Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Resumo

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Resumo

Relativamente células estaminais somáticas quiescentes apoiar a renovação celular ao longo da vida, na maioria dos tecidos adultos. As células estaminais neurais no cérebro de mamíferos adultos está restrita a dois nichos neurogénicos específicos: a zona subgranular do giro dentado no hipocampo e na zona ventricular-subventricular (V-SVZ; também denominada zona subependimal ou SEZ) nas paredes das laterais ventrículos. O desenvolvimento de estratégias de transferência in vivo de genes para as populações de células estaminais adultas (isto é, as do cérebro de mamíferos), resultando em expressão a longo termo de transgenes desejados nas células-tronco e a sua descendência resultante é uma ferramenta importante na investigação biomédica e biotecnológica corrente. Aqui, um método direto in vivo é apresentado para a modificação genética estável de células do rato adulto V-SVZ que se aproveita da infecção independente do ciclo celular por LVs ea citoarquitetura altamente especializada do nicho V-SVZ. Especificamente, o protocolo atual envolvems a injecção do LVS vazio (controlo) ou LVs que codificam as cassetes de expressão de transgenes específica para qualquer um do próprio V-SVZ, para o direccionamento in vivo de todos os tipos de células no nicho, ou para o lúmen do ventrículo lateral, para o direccionamento de ependimária células única. As cassetes de expressão são, em seguida, integrado no genoma das células transduzidas e proteínas fluorescentes, também codificados pelo LVS permitir a detecção das células transduzidas para a análise dos efeitos dependentes do nicho de células autónomos e não autónomos, em células marcadas e os seus progênie.

Introdução

A zona ventricular-subventricular murino (V-SVZ), nas paredes do ventrículo lateral de frente para o corpo estriado, é uma região germinal muito activa, na qual um processo contínuo de replicação de células progenitoras e diferenciação resulta na produção persistente de bolbo olfactivo (OB ) interneurônios e oligodendrócitos corpo caloso ^1. A geração ao longo da vida destas células parece ser apoiada pela presença nesta região de células neurais estaminais (NCCC, também chamado células B1), que expressam a proteína ácida fibrilar glial antigénio astrócitos (GFAP) e a haste marcadores celulares, tais como a nestina, Id1 e Sox2 ^2. GFAP-expressando....

Protocolo

ÉTICA DECLARAÇÃO: Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais da Universidade de Valência, em conformidade com a Directiva Europeia 2010/63 / UE.

1. Geração de LV para In Vivo Marcação Estudos (veja a Figura 1-A)

CUIDADO: O procedimento aqui descrito é o nível de biossegurança 2, portanto, executar todos os procedimentos a seguir em uma capa de risco biológico. Garantir que o pessoal de investigação são devidamente qualificados e treinados em todos os procedimentos. Usar equipamento de protecção pessoal, incluindo vestido, luvas duplas e proteção ocular adequada. Finalmente, completamente descontaminar todas a....

Resultados

Sistema de entrega de genes mediada por LV pode ser utilizado para a longo prazo na transdução in vivo de células do ratinho adulto V-SVZ, permitindo que o seu controle e modificação genética durante a proliferação, a migração ea diferenciação. A infecção e a expressão são altamente eficazes e produzem numerosas células que podem ser facilmente distinguidos entre outras células não-infectadas por a expressão do repórter incluídos. Temos, assim, muito visualizado células transduzidas com GFP repórteres fluoresce.......

Discussão

LVs oferecer vantagens importantes sobre outros sistemas virais para a modificação genética de adultos NSCs ^16,18. entrega estereotáxica de lentivírus para o nicho V-SVZ representa um método eficiente para identificar e rastrear raramente dividindo B1-NSC superar as limitações de outros métodos vulgarmente utilizados tais como BrdU, que se dilui depois de múltiplas divisões celulares, ou retrovírus, que apenas células alvo que estão a proliferar no momento da aplicação. LVS juntamente com adenovírus, pode inf.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Parte 1: Geração de LV para entrega in vivo.
Equipamento:
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrífuga rotor	Beckman Coulter	SW-55
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	358126	25 mm x 89 mm
	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
Adaptadores de ultracentrífuga	Beckman Coulter	358156
placa de 6 poços	SPL	PLC-30006
Placa de 24 poços	SPL	PLC-30024
Prato de 10 cm	SPL	PLC-20101	estilo 100 x 20
	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Filtro FACS estéril de copo	BD	340626	30 µ m
Filtro de nitrocelulose	Millipore	SCGPU05RE	0,22 μ m
Citômetro de fluxo	BD	LSR Fortessa	Blue laser 488 nm
Filtro Steritop	Biofil	FPE-204-500	0,22 µ m
Reagents:
pMDLg/pRRE plasmídeo	Addgene	#12251	Plasmídeo de embalagem principal
pRSV.REV plasmídeo	Addgene	#12253	Plasmídeo de embalagem principal
pMD2G plasmídeo	Addgene	#12259	Envelope plasmídeo
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmídeo	Addgene	#12252	Vetor de transferência plasmídeo
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	Para cultura de células HeLa
Iscove's Modified Dulbecco's Medium	Life technologies	12440-053	Para cultura de células 293T
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,  Livre de DNAse/RNAse, 0,2 µ m filtrado estéril
2x HBS			0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM de Na2HPO4 (Sigma, S7907) em dH2O (de preferência não MilliQ). Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH (Calbiochem, 567530).
Soro fetal bovino (FBS)	Biowest	S181B-500	Stock, solução a 100x, utilizada para preparar HeLa e meio de cultura 293T na concentração final de 10x.
Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513-100	Solução-mãe a 200 mM, usada para preparar HeLa e meio de cultura 293T a uma concentração final de 6 mM.
Tecnologias de piruvato de sódio	Life technologies	11360-039	Solução de estoque a 100 mM, usada para preparar HeLa e meio de cultura 293T a uma concentração final de 1 mM.
GlutaMAX Suplemento	Life technologies	35050-061	Usado para preparar meio de cultura 293T em uma concentração final de 1%.
Penicilina/estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458	contém 5.000 unidades/ml de penicilina e 5 mg/ml de estreptomicina. Usado para preparar HeLa e meio de cultura 293T em uma concentração final de 1%.
Tripsina-EDTA	Life Technologies	25200-056	Com vermelho de fenol, contém 2,5 g de tripsina suína e 0,2 g de EDTA 4Na/L HBSS.
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, 10x, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células. Solução de estoque usada para preparar 1x PBS em água de grau de cultura de células.
Polibreno (brometo de hexadimetrina)	Pó Sigma-Aldrich	H9268	. Prepare uma solução estoque de 1.000x a 8 mg / ml em dHO
Paraformaldeído EM grau 16%	EM Sciences	15710
Nome<	strong>Company	Número de catálogo	Comentários
Parte 2: Injeção estereotáxica de LV na SEZ propriamente dita ou no ventrículo lateral.
Equipamento:
Vernier instrumento estereotáxico	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse e adaptador de rato neonatal	NeuroLab, Leica	39462950
Suporte para seringa	KD Scientific	KDS-311-CE
seringa de 33 gauge	Hamilton	P/N      84851/00	#85RN
Furadeira elétrica	Fine Science Tool	98096
Manta térmica	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, tipo C_AL01
Barbeador	Jata	MP373N	Modelo: beleza, 3 V, 300 mA, tipo HT-03.
Reagents:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Solução comercial a 1 mg/ml.
Cetamina	Merial	Imalgene 500	Solução comercial a 50 mg/ml
		medetomidina / cetamina	Prepare uma mistura de trabalho de medetomidina a uma concentração final de 0,2 mg / ml de diluição e cetamina a uma concentração final de 15 mg / ml em solução salina. Use como anestesia injetando um volume para obter uma concentração final de 0,5-1 mg de medetomidina por kg de peso corporal e 50-75 mg de cetamina por kg de peso corporal
Butorfanol	Pfizer	Torbugesic	Stock solution a 10 mg / ml. Usado como analgesia a 1 mg / ml em solução salina.
Atipamezole	Esteve	Antisedan	Solução de estoque a 5 mg / ml, usada em uma concentração final de 0,5 mg / ml em solução salina para sair da anestesia.
Solução salina a 0,9%	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Adesivo tópico para a pele
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Bleach/Virkon	Dupont
Caneta marcadora cirúrgica	Staedler	313-9
Lubrificante oftálmico permanente lumocolor		SICCAFLUID	0,5 g / dose, carbômero 974P
Iodopovidona	Betadine	694109,6	10% iodopovidona
Nome< / strong>	Empresa< / strong>	Número de catálogo< / strong>	Comentários< / strong>
Parte 3: Análise histológica.< / em>< / strong>
Equipment:
Bomba peristáltica automática	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S acionamento econômico de velocidade variável, 1,6-100 rpm, cabeça da bomba de 230 V
	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Cabeça de bomba Masterflex L/S Easy-Load para tubulação de precisão; Carcaça PSF, rotor CRS
Tubo de silicone	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Conjunto de veias do couro cabeludo	Vygon V-green	70246.05T	25 G, comprimento do tubo de 30 cm
Vibratome	Leica	VT1000
Microscópio confocal	Olympus	FluoView FV10i
Placa quente	Tehtnica	SHP-10
Reagentes:
Tampão fosfato (PB)			0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) e 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) em dH2O, ajuste o pH para 7,2-7,4
Paraformaldeído (PFA)	Panreac	141451.1211	Prepare sempre fresco. Aqueça dH2O até 55– 60 ° C usando uma placa quente colocada em uma hotte e despeje o pó de PFA mexendo para obter uma solução a 8%. A solução é branca turva, pois o PFA não se dissolve facilmente. Adicione 1N NaOH gota a gota apenas até que a solução desapareça. Esfrie, filtre o papel Whatman e adicione um volume equivalente de 0,2 M PB.
Solução			0,9% NaCl em dH2O
Supercola	LOCTITE	767547
Azida sódica	Panreac	122712.1608
Glicina	Sigma-Aldrich	G7126-100
Soro de cabra normal	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergente
Anticorpo anti-GFP para coelho	ROCKLAND	600-401-215	Use em uma diluição de 1:500
Anticorpo Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Sondas moleculares	A-21206	Use em uma diluição de 1:750
Hidrato de dicloridrato de 6-Diamindino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Coloração nuclear fluorescente. Administrar a 2 mg/ml em ddH2O. Manter no escuro a 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Meio de montagem para preparações fluorescentes

Tubos de Ultracentrífuga Tubos FACS A solução de estoque Mistura de salina