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Artigo de método

Específicos do Striatum Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- e

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⸱

DOI:

10.3791/53303

⸱

18 de janeiro de 2016

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar especificamente diferentes regiões do sistema nervoso central C57BL/6 por meio de eletroporação in utero. Incluídas neste protocolo estão instruções detalhadas para transfecções de regiões que se desenvolvem no córtex, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo septal lateral e estriado.

Resumo

A eletroporação in utero é uma técnica amplamente utilizada para manipulação espaço-temporal rápida e eficiente de vários genes no sistema nervoso central de roedores. A superexpressão de genes desejados é tão possível quanto os estudos de perda de função mediados por shRNA. Portanto, oferece uma ampla gama de aplicações. A viabilidade de direcionar células específicas em uma área distinta aumenta ainda mais a gama de aplicações potenciais desse método muito útil. Para direcionar com eficiência regiões específicas, o conhecimento sobre as sutilezas, como o estágio embrionário, a voltagem a ser aplicada e, principalmente, a posição dos eletrodos, é indispensável.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado que permite a eletroporação in utero específica e eficiente de várias regiões do sistema nervoso central do camundongo C57BL/6. Em particular, é mostrado como transfectar regiões que se desenvolvem no córtex retroesplenial, no córtex motor, no córtex somatossensorial, no córtex piriforme, no cornu ammonis 1-3, no giro denteado, no estriado, no núcleo septal lateral, no tálamo e no hipotálamo. Para esta informação sobre o estágio embrionário apropriado, a voltagem apropriada para o estágio embrionário correspondente é fornecida. Mais importante ainda, um mapa de ângulo, que indica a posição apropriada do pólo positivo, é representado. Este protocolo padronizado ajuda a facilitar a eletroporação eficiente no útero, o que também pode levar a um número reduzido de animais.

Introdução

Desde a primeira descrição em 2001 por três grupos independentes 1-3 i n útero electroporação tornou-se uma ferramenta padrão amplamente utilizado para analisar a expressão génica no sistema nervoso central de roedores. Em comparação com a geração de camundongos knockout, que é, apesar de técnicas de melhoria contínua, ainda que consome tempo e dinheiro, os apelos in utero eletroporação, devido à sua simplicidade. Então, in utero eletroporação permite gain- rápido e eficiente e perda de função estudos 4.

Para transfectar as regiões cerebrais, a solução contendo o plasmídeo carregado negativamente é injectada num ventrículo. Durante o pulso eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao pólo positivo e, por conseguinte, a região transfectadas podem ser seleccionadas simplesmente alterando a posição do pólo positivo. Tem sido frequentemente demonstrado que várias regiões do sistema nervoso central pode ser TArgeted 3,5-8. Por exemplo, estudos recentes mostram transfecções específicos do hipocampo, córtex piriforme ou o estriado 9-11. No entanto, as informações sobre as posições adequadas são muitas vezes apenas mal padronizados e nem sempre são fáceis de transferir para diferentes linhagens de camundongos.

A transfecção de certos estágios embrionários está longe de ser trivial. Muitos fatores influenciam deve ser levado em consideração ao escolher o set-up para específica in utero eletroporação. Em primeiro lugar, para transfectar de forma otimizada as respectivas fases embrionárias, é necessário o conhecimento sobre as tensões apropriadas. Altas tensões diminuir a taxa de sobrevivência, enquanto que baixas voltagens reduzem a eficiência de transfecção 2,3,12. Também o tamanho da pá eletrodo desempenha um papel crucial, porque o uso de pás de eletrodos que são demasiado grandes resultados em menor especificidade ou podem causar a morte devido ao carinho do ritmo cardíaco 4,12,13. O aplicadatensão e do tamanho e da posição do eletrodo de remo são as características mais importantes a considerar, mas também há outros fatores que influenciam o resultado da eletroporação, como a quantidade aplicada de solução de DNA.

Nós desenvolvemos um protocolo detalhado que permite a transfecção rápido e eficiente de várias regiões do cérebro de C57BL / 6 rato 12. Neste protocolo de informação detalhada sobre as tensões para ser usado e o tamanho do eléctrodo de pá para uma maior especificidade é fornecido. Além disso, as informações sobre o ventrículo para ser preenchido, juntamente com as recomendações para a quantidade de solução de plasmídeo e a posição do eléctrodo é fornecido. A indicação das informações de posição detalhada em um mapa e de uma maior visualização destas posições permite específica simples e eficiente in utero eletroporação do córtex retrosplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme t,cornu Ammonis ele 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral, no tálamo e hipotálamo.

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Protocolo

Declaração de Ética: A manipulação dos ratos e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as directrizes europeias, nacionais e institucionais para cuidados com os animais.

1. In Utero Eletroporação

Nota: No útero electroporação foi realizada como publicado anteriormente 12,14. Portanto, o método só é descrito resumidamente a seguir (Figura 1).

  1. Preparativos
    1. Preparar a solução rápida de cor verde livre de endotoxina avançada plasmídeo transfecção-grade (contendo 1,5 pCAGGS), como descrito anteriormente 12.
    2. Puxe e moer (35 ° de ângulo de capilares de vidro de borosilicato) (0,8-0,9 de diâmetro) para injectáveis.
    3. Esterilizar instrumentos.
  2. Cirurgia
    1. Administrar analgésicos (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, sc, 24 h) depósito, pelo menos, 30 min antes de iniciar a cirurgia.
    2. Manter o comprimento dea anestesia para um máximo de 35-45 min (fase III - fase de anestesia cirúrgica de acordo com a Guedel 15 - máximo de 25-30 min).
    3. Anestesiar ratos cronometrados grávidas com isoflurano (indução de uma câmara de: 2,8%, a cirurgia por máscara: 2,5%). Confirme anestesia por falta de resposta aos pés-pitada.
    4. Aplicar pomada para evitar a secura ocular durante a anestesia.
    5. Esterilizar a área cirúrgica com 7,5% de solução providona-Iodo e cobrir o mouse com gaze estéril (úmido com solução salina 0,9% benzilo álcool), com apenas a área cirúrgica exposta.
    6. Cortar abrir a cavidade abdominal com um bisturi (incisão na pele: 1.5-2 cm, incisão muscular: 1-1,5 cm).
    7. Preserve a cavidade abdominal aberta de secar umedecendo com solução salina aquecida álcool benzílico a 0,9% ou outra solução isotônica estéril como dirigido por pessoal veterinário ou comitê.
    8. Extrair cuidadosamente cornos uterinos (usando uma pinça de anel, não toque no útero com o dedos).
  3. A injecção de ADN e electroporação. Nota: Os detalhes exatos para segmentar regiões específicas são indicadas na secção 2.
    1. Injectar-se lentamente a solução de cor de ADN para o ventrículo como indicado na Figura 1 e da secção 2 através dos capilares de borosilicato preparados.
    2. Aplique a tensão adequada para a fase embrionária correspondente (por exemplo., 36-38 V para E14) através de eletrodos especializados pinças-platina (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, intervalo de pausa 950 ms). As pás de electroporação de pulso durante a aplicação da tensão para minimizar os danos da parede uterina.
  4. Publicar eletroporação / cuidados pós-operatórios
    1. Recolocar cuidadosamente os cornos uterinos na cavidade abdominal.
    2. Suturar o músculo e a incisão na pele separadamente.
    3. Deixe o resto do mouse em um dispositivo de suporte térmico para a recuperação.
    4. Supervisionar o mouse durante a recuperação (comportamento, alimentação econsumo de água), 4 horas, 24 horas e 48 horas após a cirurgia. Se necessário, aplicar analgésicos adicionais (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, 24 horas depósito) para mais 2 dias.

2. A transfecção de áreas cerebrais específicas

Nota: A posição do pólo positivo é mostrado como o ângulo entre a linha de centro vertical através do ventrículo preenchido com a solução de ADN (o ventrículo direito ou terceira) e a posição do pólo positivo. Ao encher o ventrículo esquerdo as posições são invertidas-espelho. Na Figura 4 as posições da orelha primordial são mostrados, que fornecem importantes pontos de referência.

  1. A transfecção de áreas corticais (Figura 2A, a Tabela 1).
    1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de áreas corticais utilizar embriões E14.
    2. Injectar 1,5-2 ul de solução de ADN-ADN contendo 4 ug no ventrículo lateral direitoatravés dos capilares de borosilicato preparados.
      1. Posicione cuidadosamente o embrião usando uma pinça anel de modo que não há vasos visíveis acima do local da punção.
      2. Injectar-se lentamente a solução de DNA de aproximadamente 0,75 mm coronal da sutura lambdoidal e 0,5 mm lateral da sutura sagital (Figura 3). Certifique-se que a profundidade de inserção é de 1,2 mm (E14, medido a partir da parede uterina). Verifique se há uma coloração azul-verde com uma demarcação nítida.
    3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm.
      2. Utilize uma tensão que varia de 36-38 V.
      3. Colocar o centro dos eléctrodos apenas anterior dos primórdios da orelha.
      4. Para transfectar os ângulos de uso córtex retrospl�icos 330-0 °, para transfectar o córtex motor 0-40 °, para transfectar o córtex somatossensorial 40-95 °, para transfectaro córtex piriforme 95-110 ° (Figura 2A).
    4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões de 4 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
  2. A transfecção do hipocampo (Figura 2B, Quadro 1).
    1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de formação hipocampal utilizar embriões E15.
    2. Injectar-2 uL de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados.
    3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm.
      2. Utilize uma tensão que varia de 38-40.
      3. Colocar o centro do pólo negativo imediatamente anterior à orelha e o primórdio do centro Of o pólo positivo no meio de o primórdio da orelha.
      4. Para transfectar as giro dentado usar ângulos de 190-210 °, para transfectar as Ammonis cornu (CA) 3 210-230 °, para transfectar as CA2 230-250 °, para transfectar as CA1 250-275 ° (Figura 2B).
    4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Análise após a formação do hipocampo completo (após o nascimento, p21) executar conforme descrito na seção 3.
  3. A transfecção do núcleo septal lateral e corpo estriado (Figura 2C, Tabela 1)
    Nota: Os ângulos de sobreposição com aqueles para transfecção do hipocampo. Para transfectar eficazmente o núcleo septal lateral e o corpo estriado sem transfecção hipocampo indesejado fases anteriores embrionárias (E12) tem que ser usado.
    1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação in utero do núcleo septal lateral e striathum usar embriões E12.
    2. Injectar 1 ul de solução de ADN-contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados.
    3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Usar um eléctrodo de 0,5 mm.
      2. Use 33 V.
      3. Colocar o centro dos eléctrodos ao nível dos primórdios da orelha.
      4. Para transfectar os ângulos de uso do núcleo septal lateral 100-170 °, para transfectar as estriado 170-240 ° (Figura 2C).
    4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
  4. A transfecção do tálamo e hipotálamo (Figura 2D, Tabela 1)
    1. Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para o em Utero eletroporação do tálamo e hipotálamo uso de embriões E12-E13.
    2. Injectar-1-1,5 ul de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral (esquerda ou direita) através de capilares de borosilicato preparados. Espera durante 2-3 min, até a solução se difunde para o terceiro ventrículo. Alternativamente injectar directamente no terceiro ventrículo.
      Nota: Isso melhora especificidade, mas pode causar uma taxa de sobrevivência diminuiu (de alto risco de danos).
    3. Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
      1. Usar um eléctrodo 0,5 ou 3 mm.
      2. Utilize uma tensão que varia de 33-35 V.
      3. Colocar o centro dos eléctrodos apenas posterior os primórdios da orelha.
      4. Para transfectar os ângulos de utilização a partir de 25-40 ° tálamo, para transfectar o hipotálamo 90-180 ° (Figura 2D).
    4. Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios como descrita no ponto 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.

3. Perfusão Fixation

  1. Preparativos
    1. Quente 4% de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C.
    2. Encha uma seringa de 50 ml com PBS (4 ° C) e uma segunda seringa aquecido com PFA. Evite bolhas.
    3. Conecte as seringas a uma torneira de três vias. Conecte o terceiro fim a um conjunto de infusão voada (borboleta).
    4. Lave o conjunto de infusão voado com PBS.
  2. Perfusão
    1. Profundamente anestesiar os ratos (ou pós-natal grávida transfectadas) com aplicação subcutânea de cloridrato de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (7,5 mg / kg).
    2. Confirme o estágio de tolerância cirúrgico por falta de resposta aos pés-pitada.
    3. Abra a cavidade abdominal logo abaixo da caixa torácica.
    4. Corte cuidadosamente o diafragma.
    5. Cuidadosamente abra a caixa torácica através de um corte na each local até a clavícula.
    6. Inserir a ponta da borboleta para dentro da câmara do coração esquerdo (a partir do ápice do coração).
    7. Corte o apêndice atrial esquerdo.
    8. Lentamente perfundir o rato com PBS (aproximadamente 10 ml).
    9. Alterne a torneira de três vias.
    10. Perfundir o mouse com 5-10 ml PFA 4%.
    11. Decapitar o mouse com uma tesoura e dissecar o cérebro começando no forame magno. Realize a dissecção como publicado anteriormente 16.
    12. Postfixate o cérebro por 2 dias em PFA 4%. Manter os cérebros a 4 ° C no escuro.

4. A imuno-histoquímica

  1. Gerar 70 um secções (por exemplo, com um vibratome).
  2. Opcional: aumentar a fluorescência com coloração de anticorpos.
    1. Bloquear as secções durante 1 hora à temperatura ambiente (0,1-0,2% de Triton X-100, 5% de soro de cabra normal)
    2. Incubar O / N com o anticorpo apropriado (anti-GFP, 1: 1000)
    3. Lavar 3-5 Vezes com tampão de 0,1 M fosfato.
    4. Incubar 3-5 h com o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado (Alexa Fluor 488 anti-coelho-IgG conjugada, 1: 1000).
    5. Opcional: contracoloração com 4-6-diaminodino-2-fenilindole (DAPI, 0,2 g / ml em tampão fosfato 0,1 M) durante 1 min.
    6. Analise de fluorescência com um microscópio de fluorescência apropriado.

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Resultados

A Figura 2, mostra exemplos para a específica in utero electroporação das regiões em desenvolvimento para o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu Ammonis 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral , o tálamo eo hipotálamo. Os resultados das transfecções são mostrados a seguir ao ângulo recomendado (Figura 2). Para melhor visualização dos ângulos in vivo a posição do eléctrodo (0,5 mm) também são exi...

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Discussão

Este protocolo descreve em detalhes como transfectar o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu ammonis 1-3, o giro denteado, o estriado, o núcleo septal lateral, o tálamo e o hipotálamo de camundongos C75BL/6. Com todas as informações fornecidas, este é o primeiro protocolo, que fornece todas as informações necessárias para recriar facilmente as transfecções dessas regiões cerebrais no camundongo C57BL / 6. As publicações anteriores são focadas principalmente apenas e...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Técnico apoiado por Melanie Pfeifer e Nikolai Schmarowski (Instituto de Anatomia Microscópica e Neurobiologia, Centro Médico Universitário de Mainz).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit Maxi de Plasmídeo EndoFreeQIAGEN12362
Fast GreenRoth0301.1
pCAGGSCapilares
(0,8-0,9 mm de diâmetro)seriam Precision Instrument Inc.1B100F-4
Isoflurano (Foreno)AbbottPZN 4831850
Carprofeno (Rimadyl)da Pfizer GmbH: 400684.00.00
pomada para os olhos (Bepanthen Augen und Nasensalbe)Bayer PZN 01578681
álcool benzílico a 0,9% solução salinasolução salina Farmácia
do Centro Médico Universitário Mainz
gaze (ES-Kompressen)Hartmann407835
sutura de seda perma-hand estéril EthiconJohnson & Pinça de anel JohnsonK890H
1/ 1,5 mmFerramentas de Fine Science11101-09
pinça de anel 4,8/ 6 mmFerramentas de Belas Ciências11106-09
pinça de anel 2,2/ 3 mmFerramentas de Ciências Finas11103-09
Pinça Adson Serrilhada Reta 12 cmFerramentas de Ciências Finas1106-12
ÍrisTesoura-Delicada Reta-Afiada/ Blunt 10 cmFine Science Tools14028-10
Mayo-Stille Tesoura-Reta 15 cmFine Science Tools14012-15
Dumont #5 Forceps-InoxFine Science Tools11251-20
Castroviejo NeedleHolder-com Lock-Tungsten Carbide 14 cmFine Science Tools12565-14
Elektroporator CUY21 SC Nepa Gene Co.
FST 250 Hot Bead SterilizerFine Science Tools18000-45
Microgrinder EG-44Narishige
P-97 Micropette ExtratorSutter Instrument CompanyP-97
Eletrodos de platina 650P 0,5 mmNepageneCUY650P0,5
eletrodos de platina 650P 3 mmNepageneCUY650P3
Eléctrodos de platina 650P 5 mmNepageneCUY650P5
Eléctrodos de platina 650P 10 mmNepageneCUY650P10
Sistema de anestesiaRothacher-Medical GmbHCV-30511-3 Vapor 19.3
Placa de aquecimentoRothacher-Medical GmbHHP-1M
Controlador de temperatura 220V ACRothacher-Medical GmbHTCAT-2LV
de vidro borossilicato Addgene Número de aprovação

Referências

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Reimpressões e permissões

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