Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Roberta Martinelli; Christopher V. Carman

doi:10.3791/53288

Artigo de método

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

DOI:

10.3791/53288

⸱

24 de dezembro de 2015

Roberta Martinelli¹ , Christopher V. Carman¹

¹Department of Medicine, Harvard Medical School - BIDMC

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imunidade adaptativa é regulada por interações dinâmicas entre as células T e células apresentadoras de antígenos ('APCs') conhecido como 'sinapses imunológicas. Dentro destas interfaces de célula-célula íntimos agrupamentos sub-celular discretas de MHC / Ag-TCR, F-actina, adesão e moléculas de sinalização formar e remodelar rapidamente. Essas dinâmicas são pensados para ser determinantes críticos tanto da eficiência e qualidade das respostas imunes que se desenvolvem e, portanto, de proteção contra a imunidade patológica. Compreensão atual das sinapses imunológicas com fisiológico APCs é limitado pela inadequação da resolução de imagem obtidos. Embora modelos substrato artificial (por exemplo, bicamadas lipídicas planas) oferecem excelente resolução e têm sido ferramentas extremamente valiosas, eles são inerentemente não-fisiológica e simplista. As células endoteliais vasculares e linfáticas surgiram como um tecido periférico importante (ou estroma) compartimento de "semi-profissãoai APCs '. Estas APCs que expressam (a maioria da maquinaria molecular de APCs profissionais) têm a característica única de formação da superfície celular praticamente plana e são facilmente transfectáveis (por exemplo, com os repórteres de proteína fluorescente). Aqui uma abordagem básica para implementar as células endoteliais como uma nova e fisiológico "planar modelo celular da APC 'para melhorar a imagiologia de interrogação e de processos fundamentais de sinalização antigénicos irá ser descrito.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os linfócitos T são um ramo do sistema imunitário adaptativo, caracterizado por a capacidade de reconhecer eficientemente antigénio peptídico (Ag) ligado ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) através dos seus receptores de células T (TCRs) ^1. Linfócitos naive constitutivamente migrar e digitalizar 'Ag células apresentadoras de profissionais "(APCs; por exemplo, células dendríticas) dentro de gânglios linfáticos, enquanto as células de memória / T efetoras precisa fazer um levantamento efetivamente uma gama extremamente ampla de APCs e células alvo em potencial dentro tecidos periféricos.

Na min após o rec....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todas as experiências descritas neste protocolo são realizadas com células T humanas primárias e células humanas primárias disponíveis comercialmente endoteliais (dérmica ou microvascular pulmonar ECs) protocolo de pesquisa .any envolvendo seres humanos deve ser aprovado por um conselho de revisão institucional e consentimento informado por escrito deve ser fornecida a partir de cada doador de sangue. Experimentos conduzidos utilizando este protocolo foi aprovado pelo IRB do Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. Preparar as células CD4 ⁺ Th1 Humano Effector / T de memória

Aplicar torniquete no braço do doador, limpe veia com álcool, e....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma nova abordagem de imagem usando células endoteliais e que combina as vantagens de resolução do cartão planar bicamadas lipídicas modelo com a complexidade fisiológica e deformabilidade da APC profissional foi desenvolvido (Figura 1). A Figura 2 proporciona exemplos de migração típica, fluxo de cálcio e dinâmica topológica observada com este abordagem. Na ausência de retracção no endotélio, os linfócitos ^T CD4 + Th1 SAg específicos espalhar.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No geral, este protocolo descreve métodos para a investigação de células endoteliais como i) APCs fisiológicos pouco estudado e ii) como um novo tipo de "modelo APC celular planar". Com relação ao primeiro, tornou-se cada vez mais apreciado que APCs não hematopoiéticas periférica (ou 'estromais') desempenham papéis, não redundantes críticos (ou seja, em comparação com hematopoiéticas APCs) na formulação de respostas imunes adaptativas ^16-18. Entre tais "semi-profissional" .......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Dr. Peter T. Sage por sua ajuda na geração de algumas das imagens representativas. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa NIH R01 para C.V.C. (HL104006).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Torniquete sem látex elástico BD	Biosciences BD Biosciences	367203
Cotonetes com álcool BD	Biosciences	BD Biosciences 326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biosciences	367861	K2
EDTA BD Vacutainer Conjunto de coleta de sangue com botão de pressão	BD Biosciences	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Traga para RT antes
de usar FCS-Optima	Atlanta Biologics	s12450
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
enterotoxina estafilocócica	B Toxina Tecnologia	BT202RED	Solução de estoque 1mg / ml em PBS
toxina da síndrome do choque tóxico 1	Tecnologia de toxinas	TT606RED	Solução de estoque 1mg / ml em
PBS IL-15 humano	R & D Systems	247-IL-025	Solução de estoque 50ug / ml em PBS
	PBS Life Technologies	10010-049
Fibronectina	Life Technologies	33016-015	Solução de estoque 1mg / ml em H20
HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells	Lonza	CC-2543	Outros ECs microvasculares humanos podem ser usados, ou seja, HLMVECs
EGM-2 MV kit de bala	Lonza	CC-3202
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Solução de estoque 10x, diluída em PBS
amaxa-HMVEC-L Kit de nucleofector	Lonza	vpb1003	Kit necessário para a etapa 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Solução de estoque 1mg/ml em H20
TNF-alfa 10ug, Human	Life Technologies	PHC3015	Solução de estoque 1mg/ml em fenol H20
HBSS sem vermelho	Life Technologies	14175-103
Hepes	Fisher Scientific	BP299-100
Cloreto	de Cálcio Sigma-Aldrich	C1016-100G	Solução de estoque 1M em H20
Cloreto	de magnésio Sigma-Aldrich	208337	Solução de estoque 1M em H20
Albumina de soro humano	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Immersol 518 F óleo de imersão livre de fluorescência	Fisher Scientific	12-624-66A
Fura-2 AM 20x50ug	Life Technologies	F1221	Solução de estoque 1mM em DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
pDsRed-Monomer (DsRed citoplasmático solúvel)	Clontech	632466
pDsMembrana de monômero vermelho (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-Actin	Clontech	6116-1
Alexa Fluor 488 Faloidin	Life Technologies	A12379
Solução de formaldeído 37%	Fisher Scientific	BP531-500	Tóxico, use capela
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML&
nbsp; Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 15mL	Fisher Scientific	14-959-70C
Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 50mL	Fisher Scientific	14-959-49A
Frascos Tratados com Cultura de Tecidos Falcon T25	Fisher Scientific	10-126-9
Frascos Tratados com Cultura de Tecidos Falcon T75	Fisher Scientific	13-680-65
Corning Cell Culture Treated T175	Fisher Scientific	10-126-61
Lamínulas de vidro	Fisher Scientific	12-545-85	12 mm de diâmetro
Placas de Cultura de Tecidos Falcon 24-well	Fisher Scientific	08-772-1
Placas Delta-T	Bioptechs	04200415B
Pipetas Pasteur Descartáveis Wheaton	Fisher Scientific	13-678-8D
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-402-25
ICAM1 camundongo anti-humano	BD Biosciences	555509
camundongo HS1 camundongo anti-humano	BD Biosciences	610541
Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purificado	ebioscience	BMS102
Anti-Human CD3 Alexa Fluor® 488	ebioscience	53-0037-41
Anti-MHC Classe II anticorpo	Abcam	ab55152
Anti-Talin 1 anticorpo	Abcam	ab71333
Anti-PKC theta anticorpo	Abcam	ab109481
fosfotirosina (4G10 Platinum)	Millipore	50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Eletroporador necessário para o passo 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss Axiovison Software	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Série 60) Armário de Segurança Biológica	NuAIRE	Nu-425-600
Forma STRCYCLE 37 ° C, 5% CO2 Incubadora de Cultura	de Células Centrífuga Fisher Scientific	202370
5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hemocitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemocitômetro Bright-Line
Isotemp Banho-maria modelo 202	Fisher Scientific	15-462-2

inativada por calor

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
Shaw, A. S., Dustin, M. L.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Ativa o de C lulas T C lulas Apresentadoras de Ant genos Imagem de Fluoresc ncia Imagem de C lulas Vivas YFP de Membrana DS Red Fluxo de C lcio Estimula o por Superant genos

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Neste artigo

Resumo

Resumo

Introdução

Protocolo

Resultados

Discussão

Divulgações

Agradecimentos

Materiais

Referências

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Artigos relacionados