Uma rápida e quantitativa método fluorimétrico para-Targeting proteína pequena molécula Rastreio de drogas

Resumo

Um protocolo para triagem de drogas moleculares pequenas baseado na síntese in-situ de nanoclusters de ouro fluorescentes ultrapequenos (Au NCs) usando proteína carregada de drogas como modelo é apresentado. Este método é simples para determinar a afinidade de ligação de drogas a uma proteína-alvo por um sinal fluorescente visível emitido pelos NCs de Au moldados por proteínas.

Resumo

Nós demonstramos um novo método de rastreio de fármacos para a determinação da afinidade de ligação de pequenas moléculas de droga a uma proteína-alvo através da formação de nanopartículas de ouro (Au fluorescentes CN) dentro da proteína carregadas com fármaco, com base no sinal diferencial fluorescência emitida pela UA CN. Proteínas, tais como albumina de soro de albumina humana (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são seleccionados como as proteínas modelo. Quatro pequenas drogas moleculares (por exemplo, ibuprofeno, a varfarina, fenitoína, e sulfanilamida) de diferentes afinidades de ligação para as proteínas de albumina são testados. Verificou-se que a taxa de formação de Au CNs fluorescentes no interior do fármaco carregado proteína albumina sob condições desnaturantes (por exemplo, 60 ° C ou na presença de ureia) é mais lento do que se formou na proteína primitiva (sem droga). Além disso, a intensidade de fluorescência do SAE-formado como se encontra a ser inversamente correlacionadas com as afinidades de ligação destas drogas para as proteínas de albumina. Particularmente,quanto maior a afinidade da proteína de ligação de drogas, mais lenta é a taxa de formação de Au CNs, e, assim, uma intensidade de fluorescência menor do Au CNs resultante é observado. A intensidade de fluorescência das resultantes Au CNs, por conseguinte, fornece uma medida simples da força de ligação relativa de diferentes fármacos testados. Este método também é extensível para medir a constante de ligação específica à proteína droga (K _D) variando simplesmente o conteúdo de medicamento pré-carregado na proteína a uma concentração fixa de proteína. Os resultados medidos correspondem bem com os valores obtidos usando outros métodos de prestígio mas mais complicados.

Introdução

Albuminas do soro tais como albumina do soro humano (HSA) e de albumina de soro bovino (BSA) são a proteína mais abundante no plasma e desempenham um papel fundamental na manutenção da pressão osmótica do compartimento de sangue. Eles também são reconhecidos como proteínas veículo para moléculas pequenas de baixa solubilidade em água, tais como esteróides, ácidos gordos, hormonas da tiróide, e uma vasta variedade de drogas. A propriedade de ligação (por exemplo, locais de ligação, a afinidade de ligação ou a resistência) dessas moléculas de soro de albuminas forma um tópico importante na farmacocinética. ^1-4 vários métodos analíticos foram desenvo....

Protocolo

Atenção: Por favor, consultar as fichas de segurança (SDS) de todos os produtos químicos envolvidos antes de usar. A experiência de rastreio de drogas envolve a síntese e manipulação de nanomateriais, que podem ter riscos adicionais em comparação com o seu homólogo grandes quantidades. Por favor, garantir todas as medidas de controlo necessárias para ser praticado durante todo o experimento, incluindo o uso de controles de engenharia (extractor de fumo) e equipamentos de proteção individual (EPI, por exemplo, calças de comprimento de segurança, sapatos fechados, luvas resistentes a produtos químicos, e óculos de segurança).

1. Prep....

Resultados

Proteína desdobramento é um procedimento importante para a formação de proteínas modeladas por Au CNs porque os grupos funcionais mais reactivos (por exemplo, resíduos de tirosina de uma proteína) pode ser exposto a reduzir os iões Au encapsulado e, assim, acelerar a velocidade de formação de Au NCs. Os agentes de desnaturação e de aquecimento externo são dois meios comuns para promover o processo de desdobramento da proteína. A Figura 1 demonstra o efeito do aquecimento e adição de agentes des.......

Discussão

Há vários passos críticos que precisam ser destacadas neste método. No protocolo de rastreio da afinidade de ligação relativa das diferentes drogas moleculares pequenos, Passos 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e são críticas para se obter bons resultados que mostram tendência consistente para a força de ligação relativa. Nestas etapas, as acções de adição de produtos químicos e de desenho soluções de reacção para a medição devem ser tão rapidamente quanto possível para minimizar o efeito de atraso no tempo e a mesma sequência de adi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de cloreto de ouro (III), 30%	Sigma-Aldrich	484385	Albumina sérica humana corrosiva e irritante
, 96%	Sigma-Aldrich	A1887
Albumina de soro bovino, 96%	Sigma-Aldrich	A2153
Ibuprofeno, 98%	Sigma-Aldrich	I4883
varfarina, 98%	Sigma-Aldrich	A2250
fenitoína	Sigma-Aldrich	PHR1139
sulfanilamida, 99%	Sigma-Aldrich	S9251
dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D8418
uréia	Sigma-Aldrich	U5128
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich
Agitador magnético	IKA	RT5
Leitor de microplacas	Tecan	Infinite M200
Placa de 384 poços	Corning
Pipeta de deslocamento de ar de 5 ml	Eppendorf
1.000 μ l pipeta de deslocamento de ar	Eppendorf
100 μ l pipeta de deslocamento de ar	Eppendorf
5.000 μ l Pontas
1.000 μ l Pontas
100 μ l Eppendorf dicas
1,5 ml	Eppendorf
frasco de vidro de 20 ml com tampa de
Frasco de vidro de 4 ml com tampa de

221465EppendorfEppendorf microtubo de rosca rosca