Artigo de método

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

DOI:

10.3791/53225

⸱

11 de novembro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Resumo

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Recentemente, iPSCs têm atraído a atenção como uma nova fonte de células para terapias regenerativas. Embora o método para a geração inicial iPSCs invocado fibroblastos dérmicos obtidos por biópsia invasiva e inserção genómico retroviral de transgenes, tem havido muitos esforços no sentido de evitar estas desvantagens. As células T periférico humano são uma fonte de célula exclusivo para gerar iPSCs. iPSCs derivadas de células T contêm rearranjos do receptor de células T (TCR) e os genes são uma fonte de células T específicas de antigénio. Além disso, o rearranjo receptor de células T no genoma tem o potencial para identificar linhas de células individuais e distinguir entre células transplantadas e doadores. Para aplicação clínica segura de iPSCs, é importante minimizar o risco de expor iPSCs recém-gerados a agentes nocivos. Embora as células de soro bovino fetal e de alimentação têm sido essenciais para a cultura de células estaminais pluripotentes, é preferível removê-los a partir do sistema de cultura para reduzir o riscode patogenicidade imprevisível. Para resolver isso, nós estabelecemos um protocolo para gerar iPSCs de células T periférico humano usando vírus Sendai para reduzir o risco de exposição a patógenos iPSCs indefinidos. Embora a manipulação do vírus Sendai requer equipamento com o nível de segurança biológica apropriada, Sendai vírus infecta células T activadas sem inserção do genoma, mas com elevada eficiência. Neste protocolo, demonstramos a geração de iPSCs de células T periférico humano em condições de livre-de alimentação, utilizando uma combinação de cultura de células T ativadas e vírus Sendai.

Introdução

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iPSCs atraíram considerável atenção como uma fonte inovadora de células para a medicina regenerativa 1-3. Até à data, diversos métodos para gerar iPSCs foram relatados 4,5. Entre estes, iPSCs gerado a partir de células T humanas têm sido de particular interesse devido ao método menos invasivo da célula de amostragem 6-8. Além disso, iPSCs derivadas de células T contêm rearranjos do gene receptor de células T (TCR) e são, portanto, uma fonte de células T específicas de antigénio 9,10. Portanto, a geração de células T derivados iPSCs é seguramente útil para avançar a medicina regenerativa.

Este método baseia-se no conceito de reduzir o risco de patogenicidade imprevisível. Para aplicação clínica segura de iPSCs é importante para reduzir o risco de exposição a agentes patogénicos 11. Anteriormente em diversos sistemas de cultura de células estaminais pluripotentes, células de soro bovino fetal e de alimentação têm sido utilizados como reagente essencialS 12. No entanto, a remoção de ambos os reagentes a partir do sistema de cultura para a geração é preferível iPSC para reduzir o risco de patogenicidade imprevisível.

Além disso, este método tem a vantagem de evitar amostragem invasiva de células de pacientes e laboriosa preparação de células alimentadoras. Como células T derivadas iPSCs já têm sido utilizados com sucesso na pesquisa de doenças 13,14, este método também é aplicável e útil para gerar iPSCs de doenças específicas de pacientes.

Entre os métodos de reprogramação das células T, utilizando o vector de vírus Sendai (SeV) como um veículo de genes é um método que pode gerar iPSCs com alta eficiência 7,16. Além disso, porque é um SeV single-stranded RNA vírus e não necessita de uma fase para a replicação de ADN, a sua utilização na produção de iPSC evita quebrar o genoma do hospedeiro 17-19. Portanto, nós estabelecemos protocolos para gerar iPSCs de células T periférico humano no soro-free e condições de livre-de alimentação, utilizando uma combinação de matrigel, médio mTeSR, e SEV vetores.

Protocolo

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1. Prepare células T humanas activadas

  1. Colete 10 ml de sangue total heparinizado de um doador por punção venosa.
    1. Obter o consentimento informado dos doadores antes da punção venosa. Punção venosa deve ser feita por pessoal qualificado e treinado.
    2. Lidar com amostras de sangue obtidas com equipamentos esterilizados e seguintes diretrizes de biossegurança adequadas.
  2. Dilui-se 10 ml de sangue total heparinizado com 10 ml de D-PBS (-).
  3. Colocar 15 ml de Ficoll solução (prémio de Ficoll-Paque) para um novo tubo cónico de 50 ml.
  4. Camada da solução de sangue de 20 ml, preparada na etapa 1.2 para a solução de Ficoll no passo 1.3. Usando uma pipeta elétrica, deixe a solução de sangue preparada no Passo 1.2 funcionar lentamente ao longo da parede interior do tubo. Tenha cuidado para não misturar a solução de sangue e solução de Ficoll.
  5. Centrifuga-se a 400 x g durante 30 min à TA. Defina a velocidade de desaceleração centrífuga para "lento".
    Nota: Após a centrifugação, uma fina brancocamada surge entre uma camada de plasma leitoso superior e uma camada inferior Ficoll clara. Esta fina camada branca contém células mononucleares.
  6. Transferir a camada de células mononucleares para um novo tubo cónico de 50 ml com uma pipeta de 1 ml. Tenha cuidado para não incluir solução Ficoll.
  7. Adicionar D-PBS (-) para as células mononucleares a um volume total de 10 ml, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA.
  8. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 10 ml de D-PBS (-) para as células mononucleares, e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA.
  9. Desprezar o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio KBM502 para as células mononucleares coletadas, e contar as células utilizando um hemocitómetro. Mais de 5 x 10 6 células mononucleares pode ser obtido a partir de 10 ml de sangue total heparinizado com separação apropriada usando Ficoll.
  10. Prepara-se uma solução de anticorpo anti-CD3 humano a uma concentração de 10 ug / ml em D-PBS (-). Adicionar a solução de anticorpo anti-CD3 humano de uma placa de 6 poços, embeber a ressacaás de cada poço, e a incubação do prato a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 durante pelo menos 30 min.
  11. Remover a solução de anticorpo CD3 anti-humano a partir de cada cavidade e lavar uma vez com D-PBS (-) imediatamente antes de semear as células.
  12. Células mononucleares de semente que foram preparados no passo 1.9, a uma densidade de 2,5 x 10 5 células / cm2 sobre o anti-CD3 humana revestidas com anticorpo placas de 6 poços em meio de KBM502. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante 3-7 dias, sem mudança de meio, as células T até a confluência. As células T neste período são as duas células em suspensão e aderentes.

2. As células T humanas Infect com SEV Vetores

  1. Depois de 3-7 dias de cultura, recolher as células T ativadas com meio existente por pipetagem. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA.
  2. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar as células e placa 1.5 x 10 6 células (em 2 ml de meio fresco KBM502) em cada poço de um anti-CD3 anticorpo revestidos por placa de 6 poços.
  3. Descongele as soluções de OCT3 SEV / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF no gelo.
  4. Adicionar as soluções contendo OCT3 Sev / 4-SEV / TSΔF, SOX2-SEV / TSΔF, KLF4-SEV / TSΔF, e c-Myc (LCF) -SeV / TS15ΔF individualmente para os poços, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) 10. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas.

3. Retire Vetores SEV de células T humanas

  1. 24 h após a infecção, as células infectadas recolha com uma pipeta. Se houver células aderentes, eles podem facilmente ser destacado pipetando-los várias vezes para cima e para baixo. Transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA.
  2. Remover o sobrenadante contendo os vetores SEV, e adicionar 2 ml de meio KBM502 fresco. Células replate em each dos poços. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora durante mais 24 horas adicionais.

4. RESEED células em uma camada Matrigel

  1. Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12.
    Nota: gel Matrix (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) precisa descongelar O / N a 4 ° C para ser totalmente descongelado. Mantenha-o em gelo até imediatamente antes da utilização.
  2. Placa 5 ml de solução de matriz da membrana basal por placa em placas de 100 mm e deixar à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min antes da sementeira de células. Pelo menos duas placas de 100 mm são necessários para um experimento.
  3. Recolhe células SEV-infectados por pipetagem, transferi-los para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 200 x g durante 5 min à TA.
  4. Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio fresco KBM502. Contar o número de cells usando um hemocitômetro, remova a solução de matriz da membrana basal de pratos de 100 mm preparado no passo 4.2 e placa 1 × 10 5 e 1 × 10 6 células (em 10 ml de meio mTeSR fresco) em uma de 100 mm membrana basal matriz revestido pratos. Finalmente, use a placa em que as colônias são facilmente colhidas.
  5. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO 2 incubadora S / N.
  6. Mude a médio e 10 ml carne médio mTeSR a cada dois dias.
    Nota: Aproximadamente 20-30 dias após a infecção, colônias que se assemelham células-tronco embrionárias (CES) aparecerá.

5. Expanda T iPSCs derivadas de células

  1. Preparar a solução matriz da membrana basal por gel matriz descongelação (consulte a Lista de Materiais para a marca específica utilizada neste estudo) a 4 ° C e dissolvendo 0,2 ml em 10 ml de meio DMEM / F12.
  2. Placa 1 ml da solução de matriz da membrana basal por poço numa placa de 6 poços e deixar à temperatura ambiente durante amenos 30 minutos antes de escolher colônias.
  3. Encha uma placa de 96 poços com 20 ul de meio por poço mTeSR.
  4. Selecione colônias que se assemelham a CES sob o microscópio estereoscópico com uma pipeta de 20 mL.
    Nota: As colônias do CES e iPSCs são redondos e lisos como mostrado na Figura 1B.
  5. Transferência de colónias seleccionadas para a placa de 96 poços preenchidos com meio mTeSR no passo 5.3.
  6. Adicionar 200 ul de meio mTeSR a cada poço e cuidadosamente pipetar para cima e para baixo para quebrar a colónia em pequenos torrões, ao microscópio estereoscópico, utilizando uma pipeta de 200 uL. Remover a solução de matriz de membrana basal preparado a partir do poço de 5,2 e colocar cada colónia para um poço da membrana basal revestida de matriz de 6 poços da placa com 2 ml de meio por poço mTeSR.
  7. Mude a médio e 2 ml carne médio mTeSR a cada dois dias.

6. Manter T iPSCs derivadas de células

Os iPSCs derivadas de células T pode ser mantidae armazenadas usando as mesmas técnicas que para iPSCs humanos e CES humanos. Uma vez colónias IPSC crescer, expandir-los em pratos maiores, repetindo o mesmo procedimento.

  1. Mudar o meio mTeSR a cada 1-2 dias.
  2. Quando as colónias tornam-se confluentes a cada 5-7 dias, a passagem das células, utilizando uma solução de dissociação para iPSCs humanos e CES humanos de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

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Usando este protocolo, os usuários são capazes de gerar iPSCs de células T periférico humano estavelmente. geração iPSC a partir de células T com SeV e Matrigel mostrou aproximadamente 0,002% -. 0.005% de eficiência de reprogramação celular entre vários casos doadores e SeV não foram detectados após várias passagens 16 A Figura 1A mostra um esquema do protocolo para a geração de células T derivadas de iPSCs em condições de livre-feeder usando matrigel e médio mTeSR. Cerca de 20-30 dias após a infecção com SeV, colónias IPSC são reconhecidos por sua colônia ESC-como a morfologia (Figura 1B). Imunofluorescência revelou a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) em T-iPSCs derivadas de células gerada sob condições isentas de alimentação (Figura 1C).

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Figura 1. (A): Um esquema do protocolo de reprogramação das células T sob condições isentas de alimentação nesse estudo. (B): A ESC-como colônia típica iPSC no dia 27 após a coleta de sangue em condições de livre-de alimentação. (C): coloração ALP e imunofluorescência para marcadores de pluripotência e de superfície (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60, e TRA-1-81) em T-iPSCs derivadas de células geradas sob condições isentas de alimentação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Descrevemos um protocolo para gerar iPSCs a partir de células T periféricas humanas em condições livres de soro e alimentador usando uma combinação de vetores matrigel, meio mTeSR e SeV. Para aplicações clínicas de iPSCs, é importante ter um protocolo para gerar iPSCs de forma estável e um método menos invasivo para amostragem celular. Embora a geração de iPSCs com a combinação de matrigel e meio mTeSR tenha apresentado menor eficiência de reprogramação do que com meio de reposição de soro knockout (KSR) e células-alimentadoras, essa combinação atinge uma geração estável de iPSCs a partir de doadores16. A geração estável de iPSC e a amostragem de células menos invasivas têm a vantagem de poder aumentar o número de doadores para a geração de iPSC.

Os vetores SeV, um vírus de RNA de fita negativa, não estão integrados ao genoma do hospedeiro. Portanto, os riscos de tumorigênese podem ser evitados na etapa de indução do fator de reprogramação20-24. Além disso, as condições livres de alimentador, que usam uma combinação de meio de cultura definido e matrigel em vez de uma camada de alimentador, tornam possível minimizar os riscos potenciais de exposição a fatores exógenos desconhecidos. A fusão dessas técnicas fornece uma tecnologia iPSC menos invasiva e segura para a medicina regenerativa16.

Etapas importantes neste protocolo são a etapa de ativação de células T humanas (Etapa 1) e infectá-las com vetores SeV (Etapa 2). Quando nenhuma colônia do tipo ESC é obtida na placa de cultura em um momento ideal após a infecção por SeV, o seguinte deve ser considerado. Primeiro, a confluência das células mononucleares antes da ativação das células T pode não ser apropriada porque a ativação ideal das células T é crítica para a infecção por SeV25,26. Uma densidade muito alta de células mononucleares leva à morte celular, interferindo na ativação adequada das células T. Uma densidade muito baixa de células mononucleares também perturba a ativação e proliferação adequadas de células T. Portanto, a confluência de células mononucleares deve ser verificada e ajustada de acordo. Em segundo lugar, a dosagem dos vetores SeV pode não ser suficiente. A eficiência de indução das colônias de iPSC depende da dosagem do vírus6. Se nenhuma colônia semelhante a ESC for observada após a infecção por SeV, a opção de aumentar a dose do vírus até um MOI de 15-20 deve ser considerada. Se forem observados sinais de diferenciação de colônias iPSC, a frequência com que o meio é alterado pode ser aumentada até dias alternados ou para todos os dias em que as colônias são maiores.

A limitação neste protocolo consiste em este método não estar livre de vírus. Embora o SeV para reprogramação celular esteja disponível comercialmente com facilidade, os usuários precisam preparar o equipamento de acordo com o nível de biossegurança apropriado. Como outro método para gerar iPSCs livres de integração, vetores epissómicos têm sido usados até o momento27-29. Embora os vetores epissómicos possam ser usados com equipamentos com menor nível de biossegurança, os vetores epissómicos podem inserir-se no genoma do hospedeiro a taxas extremamente baixas. Portanto, verificações adicionais são necessárias para confirmar o desaparecimento de transgenes, como no uso de SeV.

Há outra limitação em que esta técnica não é absolutamente isenta de produtos derivados de animais. Alguns substratos, como matrigel, mAb anti-CD3, solução de dissociação e solução de SeV são derivados de produtos de origem animal e, portanto, estão associados a um risco de transferência de patógenos xenogênicos. No entanto, a redução de substratos derivados de animais no sistema de cultura é significativa para a aplicação clínica da tecnologia iPSC devido ao menor risco.

Divulgações

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Os autores não têm nenhum concorrente ou interesses conflitantes para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi, e Ohno Rei da Escola de Medicina da Universidade de Keio para assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por um programa de apoio à I & D Systems para acelerar a utilização prática dos resultados da pesquisa em saúde, e do Programa Estrada para a Realização de Medicina Regenerativa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ficoll-Paque PREMIUMGE Healthcare17-5442-02
Camundongo purificado NA/LE anti-humano CD3BD Pharmingen555336
Solução de albumina bovina fração VGibco15260-037
mTeSR1 kit médioSTEM CELL5850Aqueça à temperatura ambiente antes de usar
Solução de dissociaçãoReproCELLRCHETP002
D-PBS (–)Wako045-29795
SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0DNAVECDV-0303cDescongele no gelo antes
de usar Placa de cultura de tecidos de 100 mmFalcon353003
Placa de cultura de tecidos de 96 poçosFalcon353078
Placa de cultura de tecidos de 6 poçosFalcon353046
15  ml Tubo de CentrífugaGreiner Bio-One188271
50  ml Tubo de centrífugaGreiner Bio-One227261

Referências

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