Artigo de método

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

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DOI:

10.3791/53268

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13 de novembro de 2015

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1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve uma nova técnica que permite a detecção da expressão gênica intracelular após a endocitose de nanopartículas marcadas com fluorescência diretamente em células vivas. O método não requer manipulação das células e não é restrito em relação ao gene ou espécie alvo.

Resumo

A reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) foi realizada com sucesso em diferentes espécies de mamíferos, incluindo camundongos, ratos, humanos, porcos e outros. A verificação de clones iPS depende principalmente da detecção da expressão endógena de diferentes genes de pluripotência. Esses genes representam principalmente fatores de transcrição localizados no núcleo da célula. Tradicionalmente, a comprovação de sua expressão endógena é fornecida pela coloração imuno-histoquímica após a fixação das células. Essa abordagem requer culturas replicadas de cada clone neste estágio inicial para preservar clones validados para experimentos futuros. O presente protocolo descreve uma abordagem com nanopartículas gene-específicas que permite a avaliação da expressão gênica intracelular diretamente em células vivas por fluorescência. As nanopartículas consistem em uma partícula central de ouro acoplada a uma fita de captura que carrega uma sequência complementar ao mRNA alvo, bem como uma fita repórter extinta. Essas nanopartículas são ativamente endocitadas e o mRNA alvo desloca a fita repórter que então começa a fluorescer. Portanto, a expressão do gene alvo específico pode ser detectada diretamente sob o microscópio. Além disso, a fluorescência emitida permite a identificação, isolamento e enriquecimento de células que expressam um gene específico por citometria de fluxo. Este método pode ser aplicado diretamente a células vivas em cultura sem qualquer manipulação das células-alvo.

Introdução

Em 2006, uma nova abordagem foi descrita para reprogramar células somáticas para um estado pluripotente. Depois prescreening de uma série de fatores de reprogramação potencial fibroblastos de murino pode ser convertido com êxito para as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por transdução retroviral e superexpressão de quatro fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Posteriormente esta técnica efetivamente foi reproduzido com células somáticas de diferentes espécies de mamíferos, incluindo os seres humanos 2, 3 macacos, ratos, cães 4 5 6, ovelhas e porcos 7. Além disso, os protocolos modificado omitindo ou substituir o factor de transcrição de c-MYC potencialmente oncogénica foram publicados 8, 9.

Independentemente da reprogramação inicial aproximar o verdadeiro pluripotência das colónias em crescimento tem de ser confirmada, uma tarefa trabalhosa e demorada. Uma grande desvantagemda maioria destas análises é que eles não podem ser realizados em células vivas. Factores de pluripotência estabelecidos, tais como OCT4, SOX2, NANOG ou Rex1 representam factores de transcrição localizados no núcleo e a sua detecção requer a fixação das células antes da sua imuno-histoquímica ou a lise das células por análise de RT-PCR 10 -. 12 Em seguida, estas células são perdidas para futuro experimentos que requerem culturas réplica de cada colônia.

Assim, uma tecnologia para analisar pluripotência em células vivas é altamente desejável. Várias abordagens podem, efectivamente, ser realizada diretamente sobre as células vivas utilizando anticorpos dirigidos contra antigénios de membrana à base (por exemplo. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente relatado corantes para detectar 13 ou fosfatase alcalina moléculas pequenas que etiqueta especificamente estaminais embrionárias (ES) e células iPS 14. No entanto, os anticorpos podem, no entanto, afetar negativamente as células e cada methOD é restrito a um único marcador pluripotência. Finalmente, beacons moleculares fluorescentes, os oligonucleótidos anti-sentido com dupla-estruturas em gancho de cabelo, que permitem coloração vivo de células, têm sido descritos 15. Embora esta abordagem pode ser aplicada a muitos genes, a técnica requer nucleofection de uma suspensão de células individuais, que não é aplicável às crescentes iPS colónias.

Um par de anos atrás nanopartículas específicos do gene têm sido descritas para analisar a expressão de survivina em células de câncer de mama SKBR3 humanos 16. Este manuscrito descreve uma abordagem inovadora romance para detectar marcadores de pluripotência em ES vivos e células iPS através da utilização de conjugados de nanopartículas de ouro. Estas nanopartículas consistem de um centro de partículas de ouro com uma mecha de captura acoplados transportando a sequência de ARN complementar e um fio repórter marcado com Cy3. O sinal de fluorescência do fio repórter é extinta pela partícula de ouro central. Além disso, adequadonanopartículas servem como controlos negativos e positivos, respectivamente (Figura 1). Para uma aplicação das nanopartículas são simplesmente adicionados ao meio de cultura (Figura 2) e entram nas células através de endocitose (Figura 3). Se o RNA alvo é expresso que desloca a cadeia repórter que, em seguida, emite-se um sinal fluorescente. Este método não requer manipulação da célula alvo e a expressão do gene alvo pode ser monitorizado opticamente sob um microscópio de fluorescência directamente em células vivas. Além disso, a tecnologia pode ser aplicada a qualquer gene alvo desejado entre espécies no caso de células iPS e, assim, podem ser empregues em muitas áreas de investigação diferentes. Finalmente, análises de citometria de fluxo permite a identificação e o enriquecimento de células positivas Cy3.

Protocolo

1. Preparação de Mídia, Reagentes e Condições de cultura celular

  1. Humano HEK 293 células de rim embrionário
    1. Culturas células HEK 293 (CRL-1573, ATCC) em meio F-12 DMEM / Ham suplementado com 5% de FCS, L-glutamina (2 mM) e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 ug / mL).
    2. Para passagem, as células, lave as células uma vez com PBS, adicionar 0,05% de tripsina / EDTA e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Transferência de células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm (300 x g) e transferir cerca de 5x10 5 células em um frasco de cultura T25 fresco.
  2. Fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs)
    1. Adicionar 1 ml de uma solução de gelatina a 0,1% a cada 6 poços e incubar à temperatura ambiente (TA) durante 1 h. Aspirar líquido e armazenar a RT até o uso.
    2. Cultura MEFs em DMEM suplementado com 10% de FCS, L-glutamina (2 mM), L-glicose (4,5 g / l), piruvato de sódio (1 mM) e penicilina (100 U /ml) / estreptomicina (100 ug / ml) em placas de 6 poços revestidos com gelatina.
    3. Distribuir MEFs em placas de 6 poços e deixá-los crescer até confluência. Adicionar mitomicina (5 ug / ml) durante 2,5 horas para reter as células. Aspirar o meio, lavar as células duas vezes com meio completo e MEF adicionar 3 ml de meio para cada MEF de 6 poços. Estas células servir como uma camada de alimentação para as células iPS murino e suína.
  3. Cultura do ES murino e células iPS
    1. Para preparar rato ES meio de cultura, suplemento de meio DMEM com FCS 15%, L-glutamina (2 mM), L-glicose (4,5 g / L), aminoácidos não essenciais MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM) e factor inibidor de leucemia (1.000 U / ml).
    2. Lavar 6-poços com MEFs preso-crescimento uma vez com DMEM isento de soro, adiciona-se 2 ml de rato ES meio e as células iPS de murino (20% das células de um prato confluente). A cada dia de lavagem de células uma vez com DMEM isento de soro e adicionar 2 ml do rato fresco médias ES.
    3. Para passagem, as células, lavar cada poço uma vez com DMEM isento de soro, adicionar 00,25% de tripsina / EDTA e incubar durante 3 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Células transferir para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm (300 x g), Ressuspender as células em 500 ul de rato meio ES e adiciona-se 100 ul da suspensão a 2 ml rato meio ES num fresco de 6 poços com um MEF feeder-layer.
  4. Cultura de células iPS porco
    1. Para preparar porco meio IPS, complementar DMEM / Ham F-12 com 20% de soro de nocaute, L-glutamina (2 mM), aminoácidos não essenciais MEM (1x), β-mercaptoetanol (0,1 mM) e penicilina (100 U / mL) / estreptomicina (100 ug / mL). Filtrar através de um filtro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C durante 2 a 3 semanas. Após a primeira utilização, adicionar bFGF (10 ng / ml concentração final).
    2. Lavar 6-poços com MEFs preso-crescimento uma vez com DMEM isento de soro / F-12 e adicionar 1,5 ml de porco iPS médias de Ham e suína células iPS (10% das células de um prato confluente). A cada dia Lave as células uma vez com DMEM isento de soro / F-1 de Ham2 e adicionar 1,5 ml de suíno fresca médias iPS.
    3. Para preparar tampão de dissociação adicionar 2,5% de tripsina, colagenase IV (10 mg / ml), soro nocaute (20%) e CaCl2 (1 mM) ao Ca2 + livre de PBS. Lavar as células duas vezes com PBS e incuba-se com tampão de dissociação durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO 2. Células transferir para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm (300 x g).
    4. Ressuspender as células iPS porcinas em 500 ul de meio fresco porco ips e adicionar 50 ul de suspensão a 1,5 ml de meio de porco iPS num fresco de 6 poços com um alimentador de camada MEF. A cada dia de lavagem de células uma vez com DMEM isento de soro / de Ham F-12 e adicionar 1,5 ml de suíno fresca médio iPS.
  5. Cultura sem alimentador de células iPS humanas
    1. Descongelar o recipiente original contendo a preparação de membrana basal a 4 ° C e dilui-se com DMEM isento de soro, arrefecido em gelo / F-12 para 8 mg / ml, e alíquotas de Ham armazenamento a -20 ° C até à sua utilização.
    2. Descongelar uma aliquota da basepreparação de membrana mento a 4 ° C e diluir com DMEM / F12 gelado isento de soro de Ham (90 ug / mL). Pipete 1 ml desta solução em 3 cm placas de cultura e agitar suavemente para assegurar que toda a superfície é coberta. Selar pratos com parafilme e armazenar a 4 ° C por até uma semana. Antes do uso para cultura de células incubar os pratos durante 30 min a 37 ° C ou 3 horas à temperatura ambiente para permitir que a polimerização da preparação da membrana basal.
    3. Aspirar o meio a partir de placas revestidas com a preparação da membrana basal e lavar duas vezes com DMEM isento de soro / de Ham F-12. Adicionar 1,5 ml de meio E8 para o prato de cultura e as células humanas do iPS (10% das células de um prato confluente). A cada dia de lavagem de células uma vez com DMEM isento de soro / F-12 e adicionar 1,5 ml de meio fresco E8 de Ham.
    4. Para a passagem das células, lavar pratos duas vezes com PBS e adicionar 1 ml PBS / EDTA 0,5 mM. Incubar os pratos durante 5 min à TA. Monitorar as células em um microscópio. Nota: Quando as colônias começam a arredondar para cima e appear para ter buracos que eles estão prontos para transferência.
    5. Aspirar o líquido, adicionar 1,5 ml de meio E8 e retirar células cuidado pipetando para cima e para baixo. Transferência de células para um tubo de 15 ml, centrifuga-se durante 5 min a 1.200 rpm (300 x g), ressuspender em 500 ul de meio E8 e adicionar 50 ul de suspensão a 1,5 ml de meio E8 em um prato de cultura fresca revestida com a preparação da membrana basal .

2. Projeto de target-sequências entre espécies Borders

  1. Selecionar humano de referência, murino e sequências de cDNA suína dos genes-alvo (GAPDH, NANOG, GDF3) e realizar uma análise de alinhamento multi-seqüência CLUSTAL.
    Nota: Este indicará as sequências homólogas entre as espécies.
    1. Use as seguintes configurações para alinhamento múltiplo: penalidade de lacuna (fixa) 10, penalidade de intervalo (variando) 5, a transição de ponderação 0, gama gap pena de separação 8,% de identidade por atraso 40, número máximo de iterações para executar 3.
  2. Enviar sequências alvo desejados com o fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para o projeto da sonda e de fabricação.
    Nota: O fabricante, então, confirmar a compatibilidade de sequência desejada com a tecnologia. Se sequência desejada não for compatível, o fabricante irá sugerir seqüências alternativas.
    1. Assegurar que as regiões homólogas que podem ser utilizados como potenciais sequências de captura de cadeia tem um comprimento de 27 pb.
      Nota: É aconselhável hora vários nanopartículas com diferentes cadeias de captura para um gene alvo seleccionado como só a experiência celular verdadeiro irá dar uma prova definitiva da funcionalidade de uma sequência individual. Portanto, duas sequências diferentes para GAPDH e GDF3 foram avaliadas enquanto três diferentes nanopartículas foram testados para avaliar a expressão de NANOG. A sua localização e as sequências exatas já foram publicados 17. O fabricante produz comercialmente o nanopartigos com sequências desejadas e fornece-los em formato liofilizado.

3. Reconstituição dos Nanopartículas e Adição de culturas de células

  1. Armazenar nanopartículas liofilizados aquando da recepção a 4 ° C no escuro.
  2. Reconstituir nanopartículas por adição de 50 uL de água duplamente destilada que dá uma concentração final de 100 nM. Uma vez reconstituído armazenar nanopartículas à TA no escuro. Nota: Sob esta condição são estáveis ​​durante pelo menos um ano. O armazenamento de amostras reconstituídas a 4 ° C, pode afectar negativamente a sua estabilidade.
  3. Pré-diluir a solução de estoque de nanopartículas com PBS a uma concentração de 2 (células HEK 293) ou 8 nM (IPS e células ES) no dia da aplicação. Nota: Esta concentração é 20 vezes mais elevada do que a concentração final na placa de cultura. Em células ES e células iPS, 400 pM de nanopartículas induziu um sinal fluorescente facilmente detectáveis ​​ao microscópio. Para células HEK 293, AConcentration de 100 pM é suficiente.
  4. Pipetar 12,5 uL de nanoparticulas pré-diluído para uma 237,5 ul de meio de cultura celular completo, contendo 24 poços. Para poços de tamanhos diferentes, ajuste os volumes em conformidade. Agitar a placa cuidadosamente para assegurar a igualdade de distribuição das nanopartículas. Incubar as células durante a noite (O / N) a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada.
  5. No dia seguinte análise de culturas de células específicas do gene Cy3 de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 546 nm (emissão de 575-640 nm) em um microscópio de fluorescência. Nota: O período necessário para obter uma fluorescência suficientemente forte pode depender do tipo de célula e o gene alvo. Nestas experiências, isto foi observado entre 16 e 20 horas após a aplicação da sonda.

4. Identificação de Cy3 positivos populações de células por citometria de fluxo

  1. Crescer HEK 293 ou células-tronco embrionárias de murino utilizando as condições especificadas no ponto 1.1 ou 1.3, respectively. Um dia antes da análise FACS adicionar GAPDH nanopartículas espec�icos a diferentes concentrações de células HEK 293 (ver Figura 6A) e de 400 pM para as células ES murinas. Incubar as células O / N a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada.
  2. Analise de culturas de células de fluorescência induzida por Cy3 específico do gene sob um microscópio de fluorescência.
  3. Retire HEK 293 células como especificado no ponto 1.1.2. Centrifugar, transferir para um tubo de 1,5 ml e ressuspender em 200 ul de PBS gelado / BSA a 0,5% / (tampão FACS) 2 mM de EDTA. Manter células escuras em gelo até à análise por citometria de fluxo.
  4. Retire células-tronco embrionárias de murino, conforme especificado no ponto 1.3.3. Centrifugar, transferir para um tubo de 1,5 ml e ressuspender em 200 ul de PBS gelado / BSA a 0,5% / EDTA a 2 mM. Manter células escuras em gelo até à análise por citometria de fluxo.
  5. Pressionar as células através de um filtro de 30 | iM para prevenir a agregação celular e adiciona-se iodeto de propídio (concentração final de 2 ug / ml) 2 minantes da análise FACS para excluir as células mortas.
  6. Para analisar as células Cy3-positivos primeiro set portões hierárquicos sobre o FSC-A / SSC-Um subconjunto, o FSC-H / FSC-W-subconjunto ea SSC-H / SSC-W subconjunto. Use a frente e para a dispersão lateral para excluir restos celulares e células que não são dispersas. Excluir células mortas pela sua coloração com iodeto de propídio exibindo PE contra PE-Texas Red. Execute o portão tipo final sobre células positivas Cy3-PE (Figura 4).

Resultados

Em uma primeira tentativa de verificar e determinar a detecção intracelular de expressão de genes específicos em células vivas usando nanopartículas decidimos realizar experiências-piloto usando um gene de manutenção da casa constitutivamente expresso (GAPDH) em HEK 293 humanas células. A concentração das nanopartículas utilizadas nestas experiências foi escolhido de acordo com a recomendação do fabricante. A adição de uma sonda GAPDH espec�ico para o meio de cultura a uma concentração final de 100 pM induziram uma clara Cy3 fluorescência nestas células que era visível sob um microscópio de fluorescência após incubação O N / (Figura 5A). Dois controles foram incluídos nesses experimentos para comprovar o resultado. Um controlo compreende de um assim chamado nanopartícula "precipitação" onde a cadeia repórter não tem uma sequência correspondente em células de mamífero ou eucarióticas. A nanopartícula "corrida" determina a fundo inespecífica fluoresce devido à possível degradação da sonda ou extinção incompleta da fluorescência. A adição da sonda de precipitação produziu um único sinal fluorescente marginal, o que é negligenciável (Figura 5B). Um fluorescente permanentemente controlo "captação" ajuda a determinar a capacidade das células para incorporar as nanopartículas por endocitose que pode variar entre diferentes tipos de células. Estas partículas de controlo positivo produzido um sinal fluorescente brilhante em células HEK 293 (Figura 5C). Assim, a viabilidade da tecnologia para gravar um sinal de fluorescência específico de um gene intracelular com um sinal de fundo negligenciável foi confirmada. Deve ser mencionado que a diferença entre o sinal e o fundo de fluorescência específica diminui ao longo do tempo. O fundo aumenta devido a sondar a degradação ou a têmpera incompleta enquanto a fluorescência específica diminui gradualmente (Figura 5D). Os mesmos têm as nanopartículas espec�icos GAPDHfoi testada em culturas de fibroblastos primários de murino, porcino e ovino origem 17. Estas células produzem um sinal de fundo muito mais elevada do que as células REH 293, enquanto a fluorescência específica do alvo é bastante fraca, possivelmente devido à relativamente baixa capacidade proliferativa destas culturas.

Estas experiências piloto levou-nos a utilizar esta tecnologia para a detecção da expressão do gene em pluripotência iPS derivadas de espécies diferentes. Para este efeito, GDF3 NANOG e foram analisadas, ambos os quais são conhecidos por serem expressos em células pluripotentes 18. No células iPS derivadas de fibroblastos primeiros cauda-ponta de um Nkx2.5 potenciador cardíaca linha camundongo transgênico 19 foram investigados. Para ambos os genes de um sinal fluorescente forte foi obtido (Figura 6A) e uma insignificante Cy3 fluorescência do controle de precipitação (dados não mostrados). Resultados semelhantes foram obtidos em células iPS humanas e suína (Figura 6B e C). É importante ressaltar que o sinal de fluorescência foi restrito às colônias iPS e não rotular os fibroblastos usados ​​como uma camada alimentadora para rato e iPS suína (ver setas na Figura 6A e C). A análise da expressão do gene NANOG revelou também que nem toda sequência prevista in silico ser "boa", finalmente, é funcional. Um dos três designs de um NANOG nanopartículas espec�icos induzidas quase nenhum sinal de fluorescência comparável à do controlo de precipitação, apesar de uma sequência de jogo 100% em células iPS de murino (Figura 6D). Um resultado similar foi obtido em iPS células de origem humana e de origem porcina com esta sonda (dados não apresentados). Assim, as nanopartículas podem ser utilizados para detectar a expressão do gene através da espécie pluripotência fronteiras enquanto a funcionalidade de cada sonda concebida deve ser avaliado de antemão.

Os resultados promissores da in siturotulagem de células vivas em pratos de cultura de células levou-nos a analisar a expressão do gene quantitativamente por citometria de fluxo. Para este fim GAPDH nanopartículas espec�icos foram adicionados em concentrações graduadas de células HEK 293 monocamadas, a fim de comparar a eficiência de marcação dentro da população de células alvo. Como avaliado por microscopia de fluorescência induzida por uma fluorescência aumentada Cy3 foi observado com a concentração mais baixa em comparação com as células que não receberam as nanopartículas. O aumento das concentrações de nanopartículas induziu um claramente dependente da concentração de fluorescência de células HEK 293 in situ (Figura 7A). Sujeitar estas células a uma análise por citometria de fluxo confirmou a eficiência de marcação dependente da concentração. A frequência de células positivas Cy3 aumentou significativamente (mais do que sete vezes) quando a concentração mais elevada de nanopartículas foi aplicado (Figura 7B). Em novos experimentos células-tronco embrionárias a partir da cardíaca Nkx2.5A linha transgénica potenciador rato 19 foram utilizados para analisar a expressão dos genes de pluripotência por citometria de fluxo. Experiências-piloto com 400 pM do controlo captação positiva rendeu claramente Cy3 positivas ES vivos colônias sob o microscópio e citometria de fluxo detectado quase 40% de células positivas Cy3 (Figura 7C). Em contraste, comparável com células não tratadas, aproximadamente, 0,1% de células tratadas com a precipitação corado positivo (dados não mostrados). Do mesmo modo a adição de nanopartículas específicas para o GAPDH, e Nanog Gdf3 induziu um sinal de fluorescência distinta em colónias individuais na placa de cultura celular. A frequência de células positivas para Cy3 GAPDH como determinado por citometria de fluxo foi comparável ao observado para ambos os genes de pluripotência (Figura 7C). Este resultado é expectável como Nanog e Gdf3 também são pensados ​​para ser expresso constitutivamente em células ES pluripotentes. Assim, estes dados claramente INDICate que as células que expressam um gene particular pode ser identificado por análises de citometria de fluxo, qualitativamente e pela sua quantidade relativa.

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Figura 1: Representação esquemática da estrutura das nanopartículas. (A) a estrutura de uma nanopartícula específico do gene. (B) Precipitação de nanopartículas (controlo negativo). (C) A absorção de nanopartículas (controlo positivo). Adaptado de Lahm et al. 17, reproduzido com permissão de Wiley.

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Figura 2: Aplicação de nanopartículas para culturas de células uma solução apropriadamente diluída de nanopartículas é pipetado simplesmente para o meio de cultura.. Depois de O / células específicos do gene de incubação N fluorescentes são visíveis sob af luorescent microscópio.

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Figura 3:. A absorção activa de nanopartículas pelas células através de endocitose (A) Células envolver activamente as nanopartículas por endocitose (B) alvo mRNA se liga ao fio de captura e desloca o repórter fluorescente..

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Figura 4: Estratégia Gating para citometria de fluxo. (A) Estratégia para HEK 293 células. (B) Estratégia para células-tronco embrionárias de ratinho. Os dados foram adquiridos utilizando um dispositivo para células HEK 293 ou dispositivo 2 para células ES de murídeo e foram subsequentemente analisados ​​por uma ferramenta de software (ver Tabela de Materiais).

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Figura 5:. Análise de GAPDH -expressão em células HEK 293 Uma nanopartícula espec�ico GAPDH foi adicionado às células a 100 pM (concentração final) e a fluorescência foi registada depois de O / N de incubação (A) GAPDH nanopartículas espec�ico (B.. ) Scramble (controle negativo). (C) Captação (controle positivo). (D) Cinética de precipitação e controle de absorção. A fluorescência foi determinada no momento de pontos indicados após a adição de nanopartículas GAPDH espec�icos. Barras de escala representam 50? M.

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Figura 6:. Análise do Gene pluripotência expressão em células de diferentes espécies iPS Nanopartículas específico para NANOG ou GDF3 foram adicionados às células a 400 pM (conce definitivantration) e fluorescência foi gravado depois de O / N incubação. (A) células iPS Murino. (B) células iPS humanas. (C) células iPS Porcina. Setas em (A) e (C) designar células alimentador de camada de fibroblastos não marcado. (D) de fluorescência em células iPS murino após a adição do NANOG-design SF3 nanopartículas. Barras de escala representam 50? M.

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Figura 7: Nanoparticle Rotulado células vivas podem ser identificados por citometria de fluxo. (A) vista microscópica de Cy3 HEK positivo 293 células após a adição de diferentes concentrações de nanopartículas. (B) A frequência de células positivas Cy3 determinadas por citometria de fluxo. (C) A coloração por vivo de murino colónias de células ES e determinação da frequência de Cy3 positiva células. As nanopartículas foram adicionadosa uma concentração final de 400 pM. Barras de escala representam 50? M.

Discussão

O presente trabalho descreve a utilização de fluorescência marcado nanopartículas que permitem a avaliação fiável da expressão do gene intracelular directamente em células vivas a partir de diferentes espécies de mamíferos com origem diversa histogenética sob um microscópio de fluorescência. Esta abordagem tem uma série de vantagens em comparação com outros métodos publicados. Em primeiro lugar o pesquisador não está limitado no que respeita quer o gene alvo ou tipo de célula. Todos os métodos de detecção de anticorpos com base estão restritos a um único epítopo. Embora balizas moleculares fluorescentes podem também ser concebidos para uma ampla gama de genes, este método requer a dissociação das células e subsequente nucleofection 15. Em contraste, a aplicação de nanopartículas específicos do gene não necessita de qualquer manipulação da célula alvo que engole as nanopartículas activamente por endocitose. Durante a passagem em subsequente as partículas de ouro gradualmente deixar as células e a cultura pode ser utilizado em downstream experimentos.

No entanto, a tecnologia ainda também tem algumas limitações. Alguns marcadores não são obviamente detectável devido à sua natureza de hidrato de carbono, tais como SSEA-1 ou TRA-1-81 20. Actualmente, uma grande variedade de nanopartículas está disponível comercialmente. Estas partículas foram pré-testados para a sua funcionalidade nas experiências celulares. O objetivo do presente trabalho foi a concepção de sondas personalizadas que podem ser usados ​​em toda espécie fronteiras. Ao seguir essa abordagem ou ao projetar uma sonda para uma novela um gene-alvo tem que estar ciente de que a funcionalidade de um in silico previu sonda precisa de ser cuidadosamente avaliada in vitro. A sonda NANOG-SF3 que mostrou 100% de homologia com a homologia de sequência não funciona em todos, enquanto NANOG-SF1 com uma base de descasados ​​no murino e sequência de suíno produzido um sinal de fluorescência agradável. Outra questão refere-se à captação eficiente das nanopartículas. As partículas entraras células por endocitose, um processo que é influenciado pelo tamanho das nanopartículas 21, o tipo de célula e do estado de diferenciação 22, e a capacidade celular para realizar a phago- macropinocitose e 23. A concentração óptima para obter um sinal de fluorescência satisfatório tem de ser testado para cada aplicação individual ou linha de células. Para esse fim, o primeiro ensaio, devem sempre ser a aplicação de controlo da absorção de avaliar a compatibilidade das sondas dentro dos tipos de células e condições de cultura antes de passar para a detecção alvo específica da expressão do gene.

Um ponto crítico para se obter resultados confiáveis ​​quando se aplica este protocolo para uma linha celular romance ou população de células é a inclusão de controles adequados. O controle de absorção fluorescente nunca irá fornecer uma sugestão de que as concentrações de nanopartículas irá induzir um sinal de fluorescência suficiente na população de células alvo. A fluorescência deve ser avaliard o próximo dia como o sinal vai desaparecer com o tempo 17. Ao mesmo tempo, o controlo de precipitação sem um homólogo no genoma eucariota aplicadas numa concentração idêntica deve induzir um sinal de fundo negligenciável. Como um terceiro controlo, é aconselhável usar uma nanopartícula específica para um gene de manutenção (por exemplo, de GAPDH, β-actina). Estas nanopartículas servir como um controlo positivo que a abordagem pode ser utilizada para detectar a expressão de genes específicos na população de células alvo seleccionada. Se esses controles acabam por um satisfatório pode esperar para obter sinais fluorescentes específicos confiáveis ​​usando nanopartículas específicas para outros genes-alvo. A concentração das nanopartículas podem também ser aplicados como crítico que foram mostrados para regular negativamente a sequência alvo 24. No entanto, este efeito requer concentrações muito mais elevadas (5 nM) do que as concentrações utilizadas nas experiências aqui (400 pM) apresentados. A esta concentração o nanoflares não afectam ARNm do gene alvo ou os níveis de proteína e as concentrações tão elevadas como 2 nM não prejudicam a proliferação de células HEK293 e células ES murinas 17. Além disso, uma análise da expressão do genoma inteiro não revelaram quaisquer alterações significativas na expressão do gene 25. Portanto, a concentrações de 1 nM até os nanoflares não deve apresentar quaisquer efeitos adversos importantes.

Uma aplicação muito promissora desta tecnologia é a possibilidade de marcar qualquer população celular dado que é marcada por um gene específico. Recentemente, nanopartículas específicos do gene têm sido usados ​​com sucesso para corar seletivamente miócitos ventriculares ao vivo 26, subpopulações de células de melanoma 27, monócitos e células 28 cerebelar culturas 29. Tais populações de células marcadas por fluorescência, pode ser ordenada e purificou-se por citometria de fluxo como células vivas. No campo da oncologia é imaginável para isolar células tumorais metastáticas vivo em modelos animaiscom base na sua expressão de CEA, mais valiosa para a pesquisa do potencial de metástase promover genes ou estruturas-alvo. Mostrámos recentemente que verdadeiramente reprogramadas iPS colónias murinas podem ser identificados in situ com nanog nanopartículas espec�icos com base na intensidade de fluorescência detectada 17. Portanto, a identificação de colónias iPS verdadeiramente reprogramadas poderia ser realizada em plataformas de alto rendimento, que utilizam detecção de fluorescência robotizada apanha e dispositivos para identificar as colónias mais promissores. Esta tecnologia parece ser adequado em muitas áreas de investigação para seleccionar subpopulações celulares específicas e parece possível aplicar as nanopartículas em plataformas rendimento elevados. Em conclusão, este protocolo representa uma nova abordagem de fluorescência utilizando nanopartículas marcado que permite a detecção da expressão do gene intracelular directamente em células vivas. Esta tecnologia pode ser uma ferramenta valiosa para purificar, expandir e mais personagemize subpopulações celulares raras em muitas áreas de investigação.

Divulgações

HL recebeu as nanopartículas de EMD Millipore Corporation gratuitamente. Todos os outros autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos a Lynette Henkel por seu excelente suporte na realização da análise de citometria de fluxo. Agradecemos ao Dr. Don Weldon e ao Dr. Victor Koong (Temecula, CA) pela leitura crítica do manuscrito e comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Alemã de Pesquisa, KR-3770-7/1 e KR-3770-9/1 (M. K.), da Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), da Bolsa de Pesquisa Dr. Rusche 2014 da Deutsche Stiftung für Herzforschung e da Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), e o Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A e DZHK B 14-013SE (M. K.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio F12 DMEM/Ham com glutamina estávelBiochrome GmbHFG4815
Soro fetal de bezerroLife TechnologiesSV30160.03
Penicilina/Estreptomicina (100x)MilliporeA2213
Piruvato de sódio (100x)Life Technologies11360-039
DMEM glicose alta com glutamina estávelBiochrome GmbHFG0435
Mitomicina CRoche10 107 409 001previne a divisão celular de MEFs
MEM aminoácidos não essenciais (100x)Life Technologies11140-050
b-MercaptoetanolSigmaM3148
Fator inibidor de leucemia (107 U/ml)de crescimento ESG1107miliporepara células ES e iPS murinas, previne a diferenciação
0,25% Tripsina/EDTA (1x)Life Technologies25200-056separa culturas de células aderentes
Soro knockoutSuplemento Invitrogen10828-028para cultura de células iPS humanas e suínas
bFGFPeprotech100-18Bfator de crescimento para células iPS humanas e suínas
Colagenase IVWorthingtonLS004188dissociação de células iPS de porco
MatrigelCorning354277superfície eficaz para cultura livre de alimentador de células iPS humanas, referida como membrana de preparação basal no
meio manuscrito E8Stem Cell Technologies05940meio definido para cultura livre de alimentador de células iPS humanas em Matrigel
EDTA 0,5 MInvitrogen15575-038
SmartFlare SondasA EMD Millipore Corporationpersonalizou adetecção de itens da expressão gênica intracelular em células vivas, referidas como nanopartículas no manuscrito
Microscópio de fluorescênciaZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 IncubadoraThermo Scientific51026282
Gelatina (de pele suína)SigmaG6144aumenta a fixação de MEFs para a superfície
Iodeto de propídio (1 mg/ml)SigmaP4864marca células mortas em análises de citometria de fluxo
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544referido como dispositivo 1 na Figura 4
NaviosBeckman Coulter775213referido como dispositivo 2 na Figura 4
FloJo vX 10.0.7r2Treestarpara análise de dados de citometria de fluxo
Fator Software

Referências

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