Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Resumo

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Resumo

β amilóide (Aβ) é um importante mediador patológico da doença de Alzheimer (DA) familiar e esporádica. Nos cérebros de pacientes com DA, observa-se acúmulo progressivo de oligômeros e placas Aβ. Acredita-se que essas anormalidades Aβ bloqueiem a potenciação a longo prazo, prejudiquem a função sináptica e induzam déficits cognitivos. Evidências clínicas e experimentais revelaram que o aumento agudo dos níveis de Aβ no cérebro permite o desenvolvimento de fenótipos semelhantes aos de Alzheimer. Portanto, um protocolo detalhado descrevendo como gerar agudamente um modelo de camundongo AD por meio da injeção intracerebroventricular (ICV) de Aβ é necessário em muitos casos. Neste protocolo, estão incluídas as etapas do experimento com um camundongo injetado com Aβ, desde a preparação de peptídeos até o teste de anormalidades comportamentais. O processo de preparação das ferramentas e dos animais antes da injeção, de injeção do Aβ no cérebro do camundongo por meio de injeção de ICV e de avaliação do grau de comprometimento cognitivo são facilmente explicados ao longo do protocolo, com ênfase em dicas para injeção eficaz de Aβ no ICV. Ao imitar certos aspectos da DA com uma injeção designada de Aβ, os pesquisadores podem contornar o processo de envelhecimento e se concentrar na patologia a jusante das anormalidades Aβ.

Introdução

Dado que amilóide-β (Ap) é uma característica patológica da doença de Alzheimer (AD), o desenvolvimento de modelos animais AD tem incidido sobre a superexpressão neural de Ap. Por causa mutações na proteína precursora de amilóide (APP) ou presenilina (PS) levar a distúrbios de Ap equilíbrio e, finalmente, para a patogênese da familial AD ^1, modelos de ratos que envolvem mutações no gene APP ou PS foram geralmente aceite. Entre o vasto leque de ratinhos transgénicos, modelos de ratinho prototípicas incluem o seguinte: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 e APP23. No cérebro, estes ratinhos apresentam geralmente agregação de Ap e, eventualmente, as placas senis; formação de placas é seguido por comprometimento cognitivo significativo de tal forma que eles mostram um fraco desempenho em testes comportamentais de aprendizagem e memória. A geração de usar camundongos transgênicos que, naturalmente, imitar AD patologia humana contribuiu, assim, para a sociedade AD pesquisa, permitindo-nos para monitorar a progressão da diSease. No entanto, utilizando ratinhos transgénicos não é económico e demorado porque leva meses para que os ratos desenvolvem placas de Ap e ainda mais tempo para mostrar sináptica induzida com Ap ou anormalidades comportamentais ^2,3. Originalmente desenvolvido como uma alternativa para ultrapassar as deficiências dos modelos de ratinho transgénicos, modelos não transgénicas são também vulgarmente utilizado devido às suas vantagens distintas. modelos AD induzida pelo agente patogénico pode ser produzida através da injecção directa de Ap no cérebro, ao passo que os défices cognitivos ad como também pode ser desencadeada por outras químicas e físicas meios, tais como a injecção de compostos neurotóxicos como a escopolamina, a indução de lesões em áreas relacionadas com a cognição, como o hipocampo, ou por danos cortical ^4. No entanto, a indução não patogênico de comprometimento cognitivo não reflete com precisão a fisiopatologia fundamental da AD; em vez disso, ele só imita seus resultados sintomáticos. Em contraste, um modelo de AD induzida pelo agente patogénico, o A46; modelo -injected rato, não só pode mostrar anormalidades comportamentais AD-like, mas também podem apresentar patologia Aâ, a característica comum compartilhada por AD familiar e esporádica.

Apesar da dificuldade para visualizar as placas de Ap no tecido cerebral, o maior benefício do modelo com injecção de Ap, que faz com que seja atraente para investigação AD é a sua controlabilidade. Pesquisadores podem eliminar as diferenças individuais em modelos de ratos que podem levar a dados errados nos estudos relacionados com a droga. tratamento medicamentoso oportuna é activado dependendo de o mecanismo da droga candidata; para elaborar, um inibidor de agregação de Ap pode ser aplicada antes da injecção de Ap. Além disso, os investigadores podem assumir que a transformação patogénico que surge após a injecção Ap é derivada da exposição Ap porque os outros factores sejam estritamente controladas, incluindo diferenças individuais.

Neste protocolo, uma vívida descrição de how para induzir um fenótipo AD-como em ratos normais via Ap intracerebroventricular injecção (ICV) sem instrumentos estereotáxica é apresentado. Minimizando os danos provocados-inserção para o tecido cerebral é essencial para evitar a possibilidade de danos estruturais e a inflamação induzida pela lesão. A falta de habilidade no manuseio do mouse leva à lesão neuronal inesperado. Além disso, as técnicas que permitem o ângulo e profundidade adequada para ser alcançado durante a injecção são especialmente importantes para contornar erros frequentes. Em adição a uma explicação detalhada, vivas da injecção ICV, a fiabilidade do modelo produzido pelo seguinte protocolo é também ilustrado nas secções seguintes. O protocolo a seguir poderia ser uma ferramenta confiável e de fácil compreensão que contribua para a investigação AD, proporcionando assim um degrau que poderia levar a uma descoberta significativa para a sociedade AD.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publicações No. 8023, revisto 1978) e com o Comitê de Cuidado e Uso do animal do Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de KIST (Seul, Coréia).

1. Preparação de animais

1. Prepara-se uma grupo de ratinhos ICR machos com 7 semanas de idade (ou C57BL / 6).
2. Deixe os ratos passam por um processo de aclimatação para 3-7 dias após o transporte para restaurar a homeostase. Em geral, colocar um grupo de 4-5 ratos em cada gaiola, e mantê-las a 22-23 ° C e 40% de humidade, com um 12/12 h ciclo de luz / escuro. Fornecer água e comida ad libitum.
   Nota: O processo de aclimatação é fundamental para permitir a recuperação do stress da navegação e adaptação à nova moradia, alimentação, água e cheiro, bem como uma nova gaiola e ciclo de luz. Nesta experiência, os ratinhos foram alojados em gaiolas individualmente ventiladas (IVCS) localizados na SPEespe- Pathogen Free (SPF) instalação -grade
3. Pesar cada mouse e excluir indivíduos cujo peso se desvia ± 10% da média.
4. Divida os participantes em dois grupos: um grupo com injecção de veículo (Ap (-)) e um grupo de Ap-injetada (Ap (+)). Se a experiência é testar a eficácia de um fármaco candidato particular, dividir os ratos em quatro grupos: (1) Ap (-) / fármaco (-), (2) Ap (-) / droga (+), (3) Ap (+) / fármaco (-), e (4) Ap (+) / droga (+).

2. Ap Peptide Preparação

1. Tratar os peptídeos Ap, derivados através de síntese química ou ⁵ a partir de fontes comerciais, com pré-refrigerada 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para dissolver quaisquer agregados e para tornar os péptidos homogéneas ⁶ .
   1. Sonicar a solução Ap / HFIP num sonicador de banho-maria durante 5 min (a temperatura ambiente), gentilmente vórtice, e incubar a solução durante 30 min à TA. Remover o HFIP completamente por meio de evaporação com azotoe armazenar o Ap homogénea à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.
2. Prepare os monómeros de Ap: (. 100 uM Aâ, 10% de DMSO, 90% de PBS) fazer um estoque Ap mM dimetilsulfóxido (DMSO) e diluir 10 vezes em tampão fosfato salino (PBS)
3. Prepare oligômeros de Ap.
   1. Incubar a solução de monómero de Ap (contendo Ap (1-42) ou de Ap (1-40)) (passo 2.2.) A 37 ° C durante 3 ou 7 dias, respectivamente.
   2. Coloque a solução de Ap num tubo selado num saco de zíper contendo uma toalha de papel húmido para proporcionar um ambiente humidificado para evitar a evaporação de água durante o período de incubação.
4. Confirmar Ap oligómeros preparados por meio de electroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com ligação cruzada foto-induzido de proteínas não modificadas ^6.
5. Preparar a solução de PBS de controlo contendo 10% de DMSO para a injecção ICV veículo.

3. Seringa Preparação

1. Prepare uma micro com uma agulha de aço inoxidável 26 G para injecção ICV.
2. Esterilizar a seringa na autoclave com todos os outros aparelhos, que vai ser usado para o procedimento cirúrgico. Depois de o autoclave, colocar o aparelho sob a luz UV durante 20 min.
3. Enrole a agulha da microseringa com Parafilm para ajustar o seu comprimento até 3,8 mm, para permitir a máxima precisão na profundidade da injecção para dentro do cérebro (Figura 1A). (Para ratinhos B6, ajuste agulha de seringa de 3,6 mm).
   Nota: A compressão do Parafilm conduzirá à profundidade da injecção superior a 3,6 milímetros ventral. Para evitar que o Parafilm de ser comprimida durante a inserção da agulha, densamente envolver a agulha várias vezes.
4. Lavar o espaço interior da seringa com 70% etanol, duas vezes.
5. Sonicar a seringa e a agulha num sonicador de banho-maria durante 30 min à TA.
6. Lavar o espaço interior da seringa com 70% etanol, duas vezes.
7. Lavar a seringacom água destilada e seca-lo completamente numa hotte durante mais de 30 min. Deixar a seringa limpa sob uma luz UV durante 20 min antes de iniciar a injecção de Ap.

4. Ap-injetada mouse Preparação Modelo

Nota: Limpar o campo operacional com um desinfectante para manter condições estéreis e esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos para injecção ICV usando 70% de etanol e exposição aos raios UV.

1. Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal de uma mistura de xilazina (20 mg / kg) e tiletamina HCl / zolazepam HCl (80 mg / kg) antes da injecção ICV. Posicione o mouse sobre um tapete quente para manter a sua temperatura corporal, enquanto anestesiados e confirmar anestesia adequada, avaliando a resposta do pé-pitada.
2. Aplicar PBS estéril cai para ambos os olhos para evitar a secura da córnea durante o procedimento (Figura 1B).
3. Prepare dois espelhos desenhando várias linhas retas verticais em suas superfícies em caso de difficuLTY injectando a seringa perpendicularmente.
4. Coloque um espelho (M1) mesmo ao lado do corpo do mouse eo outro (M2) na frente da cabeça. Manter M1 paralela à linha média imaginária entre os dois olhos do rato e providenciar a M1 M2 perpendicular, de modo que os dois planos formam um ângulo de 90 ° (Figura 1C). Coloque M1 no lado esquerdo do mouse se o pesquisador é destro. Coloque M1 no lado direito do mouse, se o pesquisador é canhoto.
5. Spray de etanol a 70% para o meio da testa do mouse e esfregue-o com cotonetes secos. Não molhar muito grande de uma área da testa para evitar a diminuição da temperatura do corpo devido a evaporação do álcool.
6. Limpe a mesma área na testa com uma solução de clorexidina a 2% utilizando um cotonetes limpos. scrubbings repetida com álcool e de cloro para o total de três vezes cada.
   Nota: Se necessário, raspar o cabelo na testa do mouse, a fim de minimizar a possidade de contaminação
7. Localize bregma.
   1. Usando o polegar eo dedo indicador, firmemente mantenha a pele da testa, logo acima dos dois olhos, a ponto de ambos os olhos salientes. Arraste a pele de volta para fazer a testa tenso e minimizar os movimentos do crânio sob a pele.
   2. Formar um triângulo invisível através da atribuição de três vértices: os dois olhos do rato e do ponto onde o polegar eo dedo indicador se encontram, o bregma. (Figuras 1B, seta vermelha: bregma)
8. Localizar o ponto de injecção com fita de medição: ± 0,06 -1,0 mm posterior ao bregma, 1,8 mm lateral ± 0.1 para a sutura sagital, e 2,4 mm de profundidade (Figura 1D, estrelas azuis: pontos de injecção em cada hemisfério). (Para ratinhos B6: -0,9 mm posterior, 1,7 mm lateral, e 2,2 mm de espessura)
9. Encher a seringa com 10 ul de solução de Ap ou veículo com a solução em excesso, a fim de evitar a injecção de ar acidental.
10. Coloque a seringa no thalínea e injeção (descrita no protocolo 4.7). Adicione a seringa perpendicular ao plano do ponto de injecção. Alinhar reflectida imagens da seringa em ambos os espelhos com as linhas traçadas nos espelhos de uma perspectiva fixo (Figura 1C).
11. Comece a inserção da agulha até que a embalagem atinge a pele parafilme.
12. Manter a seringa segurando a mão firme e usar outro lado para injectar 5 ml da solução de Ap ou veículo, lentamente ao longo de 5 segundos sem pausa. Certifique-se a seringa permanece perpendicular por toda parte. Depois de completar a injecção, aguarde 3 a 5 segundos antes de retirar a seringa para a difusão.
13. Assumindo a posição de triângulo original, exercer uma pressão moderada para proteger o crânio de quaisquer movimentos desnecessários. Retire a seringa sem inclinação.
14. Posicione o mouse Ab-injectado na almofada quente para a recuperação e manter sua decúbito esternal. Não deixe o mouse sem vigilância até que ele recupera a consciência e não devolver o mOuse a uma gaiola contendo os ratos não-cirúrgico até que ele se recuperou totalmente.
15. Lava-se a seringa de acordo com os passos 3,3-3,6.
16. monitorar No pós-operatório a mobilidade dos ratinhos e verificar se há qualquer sinal de infecção ou doença nos ratos por 5-7 dias.

Figura 1. Injection Aâ na região do ICV (A) agulha da seringa Parafilm envolto em comparação com uma agulha de seringa sem modificações.; (B) PBS gotas para os olhos para evitar a secura; o triângulo formado na testa de rato com o polegar, o dedo indicador, e os dois olhos de rato, bem como a linha média imaginária equidistante de cada olho; (C) dois espelhos (M1 e M2) com múltiplas linhas verticais desenhadas nas superfícies para ajudar perpendicular injeção da agulha da seringa; (D) o triângulo com os pontos de injeção, indicated como estrelas azuis (-1,0 ± 0,06 mm do bregma e 1,8 ± 0,1 milímetros sagital) em cada hemisfério do rato; Seta verde: parafilme, seta vermelha: bregma Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Confirmação de Ap Injection por Y-labirinto e Análises do cérebro

1. Avaliar a memória de trabalho de ratos Ap-injetados por meio de testes Y-maze ^3,7,8
   1. Esperar 3 dias após a injecção para o aparecimento de défices de memória.
   2. Realizar os testes Y-maze usando um labirinto de plástico preto, com três braços idênticos marcados A, B, e C, cada um dos quais se ramifica num ângulo a partir do centro do labirinto 120 ° (largura x comprimento x altura, 10 cm x 40 cm x 12 cm).
   3. Coloque um mouse no braço de partida (braço A) e permitir que o sujeito a explorar livremente o labirinto de 8 min.
   4. Medir o número de entradas em cada braço e calcular o Alterntaxa de ração de cada sujeito ^3,9.
2. examinar diretamente cérebros post-mortem para verificar se a injeção alvo a região do ICV adequadamente.
   1. Anestesiar o rato com o mesmo procedimento como descrito na secção 4.1. Então sacrificar o mouse por deslocamento cervical.
   2. Decapitar o mouse e remover a pele para expor o crânio usando uma tesoura cirúrgica. Remover tecidos e músculos do crânio.
   3. Fazer cortes na sutura lambdóide (entre os ossos parietais e interparietais) sem danificar o cérebro. Remova o occipital e ossos interparietais, em seguida, o parietal e ossos frontais. Remova o osso craniano usando uma pinça e isolar o cérebro do crânio, levantando as meninges.
   4. Lavar o cérebro em solução salina estéril gelada e cortar o ICV região do cérebro no sentido coronal com uma faca cirúrgica (Figura 2).
   5. Confirmar zona de injecção segundo o traçado da inserção da agulha notecido cerebral (Figura 2). Verifique se o traço agulha atingiu um dos ventrículos. Se o traço agulha não atender ou passar através dos ventrículos, excluir dados que do sujeito a partir da análise dos resultados experimentais.

Resultados

Esta seção ilustra exemplos dos resultados que podem ser obtidos pela confirmação da agregação de Ap e avaliação Y-labirinto de déficits de memória. Usando o comprimento total de Ap (1-42) péptido de 42 aminoácidos, mistura de monómeros, oligómeros de Ap, e fibrilas (Figura 3) foi produzido. Através do passo monomerization induzida por HFIP, foram obtidos monómeros relativamente homogéneos (pista B). Após a 7 dias de incubação, diversas tamanhos de agregados Ap (pista C)...

Discussão

O passo mais importante neste protocolo é a injeção ICV de Ap. Este protocolo é projetado para injetar Aâ na região do ICV de camundongos sem instrumentos estereotaxia ^11,12. Antes de iniciar uma experiência, um período preliminar de injeções de prática com um corante azul em vez de Ap deve ocorrer para atingir destreza suficiente. Imediatamente após a injecção, é necessário verificar se a injecção de pigmento foi realizada correctamente. Cuidadosamente retire o cérebro e verificar se a região apropriada foi ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ICR camundongo	Orientbio		macho, 6-8 semanas, 27-29 g de peso corporal
C57BL/6 camundongo	Orientbio		macho, 6-8 semanas, 21-23 g de peso corporal
Beta-amilóide1-42	em síntese interna		concentração estoque: 1 mM/DMSO, concentração injetada: 100 μ Seringa de injeção M / 10% DMSO e 90% PBS
ICV (calibre 26s)	Hamilton	80308
Evans corante azul (EBD)	abcamBIoquímicos	ab120869	1% EBD em PBS
DMSO	Sigma	D2650
PBS	gibco	10010-023
Gradi-GelTM II Gradiente PÁGINA Kit de Análise	ELPiS Biotech	EBS-1056	15% Gel
Kit de coloração de prata Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards	Bio-Rad	161-0377
	GE-Healthcare	17-1150-01
LabDiet	Orientbio	5053