Artigo de método

Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

DOI:

10.3791/53261

⸱

16 de outubro de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo para triagem de drogas moleculares pequenas baseado na síntese in-situ de nanoclusters de ouro fluorescentes ultrapequenos (Au NCs) usando proteína carregada de drogas como modelo é apresentado. Este método é simples para determinar a afinidade de ligação de drogas a uma proteína-alvo por um sinal fluorescente visível emitido pelos NCs de Au moldados por proteínas.

Resumo

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Nós demonstramos um novo método de rastreio de fármacos para a determinação da afinidade de ligação de pequenas moléculas de droga a uma proteína-alvo através da formação de nanopartículas de ouro (Au fluorescentes CN) dentro da proteína carregadas com fármaco, com base no sinal diferencial fluorescência emitida pela UA CN. Proteínas, tais como albumina de soro de albumina humana (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são seleccionados como as proteínas modelo. Quatro pequenas drogas moleculares (por exemplo, ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida) de diferentes afinidades de ligação para as proteínas de albumina são testados. Verificou-se que a taxa de formação de Au CNs fluorescentes no interior do fármaco carregado proteína albumina sob condições desnaturantes (por exemplo, 60 ° C ou na presença de ureia) é mais lento do que se formou na proteína primitiva (sem droga). Além disso, a intensidade de fluorescência do SAE-formado como se encontra a ser inversamente correlacionadas com as afinidades de ligação destas drogas para as proteínas de albumina. Particularmente,quanto maior a afinidade da proteína de ligação de drogas, mais lenta é a taxa de formação de Au CNs, e, assim, uma intensidade de fluorescência menor do Au CNs resultante é observado. A intensidade de fluorescência das resultantes Au CNs, por conseguinte, fornece uma medida simples da força de ligação relativa de diferentes fármacos testados. Este método também é extensível para medir a constante de ligação específica à proteína droga (K D) variando simplesmente o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína a uma concentração fixa de proteína. Os resultados medidos correspondem bem com os valores obtidos usando outros métodos de prestígio mas mais complicados.

Introdução

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Albuminas do soro tais como albumina do soro humano (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são a proteína mais abundante no plasma e desempenham um papel fundamental na manutenção da pressão osmótica do compartimento de sangue. Eles também são reconhecidos como proteínas veículo para moléculas pequenas de baixa solubilidade em água, tais como esteróides, ácidos gordos, hormonas da tiróide, e uma vasta variedade de drogas. A propriedade de ligação (por exemplo, locais de ligação, a afinidade de ligação ou a resistência) dessas moléculas de soro de albuminas forma um tópico importante na farmacocinética. 1-4 vários métodos analíticos foram desenvolvidos para estudar as propriedades de ligação de drogas diferentes para as albuminas do soro, tal como cristalografia de raios-X, 5,6 ressonância magnética nuclear (RMN), 7-11 e de ressonância de plasmon de superfície (SPR), 12,13 etc. No entanto, estes métodos estão limitados por qualquer um processo de análise tediosa e consumidora de tempo (por exemplo, crescimento de cristal único para Crystallo de raios-Xestudo gráfico), a exigência de equipamento especializado e caro (SPR), ou em necessidade de marcação isotópica dispendioso (RMN) para a detecção. Por conseguinte, é altamente desejável desenvolver formas alternativas de pequena seleção da droga molecular de uma maneira rápida, simples e direta, e custo-eficiente.

Nanopartículas de ouro (Au NCs) são um tipo especial de nanomaterial, que contêm várias dezenas de átomos de metal com tamanhos inferiores a 2 nm. 14-17 Eles têm atraído interesses de investigação extensas, devido à sua estrutura eletrônica discreta e dependentes de tamanho, 18, 19 e molecular como absorções e emissões. 20-23 Tais propriedades de materiais exclusivos, em particular a forte fluorescência, foram encontradas diversas aplicações, tais como detecção e visualização em sistemas biológicos. 24-32 ultrasmall fluorescente Au NCs pode ser sintetizado usando proteínas funcionais, tais como albuminas do soro, como molde. 33 Numa síntese típica da modelada por proteínas Au CNs, uma certa quantidade de sais de Au são encapsulados no interior da primeira proteína e subsequentemente reduzido pela própria proteína. A capacidade de reduzir a proteína é atribuída a constitutivos funcionais resíduos de aminoácidos (por exemplo, tirosina) que podem ser activados pelo aumento do pH da solução para alcalino. Desdobramento da estrutura da proteína é considerada como um passo crítico para a formação de Au NCs. Isto porque, em uma proteína desdobrada, os grupos funcionais mais redutores podem ser expostas a A UA sais encapsulados. Proteína se desdobrar pode ser alcançada por tratamento com calor ou a exposição a agentes desnaturantes. Introdução de pequenas drogas moleculares também pode afetar o processo de desdobramento, ou seja, modificação da temperatura de desnaturação do ponto médio e a entalpia de desdobramento. 34,35 O efeito de todos esses fatores, por sua vez, pode ser refletido pela cinética de formação de fluorescente Au NCs e manifestado em a intensidade de fluorescência resultantes Au NCs. 36

e_content "> Este vídeo demonstra o método de rastreio de fármacos através da síntese de Au CN de proteínas de albumina carregadas com fármaco a uma temperatura mais elevada (60 ° C) ou na presença de agentes desnaturantes (por exemplo, ureia). A intensidade da fluorescência resultante Au CNs é a leitura do sinal. Em primeiro lugar, Au CNs são sintetizados em moldes HSA e BSA tratadas a 60 ° C ou na presença de ureia para mostrar como a proteína se desdobrar (induzida por tratamento térmico ou desnaturantes) afecta a cinética de formação de Au NCs. Em segundo lugar, Au CNs são sintetizados em moldes de proteína pré-carregadas com drogas diferentes, e o efeito de carga da droga sobre as intensidades de fluorescência relativas dos resultante Au CNs é estudada, que fornece a medida da força de ligação relativa. Finalmente, o protocolo de rastreio Au NC-droga é modificada para medição quantitativa de proteína-droga constante de ligação (K D) variando o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína de uma concentração fixa.

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Protocolo

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Atenção: Por favor, consultar as fichas de segurança (SDS) de todos os produtos químicos envolvidos antes de usar. A experiência de rastreio de drogas envolve a síntese e manipulação de nanomateriais, que podem ter riscos adicionais em comparação com o seu homólogo grandes quantidades. Por favor, garantir todas as medidas de controlo necessárias para ser praticado durante todo o experimento, incluindo o uso de controles de engenharia (extractor de fumo) e equipamentos de proteção individual (EPI, por exemplo, calças de comprimento de segurança, sapatos fechados, luvas resistentes a produtos químicos, e óculos de segurança).

1. Preparação de reagentes químicos para Rastreio de drogas

  1. Os precursores para a síntese de Au CNs
    1. Dissolve-se 30 mg de uma solução de ouro (III), cloreto (99,99% base metais vestigiais, 30 p.% Em ácido clorídrico diluído) em 6,9 ml de água ultrapura para preparar 15 mM de (III) solução de cloreto de ouro. Cuidado: solução de cloreto de ouro é corrosivo e irritante. Utilizar EPI adequado para evitar o contato direto com os olhos ea pele.
    2. Dissolve 74 mg de HSA ou de BSA em 1 ml de água ultrapura para preparar a 74 mg / ml de solução-mãe de proteínas.
  2. As soluções de fármaco
    1. Dissolve-se a quantidade desejada de droga, por exemplo, 1,9 mg de (um) de ibuprofeno, 2,8 mg de (b), a varfarina, 2,3 mg de (c), fenitoína, e 1,5 mg de (d) sulfanilamida em 20 ul de DMSO para preparar a 450 mM das soluções de droga.
      Nota: DMSO é seleccionado como solvente porque estas drogas são hidrofóbicos e têm baixa solubilidade em água.
  3. Outros reagentes
    1. Dissolve-se 600 mg de pastilhas de NaOH em 10 ml de água ultrapura para preparar a 1,5 M de solução de NaOH. Dissolve-se 2,4 g de ureia em 2 ml de água ultrapura para preparar a 20 M de solução de ureia.

2. Síntese de Templated-Protein Au NCs

  1. HSA-templated Au NCs (HSA-Au CNs)
    1. Coloque dois frascos de vidro, cada uma contendo um micro barra magnética nele, em dois de temperatura separado de agitação magnética controlávelRER.
    2. Ajustar a temperatura de um agitador magnético a 60 ° C, e Rotular o frasco de vidro em cima dele como "60 ° C"; enquanto o outro agitador magnético é mantida à temperatura ambiente (RT), em que o frasco de vidro em cima do que é rotulado como "RT".
    3. Adicionar 200 ul de solução de HSA, 200 ul de água ultrapura, e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de para cada frasco, sob agitação constante (definida como 360 rpm, a menos que especificado de outro modo) para permitir o encapsulamento de Au iões dentro do modelo de proteína.
    4. 2 minutos mais tarde, adicionar 20 ul de uma solução de NaOH a cada frasco, de modo a activar a capacidade redutora do conjugado de HSA na formação de Au CNs e começar a gravar o tempo de reacção como 0 min.
    5. Cada 20 minutos, extrair 50 mL de soluções de cada da amostra para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão com um leitor de microplacas. A configuração de varredura típico: λ ex = 370 nm, em = λ 410-850 nm.
    6. Parar o agitador magnético após 100 min.
    7. Arrefecer os frascos de vidro com água corrente em uma pia. Atenção: Os frascos de vidro estiverem quentes. Usar luvas resistentes ao calor para evitar a queima.
    8. Traça-se a espectros de fotoemissão em todo o tempo, para cada amostra para obter a cinética de formação de Au CNs em diferentes condições de temperatura.
  2. BSA-templated Au NCs (BSA-Au CNs)
    1. Colocar num frasco de vidro contendo um micro barra de agitação magnética no topo de um agitador magnético. Deixar a temperatura como a temperatura ambiente.
    2. Misturar 200 ml de solução de BSA, 200 ul de ureia, e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de dentro do recipiente de vidro sob agitação constante.
    3. 2 minutos mais tarde, adicionar 20 ul de uma solução de NaOH para activar a capacidade redutora de BSA para formar Au CNs e começar a gravar o tempo de reacção como 0 min. Medir o espectro de fotoemissão da mistura de reacção por hora.
      Nota: O espectro de fotoemissão de BSA-Au NCs é medidomenos frequentemente porque a taxa de formação de BSA-au CNs é mais lento do que o de HSA-Au, à mesma temperatura, devido à menor eficácia de ureia para desdobrar a proteína.
    4. Parar o agitador magnético após 7 h. Traçar o espectro de fotoemissão em todos os tempos para ver a cinética de formação de Au NCs por uréia desnaturação.

3. Apresentação de pequeno Drogas Molecular

  1. Tela afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos para HSA
    1. Coloque cinco frascos de vidro, cada uma contendo uma barra de agitação magnética, em que, na parte superior de uma temperatura controlável multiponto agitador magnético. Rotular estes frascos como a, b, c e d, respectivamente, para cada fármaco, ou seja, o ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida. Rotular a um puro com HSA como controle.
    2. Adicionar 200 mL de HSA a cada frasco. Adicionar 1 ml de solução de fármaco para os quatro frascos correspondentes. Adicionar 1 ml de DMSO com o controlo. Ligue o agitador e definir a velocidade de rotação para 360rpm e incubar durante 1 h para permitir a ligação à ASH de drogas para completar.
    3. 1 h depois, adicionar 200 mL de água Milli-Q e 200 ul de solução de ouro (III), cloreto de para cada frasco, sob agitação constante. Ajustar a temperatura para 60 ° C, sob agitação constante durante 10 min. Adicionar 20 mL de NaOH 1,5 M a cada frasco e começar a gravar o tempo de reação como 0 min.
    4. Desenhar se rapidamente 50 ml de solução a partir de cada frasco para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão (resultados rotulado como 0 min). Grave os espectros de emissão de cada amostra a cada 10 min. Recolher pelo menos quatro espectros no tempo diferente de quatro, que é 0, 10, 20, e 30 min.
    5. Repita os passos 3.1.1 - 3.1.4 várias vezes para se obter resultados com uma tendência consistente. Parar o agitador magnético.
    6. Traçar o espectro de fotoemissão resolvida no tempo para cada amostra (a - d, e controle). Identificar o pico de intensidade de todas as amostras e conspiração contra o tempo para comparar a cinética de formação de Au NCs em dimodelos fferent proteína carregado de drogas.
  2. Medir a constante de ligação de um fármaco específico para HSA
    1. Repita os passos 3.1.1 - 3.1.4. Substitua a solução de um fármaco com soluções de ibuprofeno em quatro concentrações diferentes (incluindo uma amostra de controlo usando HSA só que sem a carga de droga). Rotular o frasco de vidro de acordo com a concentração do fármaco correspondentemente.
    2. 10 min mais tarde, arrefecer os frascos de vidro com água corrente em uma pia. Atenção: Os frascos de vidro estiverem quentes. Usar luvas resistentes ao calor para evitar a queima.
    3. Desenhar 50 ul das soluções acima a partir de cada frasco para uma placa preta de 384 cavidades e medir o espectro de emissão.
    4. Repita os passos 3.2.1 - 3.2.3 mais duas vezes para se obter mais dois conjuntos de resultados em diferentes concentrações da droga.
    5. Parar o agitador magnético. Traçar o espectro de fotoemissão e analisar os resultados.
      1. Para os dados brutos obtidos em cada lote individual traçar o espectro de fotoemissão de cadaamostra em software como o software OriginPro e descobrir a intensidade de pico.
      2. Calcular e representar graficamente a intensidade relativa de fluorescência [(I 0 - I) / I 0] contra a concentração de fármaco, e onde I I 0 referem-se a intensidade de fluorescência de Au CNs formado no carregadas com droga HSA e HSA puro, respectivamente.
      3. Calcula-se a constante de ligação através do ajuste dos dados a um modelo único local de ligação utilizando a equação de Michaelis-Menten: Y = Rmax × C / (K D + C), onde R max indica o sinal de resposta máxima, C é a concentração do ligando e K D a constante de ligação é. Execute isso em software como OriginPro. Selecione o menu Análise Fitting Nonlinear Curve Fit, em seguida, selecione a função monte de Crescimento / categoria Sigmoidal. No Settings: página Seleção de Função, clique em Ajustar a mostrar-se os resultados embutidos.

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Resultados

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Proteína desdobramento é um procedimento importante para a formação de proteínas modeladas por Au CNs porque os grupos funcionais mais reactivos (por exemplo, resíduos de tirosina de uma proteína) pode ser exposto a reduzir os iões Au encapsulado e, assim, acelerar a velocidade de formação de Au NCs. Os agentes de desnaturação e de aquecimento externo são dois meios comuns para promover o processo de desdobramento da proteína. A Figura 1 demonstra o efeito do aquecimento e adição de agentes des...

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Discussão

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Há vários passos críticos que precisam ser destacadas neste método. No protocolo de rastreio da afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos, Passos 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e são críticas para se obter bons resultados que mostram tendência consistente para a força de ligação relativa. Nestas etapas, as acções de adição de produtos químicos e de desenho soluções de reacção para a medição devem ser tão rapidamente quanto possível para minimizar o efeito de atraso no tempo e a mesma sequência de adi...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Y.N.T. gostaria de agradecer à Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR), Cingapura, pelo apoio financeiro sob a concessão JCO CDA 13302FG063.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de cloreto de ouro (III), 30%Sigma-Aldrich484385Albumina sérica humana corrosiva e irritante
, 96%Sigma-AldrichA1887
Albumina de soro bovino, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofeno, 98%Sigma-AldrichI4883 
varfarina, 98%Sigma-AldrichA2250
fenitoínaSigma-AldrichPHR1139
sulfanilamida, 99%Sigma-AldrichS9251
dimetilsulfóxidoSigma-AldrichD8418
uréiaSigma-AldrichU5128
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich
Agitador magnéticoIKART5
Leitor de microplacasTecanInfinite M200
Placa de 384 poçosCorning
Pipeta de deslocamento de ar de 5 mlEppendorf
1.000 μ l pipeta de deslocamento de arEppendorf
100 μ l pipeta de deslocamento de arEppendorf
5.000 μ l Pontas
1.000 μ l Pontas
100 μ l Eppendorf dicas
1,5 mlEppendorf
frasco de vidro de 20 ml com tampa de
Frasco de vidro de 4 ml com tampa de
221465EppendorfEppendorf microtubo de rosca rosca

Referências

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Fluorescent Gold NanoclustersProtein Targeting Drug ScreeningBinding Affinity MeasurementHuman Serum AlbuminFluorescence Intensity AnalysisGold Nanocluster FormationDrug Protein Binding ConstantMicroplate Reader EmissionTemperature Denaturing ConditionsUrea Denaturation Method

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