Summary
Dette håndskrift beskriver en modelleringsteknik kapsulær infarkt. Her udnyttede vi en modificeret photothrombotic teknik med lav intensitet af lys efter præoperativ target mapping. Ved hjælp af denne teknik, vi skabt en afgrænset kapsel infarkt model med vedvarende motorisk svækkelse.
Introduction
Indtil for nylig har det "grå substans slagtilfælde (GMS) modeller" udelukkende været benyttet til at forstå patofysiologien af slagtilfælde og at styre udviklingen af nye behandlinger. Imidlertid har der været en stigende forekomst af slagtilfælde, der påvirker subkortikal hvide substans hos ældre individer, hvilket udgør 15 - 25% af alle slagtilfælde 1,2. Talrige undersøgelser har været gennemført med hensyn til slagtilfælde hjælp GMS-modeller, mens der er få undersøgelser, der har brugt hvide substans slagtilfælde (WMS) modeller. Hvide substans i gnavere er væsentligt mindre end den hvide substans i mennesker eller primater. Følgelig er det vanskeligere at selektivt adgang til og ødelægge målregionerne i den hvide substans 3. Derudover er der ikke effektive redskaber blevet udviklet til dato til selektivt at ødelægge den planlagte omfanget af målrettet hvid substans. Derfor har der været mangel på egnede modeller til undersøgelse af hvid substans slagtilfælde.
Animal stRoke modeller bruges ofte til at overvåge udviklingen i motorens genopretning for udvikling af nye rehabiliterende og terapeutiske metoder. Det er ideelt at anvende en dyremodel, som udviser en langsigtet neurologisk deficit overensstemmende med de anatomiske ændringer påvist i human slagtilfælde 4,5. I denne henseende kan hurtig genopretning af motoren underskud og bred inddragelse af hjernen efter infarkt læsionsdannelsen ikke være realistisk i forfølgelsen af slagtilfælde forskning. Tidligere kapsulær infarkt modeller er blevet foretaget af okklusion af carotis interna eller anteriore choroidale arterier og diffusion af endothelin-1 (ET-1) i det indre kapsel 6-9. Ikke desto mindre, arterieokklusion kræver omhyggelig dissektion af arterierne, men den producerer et bredt område af infarkt læsion, herunder den interne kapsel, uden vedvarende adfærdsmæssige mangler. Desuden ET-1 var ikke diffust at helt ødelægge den bageste del af det interne kapsel, og dermed mindre markant eller vedvarende behavioral underskud.
En photothrombotic infarkt model har været meget anvendt til at generere forskellige typer af infarkt læsioner i cortex og subkortikale strukturer 10. Teknikken omfatter intravenøs administration efterfulgt af fokal belysning, hvilket fører til blodpladeaggregering i de små blodkar og generering af infarkt læsioner 10. Photothrombotic teknik er blevet flittigt brugt til at skabe GMS læsioner, mens det sjældent er blevet brugt til at generere WMS læsioner 5,11. Til denne teknik, er en kombination af Rose Bengal-farvestof og lysbestråling blevet påvist at være anvendelige ved ødelæggelse af målstrukturen, forårsager tilsvarende funktionelle mangler. Det centrale element i photothrombotic teknik er lys bestråling, fordi det bestemmer størrelsen af infarkt læsioner. Lette bestråling resulterer i forskellige effekter på grå stof og hvid substans, fordi spredningen af lyset er mere end 4 gange højere i hvid matter sammenlignet med grå substans 12; Hvis derfor lysintensiteten har en tilstrækkelig lav bestråling (<1,140 mW / mm2), kan man begrænse udvidelsen, som photothrombotic læsion påvirker omfang den hvide substans (dvs.., Indre kapsel). For eksempel kan lys af højere energi inducere infarkter i både grå og hvid substans, men lys med lavere energi kan inducere photothrombosis kun i hvid substans. Endvidere indtrængningen af lysenergi var meget begrænset. Ca. 99% af lysenergi blev tabt over 1 mm fra lyskilde 13. Derfor forventes det, at præcist målrettet, lavere energi lys inducerer photothrombosis kun i den hvide substans med en minimal spreder den nærliggende grå stof.
Her beskriver vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til at skabe infarkt læsioner i forben område af det indre kapsel i gnavere. Vi beskriver fremgangsmåden til identifikation af forben område i det indre CApsule, teknologien af lysbestråling, herunder tilpasning og levering af lys, og frembringelsen af et infarkt læsion. Vi beskriver også adfærdstestning anvendes til at evaluere fuldstændigheden af kapsel-modellering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for Gwangju Institut for Videnskab og Teknologi (GIST), og alle de procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på GIST.
1. Pre-læsionsdannelsen Steps
- Identifikation af forben område i det indre Capsule hjælp AAV-GFP
- Hus og håndtag Sprague Dawley rotter (~ 400 g, 11 - 13 uger) i overensstemmelse med de institutionelle og nationale retningslinjer.
- Sterilisere alle kirurgiske værktøjer og elektroder ved hjælp af en passende sterilisator (Steam eller Plasma sterilisator). Bruge damp sterilisator ved 121 ° C som indstilling af 30 min til sterilisering og 30 min til tør.
- Bedøver dyret med en blanding af ketamin-hydrochlorid (100 mg / kg) og xylazin (7 mg / kg) via en intramuskulær injektion. Kontroller dybden af anæstesi ved pote klemme. Opretholde kroppens temperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C via en varmepude underkroppen af dyret.
- Sende dyret i en stereotaktisk ramme under anvendelse af en øre bar og mund holder.
- Rengør og desinficer operationsstedet med 70% alkohol og povidon jod løsning. Infiltrere 2% lidocain-hydrochlorid under hovedbunden på den tilsigtede kraniet snitområdet at reducere intraoperative smerter.
- Påfør dyrlæge oftalmologiske salve for at forhindre udtørring af øjnene. Placer en steril afdækning over dyret til de udløsende sites. Bevar alle procedurer i sterile forhold.
- Udfør en midtlinie kranium indsnit i 2 cm ved hjælp af en skalpel og trække huden bilateralt med wire retraktorer. Tør kraniet med vatpinde og 30% hydrogenperoxid.
- Lav et hul med en hånd stykke boremaskine over forben område motoriske hjernebark (AP: 2,5 fra bregma, ML: ± 2,5 fra midterlinjen) og rydde tarmkanalen med mikro-currette for virus-injektion.
- Optø AAV-GFP (2 x 10 12 virus-molekyler / ml) på is og lasten 1 pi afvirus i en 10 pi sprøjte. Anbring sprøjten på stereotaktisk ramme.
- Flyt nålen til den pre-made hul og sænke nålen 1 mm dybt ind i dura.
- Injicere virus langsomt (0,1 ul / min) under anvendelse af en høj præcision mikropumpe og lade nålen på plads i yderligere 10 minutter for at tillade viruset at diffundere ud.
- Efter rengøring af operationsstedet med saltvand kunstvanding, sikre såret med 3-0 nylon sutur; frigøre rotten fra stereotaktisk ramme og overføre det til et opsving kammer. Administrere ketoprofen (2 mg / kg) via en intramuskulær injektion til postoperativ smertekontrol.
- Opretholde kroppens temperatur (37 ° C) med varmepude og administrere andengenerations cephemer klasse antibiotika (0,1%, 1 ml) via en intramuskulær injektion og 2% lidocain-hydrochlorid via subkutan injektion efter behov. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholdebrystleje. Enkelt hus dyret indtil fuld helbredelse.
- Efter 2 - 3 i ugers restitutionsperiode, dybt bedøver rotten med en overdosis af ketamin-hydrochlorid (300 mg / kg) via en intramuskulær injektion i hætten. Bekræft død af animalske manglende tå klemme respons, puls, og vejrtrækning. Placer rotte liggende i hætten.
- Åbne bughulen via en "Y'-formet indsnit for at åbne brysthulen. Stramt klemme aorta descendens med en hæmostat og sprænge højre atrium af rotte hjerte for blod dræning. Initiere perfusion i den venstre ventrikel af hjertet med kold 1% paraformaldehyd i 5 min (10 ml / min) efterfulgt af 4% paraformaldehyd i 30 minutter (10 ml / min).
- Fjern rotte hovedet fra kroppen ved hjælp af en saks. Lav en midterlinjen snit fra nakken til næsen og fjern nakkemusklerne hjælp saks eller rongeur så kraniet er udsat for. Forsigtigt dissekere kraniet knogler og Duras ud fra hjernen.
- Uddrag hjernen og placere rottehjernen i et 50 ml konisk rør fyldt med 4% paraformaldehyd natten over. Den næste dag, vaske hjernen med 1x PBS 3 gange og læg den i en sucroseopløsning 30%.
- Når hjernen fuldstændigt synker til bunden af saccharoseopløsning på 30%, placere hjernen i kryoformen med OCT-forbindelse ved -20 ° C i cryotome. Skær hjernen i koronale plan i en tykkelse på 40 um og et interval på 200 um.
- Udfør GFP immunhistokemi farvning hjælp af objektglasmetoden 14. Påfør primært antistof (1: 200 af anti-grønt fluorescerende protein, kanin IgG-fraktion) til hjerneskiver natten over ved 4 ° C. Den 2. dag, vask med 1% phosphatpufret saltvand med Tween-20 (PBST) opløsning 3 gange og anvende det sekundære antistof (1: 500 af gede-anti-kanin IgG (H + L)) i 1 time. Skyl slide med en% PBST 3 gange. Placer dækglas på hjernen skive.
- Ved hjælp af en fluorescerende mikroskop (excitationsbølgelængde470 nm, emission bølgelængde 525 nm, forstørrelse 5X), observere AAV-GFP-transducerede axoner i den interne kapsel. Sammenlign placeringen af transducerede axoner med rottehjerne Atlas 15 at bestemme de stereotaktiske koordinater for de transducerede axoner
- Pre-læsionsdannelsen Justering af lysintensiteten Passende for kapsulær infarkt Modeling
- Konstruktion af det optiske Neural interface
- Skær en passende længde (4 cm) af en 27 gauge spinal nål med en stilet indefra med et skærende boremaskine.
BEMÆRK: Skæring kan komprimere og knuse spinal nålespids; fjerne stiletten og polere spinalnålen spids for at fjerne den knuste del af spinalnålen og opretholde den indre kaliber af spinalnålen. - Strip en passende længde (10 cm) af kappen af den optiske fiber (125 um med en 62,5 um kerne) af den ene side patch kabel.
- Sæt unjacked optisk fiber i metalrøret (ydre diameter: 3,8 mm, indvendig diameter: 3,3 mm og længde: 17 mm), som derefter klemmes omkring fiberen. Metalrøret er nyttigt at fylde rummet mellem den optiske fiber og centrum for spinalnålen. Klemme nederste 1/2 af metalrøret med en presseindretning to gange.
- Påfør varmehærdelige epoxy på den optiske fiber og indsætte den optiske fiber ind spinalnålen. Påfør et ekstra epoxy til den tomme plads i navet. Helbrede epoxy i 20 minutter ved 100 ° C i stabil fiksering.
- Spalte den optiske fiber, der rager ud af spinalnålen og polere den optiske fiber ved spidsen af spinalnålen hjælp diamant slibning (polering) ark.
- Forbind FC / PC forbindelsesdel af patch kabel til kobleren af grøn laser systemet og måle lysintensiteten fra spidsen af den optiske fiber ved hjælp af digital optisk effekt og energi meter.
- Skær en passende længde (4 cm) af en 27 gauge spinal nål med en stilet indefra med et skærende boremaskine.
- Konstruktion af det optiske Neural interface
2. PhotothromBotic infarkt læsionsdannelsen i det indre Capsule
- Sterilisere alle kirurgiske værktøjer og elektroder ved hjælp af en passende sterilisator (Steam eller Plasma sterilisator). Bruge damp sterilisator ved 121 ° C som indstilling af 30 min til sterilisering og 30 min til tør.
- Bedøver dyret (~ 400 g, 11 - 13 uger) med en blanding af ketamin-hydrochlorid (100 mg / kg) og xylazin (7 mg / kg) via en intramuskulær injektion. Kontroller dybden af anæstesi ved pote klemme. Opretholde kroppens temperatur ved 37,5 ± 0,5 ° C via en varmepude under kroppen af dyret.
- Sende dyret i en stereotaktisk ramme under anvendelse af en øre bar og mund holder.
- Rengør og desinficer operationsstedet med 70% alkohol og povidon jod løsning. Infiltrere 2% lidocain-hydrochlorid under hovedbunden på den tilsigtede kraniet snitområdet at reducere intraoperative smerter. Påfør dyrlæge oftalmologiske salve for at forhindre udtørring af øjnene.
- Påfør en steril filmen over enimal og udsætte de operative sites. Bevar alle procedurer i sterile forhold.
- Udfør en midtlinie kranium snit på 2 cm og trække huden bilateralt med wire retraktorer. Tør kraniet med bomuld swaps og hydrogenperoxid.
- Justere højden af næsen klemme indtil bregma og lambda er justeret på samme niveau. Kritiske trin: Denne justering er kritisk at nærme korrekt en dybere struktur, såsom ved udførelse et infarkt læsion i det indre kapsel i hovedsagen eksperiment.
- Lav et hul (diameter: 2 mm AP: -2,04 fra bregma, ML: ± 3,0 fra midterlinjen) ved hjælp af en boremaskine til at fremkalde photothrombosis.
- Polsk og rengør fiber spidsen af optiske interface optisk. Fastgør ONI til stereotaktisk ramme uden at bøje. Kontrollér spidsen af ONI og tørre det klart før og efter indsætningen af den optiske grænseflade.
- Mål laser intensitet fra spidsen af den optiske fiber inden indsættelsen af optical grænseflade til målområdet af rottehjernen. Juster laser intensitet til 3,5 mW, hvilket bekræftes af præoperativ trin, ved spidsen af den optiske fiber.
- Sæt ONI ind i målområdet af det indre kapsel (-7.8 mm bekræftet fra præ-kirurgi trin) gennem borehullet.
- Opretholde kroppens temperatur på 37,5 ± 0,5 ° C under photothrombosis. En lavere kropstemperatur måske ikke den forventede omfang af infarkt. Injicer Rose Bengal (2 ml / kg) gennem halevenen.
- Tænd for 532 nm grøn laser til 90 sek 1 min efter Rose Bengal injektion. Efter bestråling, forsigtigt fjerne ONI fra hjernen. Efter rengøring operationsstedet, sikre såret sikre såret med 3-0 nylon sutur; frigøre rotten fra stereotaktisk ramme og overføre det til et opsving kammer.
- For sham-opererede gruppe (SOG), udføre en identisk læsion-making procedure, bortset fra injektion af saltvand (0,2 ml / 100 g) i stedet for Rose-Bengal.
- Opretholde kroppens temperatur (37 ° C) med varmepude efter kirurgi og administrere antibiotika (anden generation cephalosporin, 0,1%, 1 ml) via en intramuskulær injektion. Lad ikke dyret uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke vende tilbage postoperative dyr til buret besat af andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
BEMÆRK: Indledende forsøg blev udført ved samme procedure for at finde den optimale lysintensitet fra 1 mW til 5 mW, og proceduren kan være nødvendigt at erhverve tilfredsstillende omfang af læsion i forskellige betingelser.
3. Evaluering af kapsulær infarkt læsionsdannelsen
- Behavioral Test og Animal gruppering
- Udfør enkelt pellet nå opgaver som beskrevet af Whishaw et al. 14 for at evaluere motor underskud af forben hver dag i 1 uge efter slagtilfældet modellering. Udfør en enkelt pille nå opgave(SPRT) i fødevareproducerende dyr begrænset (90% af kontrol legemsvægt) ved hjælp af klare plexiglas (30 x 15 x 35 cm højde) med en 1 cm bred spalte og en fødevare hylde i foran midten af forvæggen.
- Placer en pellet på mad hylden skråt kontralateral til den foretrukne forben. Administrer 20 piller per session i 3 uger.
BEMÆRK: En vellykket antal SPRTs er defineret som en rækkevidde, hvor dyret griber en fødevare pellet og sætter den ind i munden uden at tabe den. - Beregn score som en procentdel af vellykkede når, som er defineret ved følgende formel:
BEMÆRK: Vi deler dyr i 3 grupper: den sham-opererede gruppe (SOG), moderat opsving gruppe (MRG), og dårlig opsving gruppe (PRG). Hvis en efter slagtilfælde SPRT score> 50%, vi klassificere rotter som MRG, hvilket indikerer tilstedeværelsen af en væsentlig læsion, men ikke fuldstændig destruktion af tarFå. Hvis efter slagtilfælde SPRT score er <50% i forhold til præ-takts SPRT score, klassificere vi gruppen som PRG, hvilket indikerer fuldstændig læsionsdannelsen i målet.
- Neurohistologiske Bekræftelse af infarkt læsionsdannelsen
- Udfør kardiel perfusion med 4% paraformaldehyd som tidligere beskrevet. Når hjernen fuldstændigt synker i sucroseopløsning 30%, udføre koronal sektionering i en tykkelse på 10 um og et interval på 200 um ved anvendelse af en mikrotom eller cryotome 4.
- Pletten med H & E, Nissl, Luxol Fast Blue-PAS, neurofilament-protein-L eller gliafibrillært syre proteinfarvning og observere de histologiske fund at bestemme den optimale lysintensitet, der kan dække hele bredden af det indre kapsel i målområdet at observere farvning 4,17.
- Under anvendelse ImageJ software, måle volumen af photothrombotic infarktareal af det indre kapsel på hjernen objektglas.
- For at måle mængden af infarkt-området, starte 'ImageJ' software. For at åbne filerne skal stables, skal du vælge 'Image to Stakke' ( 'Billede' → 'Stakke' → 'Image to Stakke'). Rediger filnavnet og vælg 'Sæt Scale "(" Analyser "→" Indstil Scale ") til at redigere skala.
- I 'Plugins', vælg 'Mål Stacks "til at beregne volumen eller areal af billeder. Sæt afstanden interval på 2 billeder til 'Slice Spacing ". Lav en tegning af ROI (Region Of Interest) af alle billeder, og klik "Measure".
BEMÆRK: Softwaren "ImageJ 'beregner automatisk areal og volumen af hvert billede og samlet volumen på dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden præsenteres her er beregnet til at skabe en afgrænset kapsulær infarkt med en vedholdende motor underskud. Derfor er det kritisk at bestemme målet korrekt i det indre kapsel i præ-kirurgi trin. Den somatotopic kortlægning af pyramideformede fibre i det indre kapsel er ikke blevet løst til dato. For at identificere målet korrekt i det indre kapsel, skal forben område afgrænses. En injektion af AAV-GFP ind i forben område af motoren cortex kan spore axoner af de pyramideformede fibre i det indre kapsel (figur 1). Andre neurale sporstoffer, såsom biotinyleret dextran amin (BDA), kan anvendes til samme formål. De stereotaktiske koordinater for målet i det indre kapsel kan belyses ved at spore de axonale projektioner, der stammer fra forben område af motoren cortex til det indre kapsel.
Figur 1. Identifikation af forben området i det indre Capsule 2 uger efter injektionen af AAV-GFP. GFP-transducerede axonale fibre, der stammer fra forben område af motoriske hjernebark er vist i den ventrolaterale kerne af thalamus (pile) og den caudale del af den indre kapsel (pilespids). Den stiplede linje angiver konturen af det indre kapsel, og tallene henviser til afstande fra bregma. Hippo, hippocampus; CPU, putamen putamen; VL, ventrolaterale kerne; IC, intern kapsel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den optimale lysintensitet kan være forskellige, afhængigt af stammen og kropsvægt af dyret og de typer og diametre optiske fibre. Derfor bør den optimale lysintensitet bestemmes særskilt før den vigtigste infarkt læsionsdannelsen eksperiment. Brug af photothrombotic procedure, kan lysintensiteten gradvist, indtil omfanget af læsionen dækker hele bredden af det indre kapsel uden at ødelægge de tilstødende grå stof strukturer (figur 2). Den optimale lysintensitet kan verificeres ved at sammenligne den histologiske grad af infarktet læsion og steder.
Figur 2. Omfanget af infarktet Læsioner Across varierende intensitet af laserlys fra 2 mW til 5 mW 2 uger efter Photothrombotic læsionsdannelsen. Den optimale lysintensitet anses for at være mellem 3 mW og 4 mW i denne eksperimentelle indstilling. Pile viser infarkt læsion./53281/53281fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Vi foretrækker at bruge ONI hvori den optiske fiber er indeholdt i en tynd metalrør (spinalnålen). Den optiske fiber kan producere minimal lysspredning fra siden af fiberen, som sandsynligvis vil generere yderligere nerveskader langs den optiske fiber tarmkanalen. Indkapsling af den optiske fiber er også fordelagtigt at forhindre bøjning af den optiske fiber i dybere mål, samt at fastgøre ONI til stereotaktisk ramme (figur 3).
Figur 3. Konstruktion af den optiske-neurale Interface (ONI). (A) Skæring af spinal nål. (B) stripning af den optiske fiber. (C & d) forankring metalrør er indsat overstrippet optisk fiber og trange at fastgøre optiske fiber på navet af spinalnålen. (E) Epoxy-added optiske fiber indsat i spinalnålen. (F) Epoxy hærdes ved 100 ° C i 20 min. (G) Den optiske fiber spaltes ved spidsen af spinalnålen. (H) Den optiske fiber er poleret. (i) Lysintensiteten måles fra spidsen af den optiske fiber. Klik her for at se en større version af dette tal.
Den photothrombotic procedure vil producere reproducerbare læsioner og steder med ~ 70% succes i motorisk svækkelse. Typiske kapsulær infarkt læsion omfatter ventrodorsal dimension kapselformede fibre (figur 4A). Endvidere infarkt læsion strækker sig langs de anteroposteriore akse i det indre kapsel på grund af øget lysspredning inde i kapsel-fiber. (Figur 4B) Den optiske tarmkanalen placeret under indre kapsel består af hvid substans fibre; Således er det ofte beskadiget ved bestråling af en forøget lysintensitet. Serielle sektioner og farvning er forpligtet til at bekræfte hele volumen og omfanget af infarkt. Infarktvolumenet var 0,63 ± 0,37 mm 3. Til bedømmelse ødelæggelsen af det kapsulære fiber, neurofilament og Luxol Fast Blue-PAS pletter er nyttige.
Figur 4. Mikroskopisk udseende kapsulær infarkt 3 uger efter Photothrombosis. Mikroskopisk udseende kapselskrumpning infarkt 3 uger efter photothrombosis. A) Brain udsnit af koronale snit i rottehjernen. Pilespids angiver tarmkanalen af nålen indeholdende optisk fiber i thalamus og op til intern kapsel. B) Serial Nissl farvning af koronale hjernen skiver showi ng hele udstrækningen af infarkt læsion i det indre kapsel. Pilespidser angiver infarkt læsion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Succesen af modellering kan evalueres ved adfærdsmæssig testning under anvendelse af en enkelt pellet nå opgave. Den adfærdsmæssige præstation efter 1 uge efter infarkt læsionsdannelsen er en god guide til at bekræfte præcis læsionsdannelsen, som ledsager den vedvarende og markant svækkelse af SPRT trods den daglige enkelt pille nå uddannelse (figur 5). Når motoren underskud vises i PRG, den neurologiske underskud fortsatte i løbet af tre måneder observationsperioden. Sham-opererede gruppe viste ikke det betydelige fald i SPRT præstation efter operation.
upload / 53281 / 53281fig5.jpg "/>
Figur 5. Ændringer i Single Pellet Nå Scores efter kapsulær Infart 4,20. De eksperimentelle grupper (PRG og MRG) udstillet faldt betydeligt scoringer umiddelbart efter infarkt læsionsdannelsen forhold til sham-opererede gruppe (SOG). Den MRG udviser en gradvis genopretning af SPRT forestillinger, mens PRG udviser vedholdende motorisk svækkelse over tid. Op, photothrombotic infarkt læsionsdannelsen; PRG, dårlig opsving gruppe; MRG, moderat opsving gruppe. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af gentagne foranstaltning analyse af afvigelser. + SOG versus MRG; * SOG versus PRG. Dataene er middel ± sem. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kapsel infarkt model præsenteres her demonstrerer en målrettet læsion med markant og vedholdende motorisk svækkelse i forben funktion. Tidligere modeller af subkortikal kapsel slagtilfælde har vist en utilstrækkelig grad af motorisk svækkelse og en hurtig genopretning proces 6,8,9. I den forstand, denne model ligner de kliniske kapsel-infarkt sager, som udviser langvarig funktionel svækkelse.
De mest kritiske trin i udviklingen af en afgrænset kapsulært infarkt model er: 1) til korrekt at identificere den somatotopic repræsentation af kropsdelen skal deaktivere funktionen i det indre kapsel; 2) for at identificere den optimale intensitet af den grønne laser, som kan ødelægge hele bredden af det indre kapsel med minimal indtrængen af tilstødende grå stof strukturer; og 3) til nøjagtigt at placere den optiske fiber i målstrukturen. Selvom de præsenterede teknikker kan inducere afgrænsed kapsulær infarkt model med en høj replikation rate (> 70%), kan små forskelle i målretningen og graden af fuldstændighed af ødelæggelse, der dækker hele bredden af det indre kapsel udgør forskellige motoriske mangler.
Den corticospinal tarmkanalen er beliggende i den forreste halvdel af den bageste lemmer i den interne kapsel i mennesker på trods af kontroverser af somatotopic organisation 15. Derimod har der ikke været nogen tilsvarende klassificering eller detaljeret belysning af somatotopic organisering af det indre kapsel i gnavere. Den manglende viden om somatotopic organisation ofte fører til forkerte mål for infarkt læsionsdannelsen i det indre kapsel med forskellige motoriske udfald blandt kapsulær infarkt modeller. Men vi identificeret de GFP-transducerede axoner i den kaudale del af den indre kapsel, som sandsynligvis repræsenterer banen for forben motoriske fibre. Endvidere læsionsdannelsen af dette område demonstrated en markant og vedvarende underskud af forben nå dygtighed. Derfor anbefaler vi den caudale del af det indre kapsel til stereotaktisk læsionsdannelsen at forbedre validiteten af kapsel infarkt model.
Pre-justering af lysintensitet er obligatorisk at frembringe en ensartet grad af infarkt læsion i slagtilfælde modeller, fordi dyret stamme, legemsvægt, lyskilde og typer af ONI kan generere forskellige størrelser af infarkt. Derfor bør gennemføres indledende forsøg med forskellige lysintensiteter i forsøgsdyr med den samme stamme og kropsvægt, indtil tilfredsstillende infarkt læsion opnås med minimal lysintensitet.
Stærk lysintensitet, der kan ødelægge hele bredden af kapsel-fiber (anterior-posterior og dorsoventral udstrækning), som svarer til det forben område med minimal skade på de tilstødende strukturer anses for at være den optimale lysintensitet. Den forelimB Område af det indre kapsel afgrænses af thalamus superiorly og den optiske tarmkanalen nedadtil. Derfor bør dybden af ONI insertion være nøjagtig til at ødelægge hele udstrækningen af IC i dorsoventral retning, med samtidig bevarelse af de øvre og nedre tilstødende strukturer. Unøjagtig placering af ONI resulterer i en ufuldstændig destruktion af IC, hvilket fører til hurtig genopretning af motoren underskud som følge af den synaptiske plasticitet af de resterende pyramidale fibre i det indre kapsel. I serielle histologiske undersøgelser, den mest forstyrrende element i induktionen af en vedvarende motor underskud var ukorrekt positionering af ONI, som fører til manglende ødelægge hele bredden af PLIC 4,16. Derfor bør omhyggelig man være opmærksom at opnå den rette mål. For nylig Blasi et al. Rapporterede at varig ren-motor underskud kan fremstilles ved at gøre et infarkt læsion i bageste indre kapselanvendelse af endothelin-1 (ET-1) 17. Imidlertid ET-1 kan ødelægge tilstødende grå stof struktur ved diffusion af ET-1.
Behavioral test er en umiddelbart tilgængelig benchmark i laboratoriet for at vurdere dannelsen af infarkt læsion i det indre kapsel. anbefales dog, vurdering af motorisk præstation en uge efter infarkt læsionsdannelsen at opdele dyrene i moderate og fattige recovery grupper. Moderat opsving blev defineret som en stigning i udførelsen score ved> 50% i forhold til score før læsionsdannelsen, hvorimod dårlig opsving blev defineret som genvinding af <50%. Blandt de forben motor adfærdsmæssige tests, enkelt pille nå opgave er en af de mest følsomme test for både kvantitative og kvalitative målinger af slagtilfælde-induceret motoriske forestillinger 14. Opgaven kvantitativt måler nå succes giver samtidig en analyse af forben brug, såsom at gribe og hente en fødevarepellet. Den kvalitative analyse af de nåede bevægelsen er også nyttigt at skelne kvaliteten af slagtilfælde nyttiggørelse ved at skelne ægte funktionel genopretning eller kompensation 20. Her har vi kort beskrevet den kvantitative måling af SPRT; dog anbefales kvalitativ analyse ved hjælp filme og scoring baseret på en ramme-for-ramme analyse for yderligere detaljeret analyse.
De teknikker, der præsenteres her behøver ikke være begrænset til induktion af afgrænset kapsel infarkt modellering. Teknikken kan anvendes til induktion af et infarkt læsion i andre områder af hvid substans, såsom corpus callosum, anterior Commissurer og forbindelsesledninger fibre blandt neurale strukturer. Kombinationen af den lille ONI og photothrombotic teknik baseret på de optiske egenskaber af hvid substans sandsynligvis ødelægge de tilsigtede strukturer med minimal skade på de tilstødende strukturer. For eksempel kan lakunære infarkter let producered ved at målrette de subkortikale strukturer relateret til motor, kognitive og hukommelsesfunktioner. Når målet struktur er stor, kan flere indrykninger af ONI og forskellige målretning og vinklede baner være forpligtet til at frembringe den ønskede omfang af læsioner.
Der er flere begrænsninger i denne teknik. Teknikken er tilstrækkelig til at godtgøre konsekvensen af infarkt læsionsdannelsen i PLIC og efterfølgende opsving. Men denne model ikke afspejler det fulde spektrum af menneskelige WMS fordi photothrombotic ødelæggelse af hvid substans lidt forskellig fra human WMS. Derfor kan neurobiologiske eller MR imaging fund udviser forskellige funktioner i den tidlige fase af photothrombotic læsionsdannelsen. Derfor bør denne model være passende bruges til at handle ud modellens fordele og ulemper. Teknisk set er det ikke alle operationer kan producere den markerede og permanent motor underskud i denne model, fordi det kræver meget nøjagtige procedurer. Specifically, er uddannede og erfarne hænder kræves for at producere den høje reproducerbarhed i dannelsen af denne model.
Som konklusion den kombinerede anvendelse af en photothrombotic teknik, optimering af lysintensitet, og korrekt targeting er en nyttig teknik til at frembringe et afgrænset kapsulært infarkt model. Denne model vil være nyttigt ikke blot at studere WMS på det adfærdsmæssige, kredsløb og cellulære niveauer, men også for at vurdere nytten af nye terapeutiske og rehabiliterende interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Institut for Medicinsk System Engineering (Imse) & GIST-Caltech Collaborative Fund (K04592) fra GIST og af Basic Science Research Program gennem NRF Korea finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning (NRF-2013R1A2A2A01067890).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DC Temperature controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC. | ATC1000 | |
| Digital Stereotaxic Instruments | STOELTING CO. | 51900 | |
| Electrical Stimulator | CyberMedic Corp. | EMGFES 2000 | |
| Epoxy | Precision Fiber Products, INC. | PFP-353ND1 | Mix Ratio: 10(A):1(B-hardener) by weight Curing Schedule: 1 min @150 °C 2 ~ 5 min @120 °C 5 ~ 10 min @100 °C 15 ~ 30 min @80 °C |
| Fiber Optic Scribe | THORLABS, INC | S90R | |
| Fiber patch cable | KOREA OPTRON Corp. | Outer diameter: 3 mm Ø200 µm 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m |
|
| Laser Power Supply | CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD. | MGL-FN-532nm-200mW-14010196 | |
| Crimp ring | DAWOOTECH CO.,LTD. | Length: 19 mm Inner diameter: 3 mm Outer diameter: 3.8 mm Material: SUS |
|
| Micro4-micro syringe pump controller | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | 95100 | |
| Optical Power Meter | THOLABS, INC | PM100D | |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF3D | Grit : 3 µm |
| Diamond lapping (polishing) sheet | THORLABS, INC | LF6D | Grit : 6 µm |
| Rose Bengal | SIGMA-ALDRICH CO. LLC. | 330000 | |
| Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle) | B.BRAUN MELSUNGEN AG | 4502027 | Size: 27 G Length: 88 mm Needle: 0.40 mm |
| Waterproof sandpaper | DEERFOS CO.,LTD | CC261 | Grit : 1,000 µm |
| Nanofil 10 µl syringe | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NANOFIL | |
| Nanofil 33 G BVLD needle | WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC | NF33BV-2 | |
| AAV-GFP virus | UNC Vector Core | AAV2-CamKIIa-eYFP | 2 x 1012 virus molecules/ml |
| Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction | Life Technologies, INC | A11122 | primary antibody (1:200) |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L) | Life Technologies, INC | A11034 | secondary antibody (1:500) |
| Ceftezole | GUJU Pharma CO.,LTD. | A27802741 | 0.1%, 1 ml |
| Lidocain hydrochloride injection | JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD. | A04900271 | 2%, 1 ml |
| Hand Piece Drill | Seshin | ||
| Digital optical power and energy meter | THORLABS, INC | PM100D | |
| Ketoprofen | UNIBIOTech |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 125, 2-220 (2012).
- Debette, S., Markus, H. S. The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis. Bmj. 341, 3666 (2010).
- Zhang, K., Sejnowski, T. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex. PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).
- Kim, H. S., et al. A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).
- Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. Rat models of upper extremity impairment in stroke. ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).
- Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat. Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).
- He, Z., et al. Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique. J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).
- Tanaka, Y., et al. Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation. Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).
- Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion. Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).
- Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Handbook of biomedical optics. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K.
- Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale. J Vis Exp. (18), e816 (2008).
- Jang, S. H. A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain. NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).
- Kim, D., et al. Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).
- Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).
- Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms. Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).
