Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Resumo

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Resumo

A barreira epitelial é a primeira defesa inata do tracto gastrointestinal e regula selectivamente o transporte a partir do lúmen para os compartimentos dos tecidos subjacentes, restringir o transporte de moléculas pequenas através do epitélio e quase completamente proibindo transporte macromolecular epitelial. Esta selectividade é determinada pela camada de gel mucosa, o que limita o transporte de moléculas lipofílicas e ambos os receptores apicais e complexos de proteína de junções apertadas do epitélio. Modelos in vitro de cultura de células de epitélio são convenientes, mas como um modelo, falta-lhes a complexidade das interacções entre a microbiota, muco-gel, epitélio e sistema imunológico. Por outro lado, a avaliação in vivo da absorção intestinal ou da permeabilidade pode ser realizada, mas estes ensaios medem a absorção gastrointestinal, em geral, sem qualquer indicação de especificidade local. Ex vivo ensaios de permeabilidade intestinal usando "sacos"; são um método rápido e sensível de medir tanto a integridade intestinal global comparativa ou transporte de uma molécula específica, com a vantagem adicional de especificidade local intestinal. Aqui descreve-se a preparação de sacos para os estudos de permeabilidade intestinal e o cálculo da permeabilidade aparente _{(P app)} de uma molécula através da barreira intestinal. Esta técnica pode ser usada como um método de avaliar a absorção do fármaco, ou para analisar a disfunção da barreira epitelial regional nos modelos animais de doenças gastrointestinais.

Introdução

A barreira epitelial intestinal do tracto gastrointestinal é uma área de superfície de mucosa estimado em cerca de 400 m ² no adulto humano. Consequentemente, é constantemente expostos a desafiar de micróbios, drogas ingeridas, nutrientes e toxinas bacterianas. O hospedeiro deve não só distinguir entre bactérias comensais toleráveis ​​e os potenciais agentes patogénicos, mas deve evitar que estas espécies e as suas moléculas segregadas a partir de atravessar a barreira epitelial, enquanto, ao mesmo tempo que permite a absorção de nutrientes. Assim, o papel do epitélio intestinal é actuar como uma barreira selectiva para o conteúdo luminal ^1. Isto é conseguido, em parte, pelo sistema de defesa inata epiteliais na mucosa, que actua através de um sistema biológico responsivo que consiste em mecanismos constitutivos e indutíveis ^2.

A perda da função de barreira epitelial é uma patologia que é característico de um número de doenças gastrointestinais. In vivoexame da função de barreira epitelial podem ser avaliados através de gavagem oral de uma molécula de marcador e a análise subsequente de soro ^3. No entanto, esta técnica não oferece nenhuma indicação quanto ao local da disfunção da barreira. In vitro e avaliação ex vivo da resistência transepitelial usando sistemas Transwell ³ e câmaras de Ussing ^4,5, respectivamente, são comumente utilizados como marcadores substitutos da função barreira epitelial, mas falta a fisiologia da doença contribuindo de modelos animais ^6. Neste protocolo, descrevem um modelo de preparação de tecido ex vivo que permite a avaliação directa e localizada de integridade intestinal e que pode ser utilizada para avaliar a função de barreira da mucosa a um número de níveis. Mais importante, esta técnica pode ser aplicada aos modelos animais de doença, ou podem ser manipulados para permitir farmacologicamente interrogação em profundidade de uma disfunção da barreira da mucosa.

Protocolo

Todo o trabalho de animais neste protocolo é realizada com a estrita observância Universidade do Comitê de Ética Newcastle animal procedimentos aprovados.

1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura e pratos

1. Pré-quente Mídia 199 (TC199) ou de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) media a 37 ° C. Pré-oxigenar o meio por borbulhamento com 95% _de O2 / 5% de CO _2. Verificar que a forma tem um pH final de 7,3.
2. Prepare sutura cortando duas seções 5 cm para cada saída. Laço as suturas em um nó não fechada.

2. Dissecção e Preparação do Trato Gastrointestinal

1. Retirar o alimento contínuo de 12 horas antes da eutanásia. Se desejado, colocar os animais sobre gel de suplementos de nutrientes durante este tempo.
2. Eutanásia ratos por dose excessiva de pentobarbitona de sódio ([200 mg / kg], injecção intraperitoneal), seguida por deslocação cervical, de acordo com o proto de Ética Institucionalcols e pulverizar 70% de etanol para o abdômen e tórax.
3. Utilizando uma tesoura, fazer uma incisão horizontal no meio do abdómen e expor o peritoneu.
4. Avance para separar e remover o tracto gastrointestinal através da redução do intestino delgado superior a partir do estômago para o esfíncter pilórico e cortar o intestino grosso na margem anal. Use uma pinça para remover suavemente o mesentério. Colocar o tracto intestinal de pré-aquecido, o meio oxigenado.
5. Identificar a secção de intestino de ser avaliada para a permeabilidade (Figura 1) e cortado desta secção livre do resto do tracto intestinal.
   1. A fim de manter a consistência entre os animais, medir secções do duodeno e jejuno em relação ao estômago, e medir secções de cólon e íleo em relação ao ceco.
   2. Ao selecionar segmentos de tecido, observe a presença de tecidos linfóides associados a mucosas, tais como placas de Peyer. Estes podem ser identificados como pequeno acenoULES no lado da serosa do lúmen.
   3. Usando uma seringa de 1 mL, gentilmente liberar o conteúdo luminal do segmento intestinal para uma placa de Petri com PBS pré-aquecido (37 ° C). Estes conteúdos fecais pode ser descartada ou armazenada a -80 ° C para análise futura conforme desejado.

3. Preparação de intestinal Sacos

1. Prepara-se uma seringa de 1 mL com um volume de 300 uL do composto de teste ou molécula. Para a integridade da mucosa, uma solução de 1 mg / ml de FITC-Dextrano P.M. 4400 pode ser usado. As sondas que variam de 4,400-70,000 Da em tamanho pode ser usado para aumentar a sensibilidade. Firmemente encaixar um cateter animais vascular pequena na seringa.
2. Medida 5 cm da abertura do segmento intestinal e amarrar o segmento de bem fechada com uma sutura em malha neste momento. Delicadamente, coloque um fio de sutura em circuito pré-amarrado ao redor da abertura do intestino e inserir o cateter embotada. Puxar o laço fechado, de modo a garantir o segmento intestinale libertar o volume de 300 uL a partir da seringa para dentro do intestino, assegurando que toda a solução é injectada.
3. Remova cuidadosamente o cateter enquanto puxando simultaneamente o laço de sutura para garantir o fechamento do saco intestinal. Cortar o saco intestinal solto a partir do intestino e colocar num tubo cónico de 50 ml cheio com 20 ml de meio oxigenado, pré-aquecido a 37 a ° C.

4. Medição da permeabilidade

1. Colocar os tubos cónicos contendo os sacos intestinais num banho de água aquecida para 37 definir ° C. Aos 0, 30, 60, 90 e 120 min pontos de tempo, tomar uma amostra de 100 ul a partir do tubo cónico e transferência para uma placa de 96 poços, substituindo o volume com 100 ul de meio fresco em cada exemplo.
2. Depois de a amostra final é tomada, cortar sacos abertos no ponto de sutura e para baixo do comprimento do segmento, expondo a superfície da mucosa.
3. Medir o comprimento e a largura de cada segmento intestinal. Se desivermelho, pressão congelar os segmentos e armazenar a -80 ° C para a proteína ou análise bioquímica, ou alternativamente, loja em solução estabilizadora de RNA para ensaios moleculares.
4. Preparar uma curva padrão de diluições log para moléculas de FITC-tag que variam de 1 a 1 x 10 ^-6.
5. medir amostras e padrões para FITC em um leitor de placas fluorescentes, FITC excitação / emissão: 495 nm / 519 nm.

5. Cálculo da permeabilidade aparente para cada indivíduo Intestinal Sac

1. Converter unidades de tempo para seg.
2. Para cada ponto de tempo, calcular a concentração cumulativa, Q
   
   Q _{t =} (C _{t *} V _r) + (Q _{t soma} * V _s), onde:
   
   Q _t = concentração cumulativa no tempo t
   C _t = concentração no tempo t
   V _r = Volume no lado receptor
   Q _{t sum =} Soma de Q tudo _t anterior
   V = _svolume amostrado
   
3. Lote Q em função do tempo (t) e calcular o declive: δQ / dt
4. Calcule a permeabilidade aparente _(app P)
   
   P _{app =} (δQ / AT) / (A * Co), onde:
   
   A = Área de tecido
   ₀ C = concentração inicial

Resultados

Este protocolo pode ser usado para examinar as mudanças regionais na função de barreira intestinal em modelos animais da doença gastrointestinal. Através da medição do fluxo de uma sonda paracelular através da superfície da mucosa em zonas diferentes do tracto gastrointestinal ^7, a integridade das junções apertadas epiteliais pode ser avaliada. Além disso, fazendo variar a natureza da sonda paracelular por tamanho (Figura 2) ou a hidrofobicidade (Figur...

Discussão

Aqui, nós detalhou o isolamento e preparação de sacos intestinais para avaliar a função barreira da mucosa ex vivo. sac preparações intestinais têm sido principalmente utilizados em investigação farmacêutica, examinando a absorção de medicamentos candidatos em todo o intestino. No entanto, este ensaio é igualmente adequado para o estudo da doença intestinal. permeabilidade intestinal podem variar muito por região e local de avaliação específica da permeabilidade permite uma melhor compreensão da importância reg...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dekantel  Sutura de seda não absorvível	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	Sem vermelho de fenol, pois isso interfere na fluorescência
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Life Technologies	21063-045	Sem vermelho de fenol, pois isso interfere na fluorescência
N-acetilcisteína	Sigma Aldrich		Use a 10 mM em meios
Cateter vascular de pequenos animais: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4.400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20.000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70.000 MW	Sigma Aldrich	FD-70