Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.
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Artigo de método
Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade de secretar citocinas rapidamente com a estimulação é uma característica funcional da invariante natural killer T (iNKT) linhagem celular. iNKT células são portanto caracterizado como uma população de células T capazes de activar inata e adaptativa direcção respostas imunes. O desenvolvimento de técnicas melhoradas para a cultura e expansão de células iNKT murino facilita o estudo de biologia celular iNKT in vitro e em sistemas modelo in vivo. Aqui, descrevemos um processo aperfeiçoado para o isolamento e a expansão de células esplénicas murinas iNKT.
Os baços de ratinhos C57BL / 6 são removidos, dissecados e tenso e a suspensão celular resultante é colocado em camadas sobre meios de gradiente de densidade. Após centrifugação, as células mononucleares esplénicas (MNCs) são recolhidos e linfócitos CD5-CD5 positivas (+) são enriquecidos para usando esferas magnéticas. iNKT células dentro da fracção CD5 + são subsequentemente corados com ^5; GalCer-carregado CD1d tetrâmero e purificou-se por selecção de células activadas de fluorescência (FACS). Separadas por FACS, em seguida, as células são iNKT inicialmente cultivadas in vitro, utilizando uma combinação de citocinas recombinantes de murideo e receptor de células T de placa ligado (TCR), antes de ser expandido estímulos em presença de murino IL-7 recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 8 iNKT células pode ser gerada dentro de 18-20 dias de cultura, após o que eles podem ser utilizados para ensaios funcionais in vitro, ou para experiências in vivo em ratinhos de transferência.
Introdução
Murino células T assassinas naturais invariante (iNKT) são uma população distinta de linfócitos T inatas selecionados no timo por expressando CD1d timócitos corticais 1,2. iNKT células expressam um receptor de células T (TCR) composta de uma cadeia Vα14-Jα18 TCR invariante emparelhado com qualquer Vβ8, Vβ7 Vβ2 TCRs ou 3, que é capaz de reconhecer endógena, bem como os antigénios de lípidos estranhos no contexto da CD1d. Por exemplo, células de murino iNKT reconhecer e são activados por um chamado lípido isoglobotrihexosylceramide antigénio endógeno (iGb3) 4, bem como α-galactosilceramida (αGalCer) 5,6, um glicolípido isolad....
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Protocolo
Neste estudo, foram utilizados para adultos (6-8 semanas) fêmeas C57BL / 6. Os ratos foram alojados e produzido de acordo com as diretrizes do biotério da Universidade de Ghent. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal Institucional.
1. Preparação de células mononucleares (MNC) a partir de baço de murganho
- Sacrifique o rato por deslocamento cervical.
- Posicione o mouse de volta para baixo na placa de dissecação e corrigir o traseiras e dianteiras com alfinetes.
- Esterilizar a-superfície da pele com 70% (vol / vol) de etanol / H 2 O.
- Corte a p....
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Resultados
Isolamento de células mononucleares esplénicas utilizando um gradiente de densidade leva cerca de 1 hora e elimina a utilização de reagentes necessários para a lise de glóbulos vermelhos (RBC). Um elevado rendimento de células viáveis é obtida usando este método e detritos gerados durante a deformação do órgão é removido. Tipicamente, a frequência de células iNKT dentro do conjunto de linfócitos do baço varia entre 1 e 5% de linfócitos T totais no entanto, isto pode variar, dependendo do estado a idade, sexo e saúde d.......
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Discussão
Etapas críticas do protocolo atual incluem o isolamento e enriquecimento posterior de CD5 + linfócitos (Seção 1 & 2), FACS classificação (Seção 3) eo revestimento inicial de células iNKT (Seção 4). Dos passos realizados na Seção 1, lembre-se para a camada cuidadosamente a suspensão celular splenic a médio gradiente de densidade tal que uma interfase celulares distintos é gerado após a centrifugação. O enriquecimento posterior para CD5 + linfócitos por separação magnética de células (Seção 2) mi.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.
Agradecimentos
D.E. e M.B.D. são membros de uma plataforma de pesquisa multidisciplinar (MRP) da Universidade de Ghent e do consórcio Ghent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| murino recombinante IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| murino recombinante IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| murino recombinante IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purificado anti-rato CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purificado anti-rato CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugado anti-rato CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugado anti-rato CD8α (53-6,7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| CD5 anti-rato conjugado com FITC (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| CD3&épsilon anti-rato conjugado com V500; (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microesferas | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purificado anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 médio | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - livre] |
| Soro fetal de bezerro | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamina | Gibco | 25030-123 | |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Albumina | de soro bovinoSigma-Aldrich | A7906-100MG& | |
| beta;-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipamento | |||
| Placa de 96 poços | Fundo F Greiner-bio one | 657-160 | |
| Placa de 24 poços | Greiner-bio one | 665-180 | |
| Placa de 6 poços | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tubo | Greiner-bio one | 188-271 | |
| tubo de falcão de 50 ml | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µ filtro m | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µ m filtro | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separador | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Colunas | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Incubadora de CO2 com camisa de água | VWR | ||
| Hemocitômetro | VWR | ||
| Kit de dissecção | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biociências |
Referências
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (20....
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Reimpressões e permissões
