Exp Eye Res. 75, 39-48 (2002).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Iida, A. Sendai virus vector: vector development and its application to health care and biotechnology. Uirusu. 57, 29-36 (2007).
- Yoshida, K., et al. In vivo repopulation of cytoplasmically gene transferred hematopoietic cells by temperature-sensitive mutant of recombinant Sendai viral vector. Biochem Biophys Res Comm. 361, 811-816 (2007).
- Bitzer, M., Armeanu, S., Lauer, U. M., Neubert, W. J. Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system. J Gene Med. 5, 543-553 (2003).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Okano, S., et al. Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes. Gene Ther. 10, 1381-1391 (2003).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genom Proteom Bioinform. 11 (5), 264-274 (2013).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. , (2014).
