Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e<em&gt; In Utero</em&gt; A electroporação em ratinhos C57BL / 6 mouse

Resumo

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Resumo

A eletroporação in utero é uma técnica amplamente utilizada para manipulação espaço-temporal rápida e eficiente de vários genes no sistema nervoso central de roedores. A superexpressão de genes desejados é tão possível quanto os estudos de perda de função mediados por shRNA. Portanto, oferece uma ampla gama de aplicações. A viabilidade de direcionar células específicas em uma área distinta aumenta ainda mais a gama de aplicações potenciais desse método muito útil. Para direcionar com eficiência regiões específicas, o conhecimento sobre as sutilezas, como o estágio embrionário, a voltagem a ser aplicada e, principalmente, a posição dos eletrodos, é indispensável.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado que permite a eletroporação in utero específica e eficiente de várias regiões do sistema nervoso central do camundongo C57BL/6. Em particular, é mostrado como transfectar regiões que se desenvolvem no córtex retroesplenial, no córtex motor, no córtex somatossensorial, no córtex piriforme, no cornu ammonis 1-3, no giro denteado, no estriado, no núcleo septal lateral, no tálamo e no hipotálamo. Para esta informação sobre o estágio embrionário apropriado, a voltagem apropriada para o estágio embrionário correspondente é fornecida. Mais importante ainda, um mapa de ângulo, que indica a posição apropriada do pólo positivo, é representado. Este protocolo padronizado ajuda a facilitar a eletroporação eficiente no útero, o que também pode levar a um número reduzido de animais.

Introdução

Desde a primeira descrição em 2001 por três grupos independentes ^1-3 i n útero electroporação tornou-se uma ferramenta padrão amplamente utilizado para analisar a expressão génica no sistema nervoso central de roedores. Em comparação com a geração de camundongos knockout, que é, apesar de técnicas de melhoria contínua, ainda que consome tempo e dinheiro, os apelos in utero eletroporação, devido à sua simplicidade. Então, in utero eletroporação permite gain- rápido e eficiente e perda de função estudos ^4.

Para transfectar as regiões cerebrais, a solução contendo o plasmídeo carregad....

Protocolo

Declaração de Ética: A manipulação dos ratos e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as directrizes europeias, nacionais e institucionais para cuidados com os animais.

1. In Utero Eletroporação

Nota: No útero electroporação foi realizada como publicado anteriormente ^12,14. Portanto, o método só é descrito resumidamente a seguir (Figura 1).

1. Preparativos
   1. Preparar a solução rápida de cor verde livre de endotoxina avançada plasmídeo transfecção-grade (contendo 1,5 pCAGGS), como descrito anteriormente ^12.
   2. ....

Resultados

A Figura 2, mostra exemplos para a específica in utero electroporação das regiões em desenvolvimento para o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu Ammonis 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral , o tálamo eo hipotálamo. Os resultados das transfecções são mostrados a seguir ao ângulo recomendado (Figura 2). Para melhor visualização dos ângulos in vivo a posição do eléctrodo (0,5 mm) também são exi.......

Discussão

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu ammonis 1-3, o giro denteado, o estriado, o núcleo septal lateral, o tálamo e o hipotálamo de camundongos C75BL/6. Com todas as informações fornecidas, este é o primeiro protocolo, que fornece todas as informações necessárias para recriar facilmente as transfecções dessas regiões cerebrais no camundongo C57BL / 6. As publicações anteriores são focadas principalmente apenas e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Maxi de Plasmídeo EndoFree	QIAGEN	12362
Fast Green	Roth	0301.1
pCAGGS	Capilares
(0,8-0,9 mm de diâmetro)	seriam Precision Instrument Inc.	1B100F-4
Isoflurano (Foreno)	Abbott	PZN 4831850
Carprofeno (Rimadyl)	da Pfizer GmbH	: 400684.00.00
pomada para os olhos (Bepanthen Augen und Nasensalbe)	Bayer	PZN 01578681
álcool benzílico a 0,9% solução salina	solução salina Farmácia do Centro Médico Universitário Mainz
gaze (ES-Kompressen)	Hartmann	407835
sutura de seda perma-hand estéril Ethicon	Johnson & Pinça de anel Johnson	K890H
1/ 1,5 mm	Ferramentas de Fine Science	11101-09
pinça de anel 4,8/ 6 mm	Ferramentas de Belas Ciências	11106-09
pinça de anel 2,2/ 3 mm	Ferramentas de Ciências Finas	11103-09
Pinça Adson Serrilhada Reta 12 cm	Ferramentas de Ciências Finas	1106-12
ÍrisTesoura-Delicada Reta-Afiada/ Blunt 10 cm	Fine Science Tools	14028-10
Mayo-Stille Tesoura-Reta 15 cm	Fine Science Tools	14012-15
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11251-20
Castroviejo NeedleHolder-com Lock-Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Elektroporator CUY21 SC	Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Microgrinder EG-44	Narishige
P-97 Micropette Extrator	Sutter Instrument Company	P-97
Eletrodos de platina 650P 0,5 mm	Nepagene	CUY650P0,5
eletrodos de platina 650P 3 mm	Nepagene	CUY650P3
Eléctrodos de platina 650P 5 mm	Nepagene	CUY650P5
Eléctrodos de platina 650P 10 mm	Nepagene	CUY650P10
Sistema de anestesia	Rothacher-Medical GmbH	CV-30511-3 Vapor 19.3
Placa de aquecimento	Rothacher-Medical GmbH	HP-1M
Controlador de temperatura 220V AC	Rothacher-Medical GmbH	TCAT-2LV

de vidro borossilicato Addgene Número de aprovação