Artigo de método

Uma alternativa simples para injeção estereotáxica para Brain Knockdown específico de miRNA

DOI:

10.3791/53307

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26 de dezembro de 2015

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1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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MicroRNAs desempenham papéis cruciais no cérebro e são alvos potenciais para modelar a neurodegeneração. No entanto, perturbar os níveis de miRNA é um desafio devido ao curto comprimento do miRNA e à inacessibilidade do tecido cerebral. Este vídeo apresenta um método para o design do antagomir e entrega específica do cérebro usando um neuropeptídeo em camundongos.

Resumo

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MicroRNAs (miRNAs) são os principais reguladores da expressão gênica. No cérebro, processos vitais como neurodesenvolvimento e funções neuronais dependem da expressão correta de microRNAs. A perturbação de microRNAs no cérebro pode ser usada para modelar doenças neurodegenerativas, modulando a morte celular neuronal. Atualmente, a injeção estereotáxica é usada para fornecer agentes de knockdown de miRNA a um local específico no cérebro. Aqui, discutimos estratégias para projetar antagomiros contra miRNA com modificações de nucleotídeos bloqueados (LNA). Posteriormente, descreva um método para entrega específica do cérebro de antagomirs, uniformemente em diferentes regiões do cérebro. Este método é simples e amplamente aplicável, pois supera a cirurgia, lesão associada e limitação do parto local em injeções estereotáxicas. Preparamos um complexo de peptídeo neurotrópico de penetração celular Rabies Virus Glycoprotein (RVG) com antagomir contra miRNA-29 e injetado através da veia da cauda, para entrega específica no cérebro. O desenho do antagomir incorporou características que permitem o direcionamento específico do miRNA e a formação de complexos não covalentes com o peptídeo. O knock-down do miRNA nas células neuronais resultou na morte celular apoptótica e defeitos comportamentais associados. Assim, o método pode ser utilizado para modelos agudos de neurodegeneração por meio da perturbação de miRNAs.

Introdução

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MicroRNAs surgiram como novos alvos terapêuticos devido ao seu papel universal na regulação da expressão gênica e evidência direta para o envolvimento na doença. MiRNAs estão sendo ativamente explorados por seu potencial como fármaco atinge 1,2. Além disso, alterações na expressão de miARN estão associados com várias doenças e 3 simulação da variação por perturbação expressão artificial de miARN pode ser usado para estudar as vias celulares envolvidas na manifestação da doença. Entrega específica do tecido de miRNA drogas que alvejam é atualmente um grande desafio para o desenvolvimento de drogas com base miRNA. Antagomirs e imita miARN são agentes promissores para perturbar os níveis de miARN 4-6. No entanto, as características especiais que melhoram a sua especificidade e eficácia tem que ser incorporado no desenho de antagomirs antes que eles possam ser utilizados in vivo para a perturbação da expressão miARN.

Os microRNAs são especialmente relevantes como alvos em neurodegenerativa atualmente incurável e doenças neuro-desenvolvimento. A barreira hemato-encefálica coloca uma restrição para a entrega de antagomirs no cérebro. Injecções estereotáxicas são amplamente utilizados em modelos de roedores para entregar moléculas para locais específicos no cérebro 7. Ele requer habilidade, grandes investimentos na instrumentação e no tempo. Injecções estereotáxicas são invasivos, envolver cirurgia, causar pelo menos lesões menores e são restritas a entrega local. A utilização de péptidos de células de penetração com uma preferência para os neurónios de segmentação pode contrariar estas limitações, uma vez que podem ser entregues por via trans-vascular, mas romper a barreira hemato-encefálica. Tal péptido derivado da glicoproteína do vírus da raiva (RVG), foi previamente utilizado para entregar siRNA contra vírus de encefalite japonesa em ratinhos 8. Descobrimos que utilizando o péptido para antagomir entrega, miRNAs pode ser efetivamente derrubado no cérebro do rato 9.

ontent "> O segundo grande desafio de miRNA knock-down é oriundo da pequena dimensão dos miRNAs ea presença de isoformas de sequências estreitamente relacionadas. Tomamos o exemplo de mmu-miR-29 da família que consiste em três isoformas estreitamente relacionadas, miR-29a , b e c. antagomirs são também geralmente modificado ao longo da espinha dorsal para aumentar a sua estabilidade e torná-las resistentes ao ataque por nucleases. Locked Nucleic Acid (LNAs) oferecem uma vantagem adicional que eles melhoram a estabilidade térmica e mesmo conduzir a alvejar degradação ao longo e para além impedimento estérico 10. Introduzindo modificações ao longo de toda a coluna vertebral pode ser eficaz, mas dispendioso. Temos anteriormente visto que as modificações para além de um número óptimo pode não aumentar ainda mais a eficácia. O desenho do antagomir envolve, por conseguinte, a modificação óptima do antagomir.

Para o complexo antagomir de forma não covalente com o péptido neurotrópico, um hepta- carregada para o ramal de nona-arginina é utilizada. D-Argininaresíduos são utilizados, uma vez que conferem uma maior estabilidade, que não são susceptíveis a clivagem por proteases. Hepta para trechos nona-arginina agir agentes celulares penetrante como eficientes, embora eles não conferem especificidade tipo de célula. Por ligação covalente do péptido ao ligante RVG nona-arginina, um neurotrópico, célula penetrando péptido foi gerado. Os resíduos carregados positivamente do péptido interagir com a estrutura de ácido nucleico carregado negativamente, para formar complexos. Estes complexos podem ser utilizados para transfectar eficazmente ADN ou ARN em células em cultura e in vivo para os tecidos.

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Protocolo

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Nota: Todo o processo, incluindo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional Animais (AICE) do Instituto de Genômica e Biologia Integrativa, Nova Deli (IGIB / AEC / 10/2013). Este protocolo é adaptado especificamente para entrega direccionada de antagomir-29 no cérebro e knockdown de miR-29.

1. antagomir Design Estratégia

  1. Recuperar a sequência madura miRNA de miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Recuperar as sequências dos membros da família relacionadas miRNA usando o link "Gene Família" no registro miRBase
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Inverta a sequência complementar: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html proporciona uma ferramenta conveniente parainverter sequências do complemento.
  4. Marcar as posições a serem modificados por LNA usando as seguintes diretrizes:
    1. Escolha resíduos timina colocados 3-4 bases com excepção para a modificação LNA, desde pirimidinas LNA são mais estáveis ​​do que 12 purinas.
    2. Escolha resíduos de citosina separadas por 3-4 resíduos se o passo anterior produz menos do que cinco modificações.
    3. Dar prioridade às cinco alterações à extremidade 5 'do antagomir, uma vez que isto evita a sequência de semente.

Preparação Complexo 2. antagomir-neuropeptídeo

Nota: Este é o passo mais crítico no protocolo e que necessita de padronização. Para padronizar o protocolo qualquer oligonucleótido marcado por fluorescência (FLO) pode ser usado em lugar do antagomir 9. Os péptidos devem ser de elevada pureza (qualidade para HPLC, 98% de pureza) .Sequences e carga do péptido e antagomir são dadas na Tabela 1.

  1. Decida o número de moles de antagomir a ser injectado com base na carga molar em antagomir, a sua toxicidade e o peso do rato. Calcular o número de moles de péptido a ser injectado com base na razão molar de carga antagomir: péptido.
    NOTA: Padronizar razão de carga molar de antagomir: peptídeo de toxicidade e entrega efetiva no cérebro do rato. Use diferentes razões de carga molar de oligonucleotídeo marcado por fluorescência: peptídeo para a normalização. Descobrimos que antagomir-29 e controle foram tóxicos em 4microgram / grama de peso corporal do rato. Antagomir-29 e controlo foram usadas em 2microgram / grama de peso corporal, mas esta concentração eficaz é susceptível de variar para cada microARN.
  2. Dilui-se o péptido e antagomir em tubos de microcentrífuga separados a partir de soluções de reserva estéril com 10% de D-glicose para a concentração final desejada, como calculado no passo 1.
  3. Manter o tubo de microcentrifugação com a solução de péptido em um vórtice no vórtex a velocidade moderada.
  4. Adicione 1/3 do umntagomir solução para o tubo de solução de péptido, lentamente, gota a gota, ao mesmo tempo que é muito bem misturado em um misturador de vórtice.
  5. Continue a misturar de soluções no vortex durante 1 minuto e em seguida, em seguida, deixar a mistura repousar durante 1 min.
  6. Repetir o passo 4 e 5 mais duas vezes para misturar o restante antagomir solução com a solução de péptido no mesmo tubo de microcentrífuga. A adição lenta é crítico para a formação de complexos mono-dispersa que são eficazes na transfecção. Adição rápida pode conduzir a agregação dos complexos e a sua precipitação.
  7. Incubar o complexo durante 30 min à temperatura ambiente sem agitação em vórtice. Durante este tempo de incubação, aclimatar os ratos para o laboratório onde as injecções serão realizados.

3. Injecção da veia da cauda do Complexo antagomir-neuropeptídeo

  1. Para conter o animal, coloque o mouse em uma restrainer ou decapicone de tamanho adequado.
  2. Limpar a superfície da cauda usando cotonete PRem água morna (cerca de 40 ° C) embebido-e. Isto vai promover a vasodilatação e aumentar a visibilidade da veia.
  3. Abordagem a cauda com um pequeno volume (0,5 - 1.0 cc) seringa de insulina com um ângulo de 15-20 °. Tenha cuidado para não introduzir qualquer ar dentro da seringa. Comece na porção distal da cauda. Injectar o complexo. Remover a agulha e aplicar um toalhete anti-séptico directamente no local da injecção (aproximadamente 5-10 s) para parar qualquer sangramento.
  4. Substituir o rato em uma gaiola ventilado individualmente no grupo de 3-5, com o carolo de milho e papel de seda como o enriquecimento. Não manter os ratos não injectados e injetadas no mesmo gaiola.

4. Os ensaios comportamentais

Nota: Mantenha o intervalo de tempo de 3-4 horas entre injeção e comportamentais ensaios para permitir a recuperação após a injecção. Traga o mouse para uma tranqüila. Não perturbe os animais durante este período de aclimatação.

  1. Aclimatar o mouse para anovo ambiente durante 30 minutos e, em seguida, iniciar os seguintes ensaios comportamentais. Manter um intervalo de 10 minutos entre cada ensaio comportamental.
  2. Clasping hindlimb:
    NOTA: Este teste indica disfunção motora e comprometimento neurológico.
    1. Levante o mouse suavemente, segurando perto da base da cauda no fundo claro.
    2. Verifique a posição dos membros posteriores de 10-15 seg. Tipo selvagem do rato splays membros posteriores longe do abdómen, enquanto um rato atáxica tende a retrair ou ambos os membros posteriores um em direcção ao abdómen mais do que 50% do tempo de suspensão 13.
    3. Devolver o mouse para a gaiola
  3. Teste Ledge:
    1. Levante o mouse suavemente, segurando a cauda e mantê-lo na borda de uma gaiola.
    2. Observar o ratinho especificamente no canto da gaiola. Rato do tipo selvagem pode passar os cantos facilmente sem medo e perder o equilíbrio. Rato Ataxic perder seu equilíbrio, congelar ou treme enquanto caminhava ao longo da borda gaiola e nos cantos.
  4. ensaio Rato foot print:
    NOTA: Para este ensaio manter a folha absorvente pronto, no chão de uma pista estreita (~ 70 cm de comprimento, largura ~-5-cm, com paredes de ~ 5 cm de altura).
    1. Segure o mouse suavemente por um lado e aplicar tinta nas patas traseiras por uma escova.
    2. Coloque a folha absorvente sobre o chão de uma pista estreita.
    3. Permitir mouse para caminhar ou correr sobre uma folha absorvente em uma linha reta em uma pista de decolagem de uma ponta a outra.
    4. Repetir o processo mais duas vezes com cada rato utilizando folha absorvente fresco.
    5. Medir a distância entre duas etapas consecutivas no movimento para a frente. Não incluem primeiro e últimos pegadas onde o animal é apenas iniciar e terminar sua corrida, respectivamente.

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Resultados

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Usando o processo aqui apresentado, os complexos de oligonucleótido marcado por fluorescência 50microgram (FLO) e ~ 850microgram RVG péptido de 01:15 proporção molar de carga (FLO: péptido) foram preparados e injectados apenas uma vez através da veia da cauda. Complexo de não-neurotrópico Matrix VÍRUS DA RAIVA (RVM) e FLO péptido foi utilizado como um controlo de entrega. No dia seguinte, os ratos cérebro e fígado foram isoladas e suspensões de células isoladas foram preparadas. As células foram observadas ao microscópi...

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Discussão

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Aqui demonstramos uma metodologia amplamente acessível para estudar os efeitos da modulação do miRNA. Atualmente, a maioria das tentativas de caracterização in vivo das funções dos miRNAs envolve a criação de camundongos knockout ou um transgênico que expressa uma esponja de miRNA. A maioria dos miRNAs, mesmo os específicos do tipo de célula, são expressos em mais de um órgão. Por exemplo, miRNAs inicialmente considerados específicos do sistema hematopoiético também são expressos no cérebro, devido à presença...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Souvik Maiti pela ajuda no projeto dos antagomirs. Também agradecemos a Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey e Bijay Pattnaik por sua ajuda com métodos experimentais. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (BSC0123). HS, MV e RR reconhecem a bolsa do Conselho de Pesquisa Científica e Industrial da Índia. O MAS reconhece a bolsa da Comissão de Bolsas Universitárias, Índia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Vortex
Restrainer ou Decapicone
Pista~ 70 cm de comprimento, ~ 5 cm de largura com paredes de ~ 5 cm de altura.
Reagentes
Oligonucleotídeos marcados com fluorescência (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% de D-glicose
Antagomir-29Exiqonsíntese
Controle de AntagomirExiqonsíntese
Neuropeptídeo RVGG.L.Biochem ( Xangai) Ltd.síntese feita sob encomenda> pureza de 98%
NeuropeptideRVM G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.síntese personalizada> 98% de pureza
Outro
algodão
Água
Seringas
Folhas
Tinta
Escova
Anti-séptico
estreita estérilpersonalizadapersonalizadamornade insulinaabsorventes

Referências

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