Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo adaptado que pode ser usado para gerar um grande número de células T natural killer invariantes murinas do baço de camundongo. O protocolo descreve uma abordagem pela qual as células iNKT esplênicas podem ser enriquecidas, isoladas e expandidas in vitro usando um número limitado de animais e reagentes.

Resumo

A capacidade de secretar citocinas rapidamente com a estimulação é uma característica funcional da invariante natural killer T (iNKT) linhagem celular. iNKT células são portanto caracterizado como uma população de células T capazes de activar inata e adaptativa direcção respostas imunes. O desenvolvimento de técnicas melhoradas para a cultura e expansão de células iNKT murino facilita o estudo de biologia celular iNKT in vitro e em sistemas modelo in vivo. Aqui, descrevemos um processo aperfeiçoado para o isolamento e a expansão de células esplénicas murinas iNKT.

Os baços de ratinhos C57BL / 6 são removidos, dissecados e tenso e a suspensão celular resultante é colocado em camadas sobre meios de gradiente de densidade. Após centrifugação, as células mononucleares esplénicas (MNCs) são recolhidos e linfócitos CD5-CD5 positivas ⁽⁺⁾ são enriquecidos para usando esferas magnéticas. iNKT células dentro da fracção CD5 ⁺ são subsequentemente corados com ^5; GalCer-carregado CD1d tetrâmero e purificou-se por selecção de células activadas de fluorescência (FACS). Separadas por FACS, em seguida, as células são iNKT inicialmente cultivadas in vitro, utilizando uma combinação de citocinas recombinantes de murideo e receptor de células T de placa ligado (TCR), antes de ser expandido estímulos em presença de murino IL-7 recombinante. Usando esta técnica, aproximadamente 10 ⁸ iNKT células pode ser gerada dentro de 18-20 dias de cultura, após o que eles podem ser utilizados para ensaios funcionais in vitro, ou para experiências in vivo em ratinhos de transferência.

Introdução

Murino células T assassinas naturais invariante (iNKT) são uma população distinta de linfócitos T inatas selecionados no timo por expressando CD1d timócitos corticais ^1,2. iNKT células expressam um receptor de células T (TCR) composta de uma cadeia Vα14-Jα18 TCR invariante emparelhado com qualquer Vβ8, Vβ7 Vβ2 TCRs ou ^3, que é capaz de reconhecer endógena, bem como os antigénios de lípidos estranhos no contexto da CD1d. Por exemplo, células de murino iNKT reconhecer e são activados por um chamado lípido isoglobotrihexosylceramide antigénio endógeno (iGb3) ^4, bem como α-galactosilceramida (αGalCer) ^5,6, um glicolípido isolado a partir de esponjas marinhas. TCR-dependente de activação de células iNKT promove a iniciação de respostas imunitárias adaptativas, e como um resultado, as células iNKT foram mostrados para ser funcionalmente envolvidos na melhoria ou o desenvolvimento de uma variedade de patologias incluindo a doença reumática ⁷ e cancro ^{8. Actualmente, os ligandos celulares iTNK sintéticos constituem novos adjuvantes de vacinas promissoras, que podem ser capazes de regular a um número de condições imunopatológicas.}

Foi previamente demonstrado que as células iNKT podem ser gerados in vitro após isolamento a partir de tecido de rato no entanto; muitos destes estudos emprega a utilização de células primárias de apresentação de antigénio (APCs) e / ou linhas de células ^9, Vα14 TCR transgénicos (Tg) ^{de 10} ratinhos, timomas ou para a geração de iNKT derivadas de células hibridomas ^11,12. Além disso, um grande número de ratos, altos volumes de reagentes, tais como dímeros CD1d αGalCer-carregados, e tempos de cultivo longas fazer alguns protocolos publicados há menos de forma ética e economicamente atraente ^9,13.

Neste relatório nós descrevemos um método adaptado para o isolamento e expansão in vitro de células de rato iNKT baço. Mais especificamente, o protocolo descreve um métodopara o enriquecimento de células de baço de ratinho iNKT que reduz os ratos, os reagentes e tempo necessários para FACS separação de células, e propõe uma abordagem otimizada para expansão de células esplênicas iNKT ordenados in vitro.

Protocolo

Neste estudo, foram utilizados para adultos (6-8 semanas) fêmeas C57BL / 6. Os ratos foram alojados e produzido de acordo com as diretrizes do biotério da Universidade de Ghent. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal Institucional.

1. Preparação de células mononucleares (MNC) a partir de baço de murganho

1. Sacrifique o rato por deslocamento cervical.
2. Posicione o mouse de volta para baixo na placa de dissecação e corrigir o traseiras e dianteiras com alfinetes.
3. Esterilizar a-superfície da pele com 70% (vol / vol) de etanol / H ₂ O.
4. Corte a pele ao longo da linha média do abdome para o tórax e expor o baço utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis.
5. Após o corte dos tecidos gordos circundantes, colocar o baço em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) à temperatura ambiente.
6. Dissecar do baço utilizando um escalpelo estéril e transferir as peças para um filtro de nylon de 70 um colocado dentro de uma tina 50 mle.
7. Usando 2 ml de um êmbolo da seringa, triturar suavemente os pedaços de baço através do filtro de células e lava-se com 5 ml de PBS 1x.
8. Adicionar 3 ml de Ficoll-Paque para um tubo de 15 ml e sobrepor a forma do gradiente de densidade com 5 ml de suspensão celular.
9. Centrifugar a 400 xg durante 20 min à temperatura ambiente sem travão.
10. Transferir a interfase para um novo tubo de 15 ml, adicionar 10 ml de PBS 1x frio e centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
11. Ressuspender as células em 2 ml de PBS 1x contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (tampão FACS). Transferir 10 uL da suspensão de células para um pequeno tubo, misturar com 10 ul de 0,4%

2. Enriquecimento, detecção e purificação de células do rato iNKT

1. Enriquecimento de rato splenic linfócitos CD5positive (CD5 ^+).
   1. (Opcional) Mancha 10 ⁵ células com FITC-conjugado anti-CD5 (4 ul de diluição 1:30 / 10 ⁶ células)durante 30 min a 4 ° C no escuro, lava-se com 200 ul de tampão de FACS e ressuspender em 500 ul de tampão de FACS. Preparar uma solução de trabalho a 20 uM de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS 1x, adicionar 1 mL da mesma a 10 ⁵ células em tampão de SCAF e incubar à TA durante 5 min. Adquirir 10 ⁴ células pré-enriquecido no citómetro de fluxo.
      1. Usando FCS-H e FCS-W, porta eletronicamente em células ^lo FSC-W para excluir dupletos celulares e agregados (Figura 1A). Então eletronicamente portão fora DAPI ^{+ (células} mortas) dentro do ^W-lo FSC população (Figura 1B), e usar SSC-A e FCS-A para selecionar eletronicamente a população de linfócitos pelo tamanho (Figura 1C).
      2. Usando células, dentro da porta de linfócitos, traçar SSC-A versus CD5 e electronicamente portão CD5 ⁺ linfócitos, como mostrado na Figura 1D. Adquirir o restante da amostra de pré-enriquecido no citómetro de fluxo.
   2. Ajustar as contagens de células para 10 ⁷ culas por 90 uL em tampão de SCAF e adicionar 10 ul de microesferas anti-CD5.
   3. Incubar a 4 ° C durante 15 minutos, lavar uma vez com 4 mL de tampão de FACS e ressuspender em 500 ul de tampão de FACS frio. Enriqueça para CD5 ⁺ linfócitos usando separação de células magnéticas (MACS) colunas de acordo com as recomendações do fabricante.
   4. Opcional) Stain 10 ⁵ células com anti-CD5 FITC-conjugado (4 ul de diluição de 1:30 / 10 ⁶ células) e DAPI como em 2.1.1. Adquirir 10 ⁴ linfócitos enriquecidos no citômetro de fluxo e verifique se as portas eletrônicas criado em 2.1.1. selecione CD5 ⁺ linfócitos na fracção celular enriquecido. Adquirir 10 ⁵ células no citómetro de fluxo e análise da percentagem de linfócitos CD5 ⁺ presentes na fracção enriquecida tal como mostrado na Figura 1E - H.
2. Detecção e isolamento de rato iNKT cells por FACS.
   1. Ressuspender linfócitos enriquecidos CD5 ⁺ a uma concentração de aproximadamente 10 ⁶ células por 20 uL em tampão de SCAF contendo anti-CD16 / CD32 (4 ul de diluição 1:50 / 10 ⁶ células) e αGalCer conjugado com PE / CD1d tetrâmero (1 ug / 10 ⁶ células).
   2. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
   3. Dilui-se anticorpos de ratinho (mAcs) anti-CD3ε V500 (4 ul de diluição de 1:20 / 10 ⁶ células), anti-CD19 E450 (4 ul de diluição 1:50 / 10 ⁶ células) e anti-CD8a E450 (4 ul de diluição 1:50 / 10 ⁶ células) em tampão de SCAF, adicionar aos linfócitos CD5 ⁺ e incubar durante 30 min a 4 ° C no escuro.
   4. Lavam-se as células com 1 ml de tampão de FACS por centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 4 ml de tampão de FACS a uma concentração final de 10 ⁷ células / ml.
   5. Filtrar as células através de um coador de células de 30 ^ m e colocar as células em gelo.
   6. Calibrar o citômetro de fluxo para separação de células de acordo com as recomendações do fabricante ^14,15.
      NOTA: A calibração de um citómetro de fluxo para separação de células requer treino e pode ser realizada por um operador experiente, ou um técnico treinado.
   7. Adicionar 10 ul de uma solução de trabalho a 20 ^ M de DAPI por 10 ⁶ células e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Adquirir aproximadamente 10 ⁴ enriquecidos ⁺ linfócitos CD5 no citômetro de fluxo. Eletronicamente portão em células ^lo FSC-W para excluir dupletos celulares e agregados (Figura 2A). Então eletronicamente portão fora DAPI ⁺ CD8 ⁺ CD19 ⁺ células (canal dump) dentro do ^FSC-lo W população (Figura 2B), e usá-SSC-A e FCS-A para selecionar eletronicamente linfócitos (Figura 2C), como descrito em 2.1.1.1 .
      1. Plot αGalCer / CD1d tetrâmero por CD3ε e eletronicamente portão αGalCer / CD1dcélulas tetrâmero ^{+ +} CD3ε iNKT como mostrado na Figura 2D. Adquirir mais de 2 x 10 ⁵ CD5 ⁺ linfócitos enriquecidos para determinar a percentagem αGalCer / CD1d tetrâmero ^{+ +} CD3ε iTNK células presentes na fracção celular enriquecido.
   8. Utilizando as portas electrónicas criadas em 2.2.7., Células de tipo FACS αGalCer / CD1d tetrâmero ^{+ +} iNKT CD3ε no citómetro de fluxo, a 70 psi, utilizando um bocal de 70 um, com um caudal de '1,5'. Recolha iNKT células ordenadas em um tubo FACS contendo 1 ml de 100% FCS. Subsequentemente enxaguar células iNKT classificadas a partir do lado do tubo de FACS utilizando 10 ml de RPMI 1640 e centrifugar as células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C.
   9. Ressuspender as células iNKT classificados em 1 ml de RPMI 1640 e 40 ul do mesmo adquirir num citómetro de fluxo para avaliar a pureza das células iNKT ordenadas. Selecione FSC-W ^lo DAPI ^- linfócitoss como descrito em 2.2.7. (Figura 2E - G) e electronicamente portão αGalCer / células tetrâmero ^{+ +} iNKT CD3ε CD1d, como mostrado na Figura 2H.

3. Cultura e Expansão do mouse iNKT Cells

Dia 0

1. Revestimento uma placa de 96 poços de fundo plano com anticorpo anti-CD3ε purificados (3 ug / ml) por poço durante 1 h à TA. Lavar duas vezes com 200 ul de PBS 1x e uma vez com 200 ul de meio completo RPMI 1640 (10% vol / vol de FCS, 100 U / ml de penicilina-estreptomicina, 5,5 uM β-mercaptoetanol).
2. Contar o número de células viáveis ​​ordenadas iNKT (passo 2.2.8), utilizando um hemocitómetro 0,4% como em 1.11., Centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 5 x 10 ⁵ células / ml em meio completo RPMI 1640 contendo IL-2 recombinante de murino (10 ng / ml), recombinante IL-12 murina (1 ng / ml) e solúvel de CD28 anti-rato (5 ug / mL). Placasorted células iNKT ⁵ a 10 células / poço em placas revestidas com anti-CD3ε e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ durante 2 dias.

Dia 2

3. Transferir as células para um não revestido de fundo plano de placa de 96 poços de cultura fresco e as células sob condições de repouso, em meio completo RPMI 1640 a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ durante 2 dias.

Dia 4

4. Desalojar as células da placa por pipetagem suave e transferência das células para um novo tubo de 15 ml. Centrifuga-se a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, ressuspender em 5 x 10 ⁵ células / ml em meio completo RPMI 1640 contendo IL-7 recombinante de murino (5 ng / ml), e a placa 10 ⁵ células / poço numa plano- placa de 96 poços de fundo durante 4 dias a 37 ° C em uma incubadora de CO _2.

Dia 8

5. Recolher as células num tubo fresco, centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em 5 x 10 ⁵ culas / ml em meio completo RPMI 1640 contendo anti-CD28 solúvel (5 ug / mL).
6. Revestimento uma placa de 96 poços de fundo plano com anticorpo anti-CD3ε purificados (3 ug / ml) por poço e lavar como em 3.1. Placa 10 ⁵ células / poço em anti-CD3ε placas revestidas e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ até o dia 11.

Dia 11-18

7. Repita os passos 3,4-3,6.

Dia 19-20

8. Transferir as células para um novo tubo de 15 ml, centrifugar a 300 x g e ressuspender em 5 x 10 ⁵ culas / ml em meio completo RPMI 1640.
9. As células em placa a 10 ⁵ células / poço numa placa de 96 poços de fundo plano e permitir que as células em repouso durante 2 dias a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ antes da sua utilização num ensaio.

4. produção de citocinas por células de rato iNKT Usando um CD1d PlatEnsaio de e-bound

1. Revestimento uma placa de 96 poços de fundo plano com 100 uL de murino recombinante CD1d (10 ug / mL em 1x PBS) por poço e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
2. Lavar quatro vezes com 200 ul de PBS 1x, adicionar 200 ul de 2% de FCS em PBS 1x (solução de bloqueamento) por poço e incubar durante 2 horas a 37 ° C.
3. Remover a solução de bloqueio, adicionar 200 ul de αGalCer (5 ng / ul) por poço e incubar a placa a 37 ° C durante 16 horas. [Para a preparação da solução αGalCer, adicionar 1,085 μ 1x PBS para 55 ug de αGalCer dissolvidos em veículo que contém 96 mg / mL de sacarose, 10 mg / ml de desoxicolato de sódio e 5 mg / ml de Tween 20].
4. Após incubação, eliminar a solução e lavar o αGalCer bem duas vezes com 200 ul de PBS 1x seguido por 200 ul de meio completo RPMI 1640.
5. Recolher as células iNKT expandidas in vitro no dia 21, as células de centrifugação a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e ressuspender em R completoPMI 1640 a uma concentração de 0,5 x 10 ⁶ células / ml.
6. Adicionar 200 ul da ressuspensão iTNK célula por poço e incubar durante 72 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO _2.
7. Recolhe-se o sobrenadante e medem citocinas de interesse por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

Isolamento de células mononucleares esplénicas utilizando um gradiente de densidade leva cerca de 1 hora e elimina a utilização de reagentes necessários para a lise de glóbulos vermelhos (RBC). Um elevado rendimento de células viáveis ​​é obtida usando este método e detritos gerados durante a deformação do órgão é removido. Tipicamente, a frequência de células iNKT dentro do conjunto de linfócitos do baço varia entre 1 e 5% de linfócitos T totais no entanto, isto pode variar, dependendo do estado a idade, sexo e saúde d...

Discussão

Etapas críticas do protocolo atual incluem o isolamento e enriquecimento posterior de CD5 ⁺ linfócitos (Seção 1 & 2), FACS classificação (Seção 3) eo revestimento inicial de células iNKT (Seção 4). Dos passos realizados na Seção 1, lembre-se para a camada cuidadosamente a suspensão celular splenic a médio gradiente de densidade tal que uma interfase celulares distintos é gerado após a centrifugação. O enriquecimento posterior para CD5 ⁺ linfócitos por separação magnética de células (Seção 2) mi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material
murino recombinante IL-2	eBiosciences	14-8021
murino recombinante IL-12	eBiosciences	39-8122-65
murino recombinante IL-7	eBiosciences	14-8071
purificado anti-rato CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purificado anti-rato CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugado anti-rato CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugado anti-rato CD8α (53-6,7)	eBiosciences	48-0081-82
CD5 anti-rato conjugado com FITC (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
CD3&épsilon anti-rato conjugado com V500; (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microesferas	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purificado anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 médio	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - livre]
Soro fetal de bezerro	Gibco	10270
L-Glutamina	Gibco	25030-123
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Albumina	de soro bovinoSigma-Aldrich	A7906-100MG&
beta;-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipamento
Placa de 96 poços	Fundo F Greiner-bio one	657-160
Placa de 24 poços	Greiner-bio one	665-180
Placa de 6 poços	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tubo	Greiner-bio one	188-271
tubo de falcão de 50 ml	Greiner-bio one	227-261
70 µ filtro m	Greiner-bio one	542-070
30 µ m filtro	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separador	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Colunas	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Incubadora de CO2 com camisa de água	VWR
Hemocitômetro	VWR
Kit de dissecção	VWR
BD FACSAria III	BD Biociências