Identificação dos Nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas por Aprimorado Mapeamento Darkfield Microscopy e Hyperspectral

Resumo

A microscopia de campo escuro aprimorada e a imagem imagem hiperespectral com mapeamento espectral permitem a triagem, a localização, e a identificação de materiais do nanoscale em amostras histológicas com velocidade e precisão melhoradas sobre métodos tradicionais. O objetivo deste artigo é fornecer métodos para imagens de campo escuro e mapeamento hiperespectral de nanopartículas de óxido metálico em amostras histológicas.

Resumo

Os nanomateriais são cada vez mais prevalentes em toda a indústria, manufatura e pesquisa biomédica. A necessidade de ferramentas e técnicas que auxiliem na identificação, localização e caracterização de materiais em nanoescala em amostras biológicas está aumentando. Os métodos atualmente disponíveis, como a microscopia eletrônica, tendem a consumir muitos recursos, tornando seu uso proibitivo para grande parte da comunidade de pesquisa. A microscopia de campo escuro aprimorada complementada com um sistema de imagem hiperespectral pode fornecer uma solução para esse gargalo, permitindo a caracterização rápida e menos dispendiosa de nanopartículas em amostras histológicas. Este método permite imagens em nanoescala de alto contraste, bem como a identificação de nanomateriais. Para esta técnica, amostras histológicas de tecido são preparadas como seriam para microscopia de luz. Primeiro, as amostras de controle positivo são analisadas para gerar os espectros de referência que permitirão a detecção de um material de interesse na amostra. Controles negativos sem o material de interesse também são analisados para melhorar a especificidade (reduzir falsos positivos). As amostras podem então ser fotografadas e analisadas usando métodos e software para microscopia hiperespectral ou comparadas com esses espectros de referência, a fim de fornecer mapas da localização dos materiais de interesse em uma amostra. A técnica é particularmente adequada para materiais com espectros de refletância altamente exclusivos, como metais nobres, mas também é aplicável a outros materiais, como óxidos semimetálicos. Essa técnica fornece informações difíceis de adquirir a partir de amostras histológicas sem o uso de técnicas de microscopia eletrônica, que podem fornecer maior sensibilidade e resolução, mas são muito mais intensivas em recursos e demoradas do que a microscopia de luz.

Introdução

Como nanomateriais são cada vez mais usados ​​em uma variedade de indústrias e aplicações, existe uma necessidade de métodos de imagem em nanoescala e caracterização que são mais rápido, acessível e conveniente do que as modalidades tradicionais, como a microscopia eletrônica. Para visualizar as interações de nanopartículas (NP) com as células, tecidos e sistemas vivos, têm sido empregadas muitas técnicas ópticas, incluindo contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia ¹ e abordagens baseadas em campo evanescente, como a Total Internal Reflection (TIR) ​​ou quase microscopia de varrimento de campo óptico (NSOM) ^2,3. No entanto, estas são abordagens analíticas de ponta, fora do alcance da maioria dos laboratórios não especializados ^4. A microscopia electrónica, incluindo microscopia electrónica de transmissão (TEM), também tem sido utilizada para estudar a interacção com células ^5,6,7,8 NP. Alto ângulo anular darkfield (HAADF) digitalização microscopia eletrônica de transmissão tem sido usado para estudar a interação de NPscom vírus ^9. A microscopia confocal é uma outra técnica popular usada para estudar as interações célula-NP ^10.

Nos últimos anos, imagem hiperespectral (HSI) técnicas baseadas em campo escuro foram utilizados como uma ferramenta analítica promissora para estudar NPs de ¹¹ em matrizes biológicas. Sistemas HSI gerar uma representação tridimensional de dados espaciais e espectrais, conhecido como um hipercubo ou datacube ^12. O mapa espacial de variação espectral é usado para identificação do material. Perfis espectrais de materiais conhecidos pode ser gerado e utilizado como bibliotecas de referência para comparação com as amostras desconhecidas. Uma das vantagens principais com sistemas HSI é a sua capacidade de combinar imagiologia com espectroscopia, estabelecendo assim a localização e distribuição de NPs desconhecidos in vivo ou ex vivo, bem como ligando-os a uma outra partícula de referência conhecida, a composição semelhante.

Há várias vantagens deutilização de sistemas de HSI sobre técnicas de imagem convencionais: a preparação da amostra mínima é necessária; preparação da amostra é tipicamente não-destrutiva na natureza; aquisição e análise de imagem é mais rápida; a técnica ^é de 13 rentável; ea distribuição espacial e análise de compostos de composição mista e / ou em matrizes complexas é mais facilmente conseguido ^14.

Para nanomateriais pesquisa envolvendo amostras preciosos, uma das considerações mais importantes é a disponibilidade de um método de imagem não destrutivo, que permite o potencial para examinar amostras repetidamente por um ou mais métodos. Repetida ou múltiplas análises pode ser desejado o desenvolvimento de conjuntos de dados globais, que não estariam disponíveis a partir de um único método. Para este respeito, estudando suas propriedades ópticas é a forma mais segura para analisar a amostra. Usando um microscópio de campo escuro reforçada (EDFM) e HSI sistema para estudar a resposta óptica da amostra - nomeadamente Reflectance, mas também absorvância e transmitância - identificação e caracterização recurso pode ser realizada ^15. Endpoints potenciais caracterização incluirá uma avaliação do tamanho e forma de nanopartículas ou aglomerados e distribuição das nanopartículas dentro de uma amostra relativa.

Neste artigo, descreve métodos de mapeamento especificamente para as nanopartículas de óxido de metal no tecido post-mortem usando um sistema HSI baseado em um algoritmo jogo pixel-espectral referido como um mapeador ângulo espectral (SAM). Nós escolhemos esta aplicação em particular porque ele tem o potencial para complementar atual e futura no domínio da investigação nanotoxicology vivo, em modelos animais são usados ​​para avaliar as implicações para a saúde da exposição a nanomateriais artificiais. A aplicação deste método pode também informar a investigação entrega da droga em nanoescala que utiliza modelos de tecido ou animais. Em particular, a absorção de nanopartículas, distribuição, metabolismo e excreção em todo organs e tecidos poderiam ser investigados com este sistema. Uma grande variedade de aplicações estão sendo investigados para uso em investigação biomédica ^11.

Este método poderia ser utilizado para a avaliação de amostras biológicas diferentes (tais como vários tecidos, tipos de amostras de lavagem bronco-alveolar, e esfregaços de sangue) que tenham sido expostos a nanopartículas de uma variedade de composições elementares ^16-19. Além disso, este método é útil para o estudo de nanopartículas biodistribuição in vivo e in vitro, que é pertinente para os estudos de libertação de fármacos ¹¹ nanoescala. Além amostras biológicas, EDFM e HSI pode ser utilizado para avaliar as nanopartículas em amostras ambientais, tais como esgotos ^20. Avaliação da exposição ocupacional pode ser facilitada pela utilização desta técnica, bem como, uma vez que pode ser utilizado para avaliar a eficácia do equipamento de protecção individual na prevenção da penetração de nanopartículas. Além disso, a pesquisa de team está actualmente a desenvolver um EDFM semelhante e protocolo HSI para a avaliação de amostras de mídia de filtro de nanopartículas coletados a partir de avaliações de exposição ocupacional. Embora a preparação destes diferentes tipos de amostras para EDFM e HSI pode variar, é importante que eles são preparadas de tal forma que eles podem ser facilmente visualizados pelo sistema óptico. Tipicamente, a amostra deve ser preparado como se iria ser visualizado através de microscopia de campo claro tradicional. Existem vários sistemas de imagem hyperspectral comercialmente disponíveis ^11.

Protocolo

Protocolos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use a colaborar instituição dos investigadores, Stony Brook University. A lista de materiais e equipamentos utilizados por este papel específicos podem ser encontrados na Tabela 1.

1. Preparação de amostras de tecidos

1. Prepare tecidos animais expostos a nanopartículas de óxido de metal para coloração imuno-histoquímica ou histológica de acordo com métodos anteriormente descritos ^21-23.

2. Criação de Imagens

1. Inicialização do Microscópio
   NOTA: Para este estudo, um microscópio grau de investigação foi utilizado, equipado com uma fonte de luz de campo escuro de alto desempenho, controlador XY motorizada fase, 14-bit profundidade câmera hyperspectral, e múltiplas lentes objetivas (ar 10X, ar 40X, imersão em óleo de 100X) . O sistema utilizado aqui tem uma resolução espacial de 64 nm, a 100X (imersão em óleo) a ampliação. O condensador utilizado para este pernoy tem tanto Koehler e críticos características de iluminação e foca uma luz altamente colimado em ângulos oblíquos sobre a amostra.
   1. Conecte e ligue a fonte de luz, controlador de fase XY, câmera óptica (para geração de imagens de campo escuro), câmera hyperspectral, eo sistema do computador. Defina a fonte de luz a 75% de energia; elevar o palco para altura máxima; conectar o guia de luz para o condensador de reforço ou de imagem de campo escuro para o colimador na parte de trás do microscópio de campo claro para imagiologia reflectida.
      NOTA: Ao definir a fonte de luz a 75% de energia, não é suficiente iluminação, uniforme de todos os pixels dentro de todo o campo de visão que aumenta pixels mais maçantes permitindo ainda para o contraste entre pixels sem brilho e brilhantes.
   2. Eleve o condensador para a posição de funcionamento. Aplicar 3-5 gotas de óleo de tipo A imersão na lente condensadora cuidadosamente, evitando a formação de quaisquer bolhas. Limpe o óleo e reaplicá-lo, se devem formar bolhas.
   3. Posicione o slide oN o palco. Lentamente levantar o condensador até que o óleo de imersão faz contato com o slide. Este será perceptível através do anel rapidamente brilho da iluminação onde o óleo faz contato com o slide.
2. Coloque a objetiva de 10X no lugar. Concentre-se e alinhar o condensador examinando através das oculares.
   1. Mova o estágio cima e para baixo através do botão de foco objetivo grossa até que o brilho é maximizada.
   2. Mova o condensador concentrar cima e para baixo através do botão de ajuste do condensador até brilho máximo é encontrado. Tentativa de criar o ponto mais brilhante centro possível no campo de visão.
   3. Ajustar os botões alinhamento condensador conforme necessário para centrar o ponto brilhante, se necessário.
   4. Use o botão de foco fino objetivo de trazer o ponto brilhante em foco. Ao mudar os objetivos para obter uma ampliação diferente, reajustar o plano de foco. Quando se utiliza o objectivo 100X, aplicar uma gota de óleo de imersão sobre a lamela para aprimorar the imagem e evitar danos para a lente objectiva.
3. Captura de Imagens
   1. Use controlador de estágio para encontrar uma região de interesse. Esta região irá ser determinado pelas necessidades da experiência. Um indicador típico será alto contraste com as regiões vizinhas, como áreas suffused com nanopartículas de óxido de metal, muitas vezes aparecem mais brilhante do que áreas sem eles.
   2. Traga a região em foco usando o botão multa objetivo foco, ajustando o foco conforme necessário para equilibrar a iluminação condensador. Atingir uma região de alto contraste, bem definida dentro do campo de visão.
   3. Determine o que as imagens (para a câmera óptica) ou datacubes (para a câmera hyperspectral) será capturado, e em que seqüência. Tipicamente, as imagens ópticas são obtidas com uma objectiva 10X ar, objectiva 40X ar, e 100X objectiva de imersão em óleo e uma HSI datacube correspondente com uma objectiva de imersão em óleo de 100X.
      1. Abra o software de imagem óptico. Clique em "Configurações &# 8221; na barra de menu. Selecione o "Botão de Captura de Imagem para o evento de captura". Selecione o formato de imagem armazenada (TIFF foi usada para esta experiência); atribuir um nome de arquivo; procurar e selecionar uma pasta de imagens armazenadas; manter timelapse padrão; clique em "OK".
      2. Selecione as configurações de exposição que criam a imagem de contraste mais alto do menu "Exposure" (para este estudo, um nível de 0,0%, ganho de 3,0 dB, e do obturador de 35 ms foram usados).
      3. Capturar a imagem clicando no botão "Imagem" na barra de menu. Capturar várias imagens de campo escuro de baixa ampliação, além daqueles com alta ampliação, alterando os objectivos do microscópio, a fim de fornecer contexto.
         NOTA: capturar imagens ópticas com a mesma ampliação como quaisquer datacubes que serão capturados com a câmara hiperespectral, uma vez que estas imagens ópticas tendem a ter um maior campo de visão e uma melhor aparência estética mais tarde por inspecção visual. É essencial que qualquer DATACUBEs que serão posteriormente espectralmente analisadas utilização ampliação consistente, como é possível que a mudança do objectivo irá alterar o espectro de transmissão do sistema óptico do microscópio, a alteração do espectro capturado, e reduzindo assim a precisão do mapeador ângulo espectral (SAM). Se um datacube é comparado com outro datacube obtida com um objectivo diferente, a função SAM pode não funcionar.
   4. Selecione o detector de imagem da câmera hyperspectral redirecionando o botão de fonte de luz no microscópio para a câmera hyperspectral. Se a luz é dirigida para a câmera hyperspectral, nenhuma imagem será exibida no software da câmera óptica. Minimize, mas não feche a janela de software de imagem óptico, como se pode precisar dele, conforme especificado no passo 2.4.4.
4. Capturando Datacubes
   1. Abra o software de imagem hiperespectral para aquisição de datacubes HSI. Assegurar o guia de luz é dirigida para a câmara hiperespectral.
   2. Open "HypMicroscópio erspectral "na barra de menu e selecione" Controles HSI microscópio ".
   3. Defina a ampliação da objetiva e do caminho para salvar. Certifique-se de nomear todos os arquivos de imagens e distintamente assim, não ocorre a substituição. Altere a captura área em configurações, ajustando o campo de visão ou o número de linhas (720 linhas para usar este estudo), com uma quantidade significativa de tempo adicional necessário para a captura de áreas maiores. Finalmente, defina o tempo de exposição (0,25 seg para este estudo). Deixar tudo para padrão e clique em "Preview HSI" para visualizar a imagem.
      Nota: O gráfico de intensidade que aparece mostra o datacube HSI que será gravado no eixo horizontal. O eixo vertical representa os comprimentos de onda dos espectros que será capturada na datacube HSI. Colocando o cursor em qualquer posição sobre o gráfico de intensidade correspondente a um comprimento de onda espectral faz com que as intensidades de todos os pontos ao longo da imagem, em que o comprimento de onda, para ser mostrado.
   4. Foco com base nessa visualização, ajustando o foco objetivo multa para aguçar os picos nesta imagem. Se isso é muito difícil, comprimento focal da câmera óptica é bastante semelhante, por isso carregar o software de imagem óptico e deslocar a barra deslizante para a câmara óptica, foco, e depois voltar para o software de imagem hiperespectral e retornar a barra deslizante para a câmera hyperspectral .
   5. Ajuste a intensidade a partir desta visualização, ajustando o brilho fonte, o foco do condensador, ou cancelando a pré-visualização para ajustar o tempo de exposição. Este último dá os melhores resultados, mas aumentou o tempo de exposição pode demorar mais tempo a imagem. O objectivo é que os picos mais significativos para ser suficientemente grande, mas não superior a intensidade máxima para o detector; aqui, o intervalo ideal é entre 1.000 e 16.000 unidades.
   6. Clique em "capturar". O microscópio irá pedir para tirar uma imagem atual escuro. Redirecionar a barra deslizante superior ou abertura (com cuidado, de modo a não perturbar o alinhamentoe foco de qualquer das outras ópticas), e clique em "OK". Restaurar a barra deslizante ou a abertura para a posição correta e clique em "OK" novamente quando o prompt para a imagem aparece. Imagem pode levar até 30 minutos, que os tempos de cerca de 5 min são mais típicas. Tempos de exposição mais longos levam aos tempos de imagem mais longos. Um indicador de progresso está presente. Tenha cuidado para não perturbar fisicamente o alcance que o indicador de progresso seja concluída.
   7. Observe quatro novas janelas com os nomes: "lista de faixas disponíveis", "# 1zoom", "# 1scroll" e "# 1 RGB banda". Maximizar a janela "banda # 1RGB" como este é o datacube para todas as referências futuras.
   8. Clique com o botão direito do datacube e salvá-lo como um TIFF e clique em "OK". Se imaging acabado; pôr de lado todas as amostras; limpar todas as superfícies expostas ao petróleo com 70% isopropanol em água; levantar palco para altura máxima; menor condensador de altura mínima e prima para a posição não-operacional; fecharpara baixo ou desligue a fonte de luz, controlador de fase, e câmeras.

3. Criação de Referência espectrais Bibliotecas

1. Seleção de Referência Spectra
   1. Seleccionar um controlo positivo que é conhecida por conter o material de interesse contido na mesma matriz como as amostras experimentais, desde HSI perfis espectrais são dependentes da matriz.
      1. Para este estudo, o uso de pele porcina injectados com doses elevadas de nanopartículas de óxido de metal como controlos positivos para comparação com o tecido da pele porcina experimental a partir de um estudo de exposição tópica. Os perfis espectrais das nanopartículas de óxido de metal em suspensão foram gerados e examinados e verificou-se que um controlo positivo inadequado para as amostras experimentais histológicas devido às diferentes matrizes.
   2. Obter uma datacube do controlo positivo tal como descrito no passo 2.4., Utilizando a câmara hiperespectral.
      1. Seja particularmente cauteloso quando setting a intensidade, como esta é a métrica primária, através da qual o filtro de partículas interna irá identificar os materiais. Quaisquer intensidades acima do ponto de saturação do detector (aqui, 16.000 unidades) irá resultar em dados inválidos (consulte a etapa 2.4.5.).
   3. Botão direito do mouse na janela de imagem, e à esquerda, clique em "espectro Z-profile". A janela Perfil Spectral pop-up aparece. Clique esquerdo em pixels de juros sobre o datacube, particularmente os mais brilhantes ou aqueles que podem ser identificadas com confiança como representando o material de interesse. Observe a janela Perfil Spectral mostrando o espectro associado. Tome nota particularmente do seu valor menor e maior comprimento de onda e que corresponde a ele.
      1. Quando o levantamento da amostra de controlo positivo, pesquisa clicando as regiões de interesse que são muito claros em relação ao tecido circundante, especialmente aqueles com partículas facilmente identificáveis. Estas partículas são mais susceptíveis de ser o materIALS de interesse, especialmente no caso dos metais.
   4. Use a ferramenta "filtro de partículas" sob o menu "Análise de Partículas" para identificar partículas presentes no datacube. Na nova janela pop-up, observar o "Spectral Max deve ultrapassar". Este será determinado por observações no passo 3.1.3. Defina este valor por isso, é mais elevada do que pixels de fundo, mas mais baixa do que os materiais de interesse. A "Capacidade de validação de dados" é a intensidade máxima (aqui, 16000 unidades).
      1. Deixe os outros parâmetros para o padrão, mas excluir objetos com base no tamanho, ajustando a caixa "Tamanho Threshold". Guardar esses dados tanto neste momento, ou depois de executar a análise. Para esta experiência, use os seguintes parâmetros: Spectral Max deve exceder: 5.000; Valid Dados Max: 16.000; Tamanho Limite (pixels): 400. Uma vez que todos os parâmetros foram definidos, clique em "OK".
   5. Observe o gráfico resultante com os detalhes dapartículas detectadas no limiar de intensidade indicado; estes dados podem ser exportados. Se a característica do comprimento de onda máximo de reflectância do material de interesse é conhecida, seleccionar as partículas que têm um valor semelhante "Max WL"; caso contrário, clique em "selecionar tudo". Em seguida, clique em "Export"; "Para Spectral Library". Escolha um nome de arquivo e clique em "OK".
2. Remover Spectra falso-positivos
   1. Seleccionar uma amostra que vai servir como um controlo negativo. Essa amostra deverá ter sido preparada e tratada da mesma forma que todas as amostras experimentais a ressalva de que a ausência de nanopartículas semelhantes ou idênticas ao material de interesse é garantido.
      NOTA: É importante que a matriz de controlo negativo é o mesmo como a matriz das amostras experimentais, como HSI perfis espectrais são dependentes da matriz. Para este estudo, utilizou-se pele de porcino que não foi exposto a nanomateriais de óxido de metal como negativocontroles.
   2. Varias datacubes do controlo negativo, conforme descrito no passo 2.4.7, utilizando a câmara hiperespectral. Pelo menos uma é necessária, mas pode ser capturado mais para aumentar a selectividade (isto é especialmente importante no caso em que alguns contaminantes podem ser nos espectros de referência).
   3. Use o software de imagem hiperespectral para filtrar a biblioteca espectral coletadas na etapa 3.1 (controle positivo) contra cada datacube capturado na etapa 3.2.2 (controlos negativos) em série, como indicado nas seguintes etapas:
      NOTA: Salve o resultante, biblioteca espectral filtrada para um arquivo separado, e usar como a biblioteca espectral de referência para o material de interesse.
      1. Clique em "Filtrar Spectral Library" no menu de Análise, localizado na barra de ferramentas principal do programa. Clique em "Abrir"; "Novo Arquivo" e selecione a biblioteca espectral criado na etapa 3.1. para o controlo positivo como o arquivo de entrada. Clique em "OK".
      2. Por external fonte, selecione "Imagem" na caixa de dados do Spectral. Mantenha as configurações padrão na caixa os parâmetros de processamento. Escolha um nome de Saída Para Filtered Library (esta deve ser diferente do que o original, ou a biblioteca espectral cru recolhido serão perdidos). Clique em "OK".
      3. Clique em "Abrir"; "Novo Arquivo" e selecione o primeiro datacube captada no passo 3.2.2 para o controlo negativo, quando solicitado a selecionar uma imagem de origem.
         NOTA: O software irá analisar a biblioteca espectral e remover cada espectro que combina com qualquer espectro do datacube controle negativo. Removendo o fundo de os critérios de selecção, assim, reduz potencial de falsos positivos. Um resumo estará disponível quando isso é feito (note que este resumo não é salvo automaticamente).
      4. Se a filtragem adicional é desejada, repita a partir do passo 3.2.3.1, com excepção: 3.2.3.2 etapa, selecione a última biblioteca espectral filtrada criado (resultante após o passo 3.2.3.3 co.mpletes); no passo 3.2.3.3, selecione o próximo datacube do passo 3.2.2.
         NOTA: Corrigindo e normalização para o espectro da lâmpada pode ser necessário se amostras dispersar uma quantidade considerável de luz (por exemplo, os nanotubos de carbono) e / ou se espectros de zero permanecer ao filtrar um controle biblioteca espectral positiva contra um controlo negativo. Estas circunstâncias não surgem para o nosso estudo e por isso esta correção não foi realizada.

4. Análise de Imagem

1. Mapeamento Spectral Angle
   1. Abra o "Spectral Angle Mapper" (SAM) no menu Spectral, métodos de mapeamento submenu, usando o software de imagem hyperspectral uma vez que todos os datacubes experimentais foram adquiridos passo seguinte 2.4. O mapeador de ângulo espectral compara os espectros por geometricamente analisar as alterações em intensidade como uma função do comprimento de onda (ou seja, que compara dois espectros normalizando a sua intensidade e comparando os ângulos recessária para traçar o gráfico de cada espectro) ^24.
   2. Com o datacube aberta, selecione o nome do datacube experimental na janela pop-up e clique em "OK". Se nenhum nome de arquivo são listados, clique em "Abrir"; "Novo arquivo", escolher o datacube experimental, em seguida, clique em "OK".
      1. Observar uma nova janela pop-up chamado Endmember Coleção: SAM. Clique em "Importar" na barra de menu e selecione "a partir do arquivo da biblioteca espectral". Uma janela pop-up chamado Biblioteca Input File Spectral aparecerá. Abra a biblioteca espectral de referência que foi criado no passo 3.2.3. e clique em "OK". Observar uma nova janela pop-up chamado "Input Spectral Library".
      2. Clique em "Selecionar todos os itens"; clique em "OK" clique direito sobre "Cor" e selecione "Aplicar as cores padrão para todos." Clique em "Selecionar tudo", seguido por "Aplicar" e, em seguida, escolher o nome de um arquivo de saídad Clique em "OK". O Spectral Angle Mapper irá demorar alguns segundos para analisar e guardar os dados.
   3. Abra o datacube no software de imagem hiperespectral. Selecione "Classificação" no menu Overlay da janela da imagem, em seguida, navegue até o nome do arquivo e clique em "OK". O usuário agora pode sobrepor qualquer espectro da biblioteca para ver onde eles são mapeados para na imagem.
   4. Selecione a opção "Mesclar Classes" no menu de opções no "ferramenta de classe Interactive" aberto através do menu Overlay na janela de imagem, se um esquema de cores unificado é desejada, tal como para facilitar a análise por outro software (como descrito no passo 4.2 .).
   5. Destaque todas as classificações de combinar (normalmente, tudo, exceto "não classificado" nas "classes de fundir em base" lista), e selecionar um único espectro da lista "classe base", clique em "OK". Essa cor será agora represent todos os espectros seleccionado.
   6. Clique na cor selecionada e todos os espectros correspondentes serão mostrados nessa cor.
   7. Para obter uma imagem dichromatic que irá mostrar o espectro de correspondência sobre um fundo preto, cIick na caixa de cores "não classificados" o, que é preto por padrão. Observar uma imagem dichromatic. Este passo pode ser revertida clicando novamente na caixa de cores "não classificados" o.
   8. Clique direito para salvar a imagem como TIFF, incluindo eventuais sobreposições ativo atualmente.
      NOTA: Para o processamento de imagem futuro, uma imagem dicromático vai ser utilizado.
   9. Selecione "Classe de Distribuição" no menu Option na janela "interativa ferramenta Class" para adquirir as estatísticas de mapeamento. Estes dados representam o número de pixels foram unmapped (não classificada) e quantos foram identificados como o material de interesse. Note-se que o número de pixels não corresponde com o número de partículas mapeados. Esta informação não é automaticamente recorded.
2. Análise de Partículas em Hyperspectral mapeada Imagens
   1. Abra as imagens no software NIH ImageJ.
   2. Utilize o menu Imagem, Ajuste submenu, função "Threshold". Selecione os parâmetros que diferenciam partículas de interesse de todos os outros materiais. Utilize os seguintes parâmetros de limite para este estudo: método limite padrão, cor vermelha, espaço de cor HSB, verificado escuro caixa fundo, caixas de passagem marcada para matiz, saturação e brilho.
      NOTA: Isto pode variar significativamente de caso para caso. Ao analisar um datacube mapeada, isto pode ser simplificado, unificando todas as classes relevantes para uma única cor e sobreposição de cores com que todas as cores não classificada antes de gerar a imagem (passos 4.1.4 a 4.1.8).
   3. Utilize o menu Analisar, "Analisar partículas" função, que irá recuperar as informações para a área, a média, valores mínimos e máximos. Para este estudo, use os parâmetros aqui: tamanho 0-infinito, circularidade0-1, mostra nada, verificado caixa resultados de exibição.
   4. Para a análise estatística, exportar esses dados para outro programa de software que permite a comparação estatística com o número e tamanho das partículas localizadas em amostras de controlo semelhantes. Sugerimos o uso de uma planilha para análise de dados ImageJ. Os dados exibidos na tabela de resultados após o passo 4.2.4 devem ser copiados para uma folha de cálculo. A função MAX pode ser utilizada na primeira coluna (sem título) para determinar o número de partículas, enquanto que a função normal pode ser usado na coluna de área, para determinar o tamanho médio de uma partícula. No futuro, a validação experimental será prosseguido para investigar esta função em determinar o tamanho médio contra um padrão estabelecido para o dimensionamento (eg, TEM).

Resultados

Microscopia Hyperspectral é útil para a sua capacidade para identificar os materiais de uma maneira semelhante à espectrofotometria. Como indicado na Figura 1, cada material tem vários espectros característicos e uma forma geral da sua reflectância, que é único. Além disso, a Figura 1 ilustra a natureza dependente da matriz dos perfis espectrais: os perfis espectrais para cada um dos três óxidos metálicos em amostras de tecidos histológicos (painel superior) são diferentes dos perfis espectrais para cada um dos três óxidos metálicos em suspensão aquosa ( painel inferior). Ao mapear os perfis espectrais característicos para amostras desconhecidas na mesma matriz, a técnica é útil para determinar a presença ou ausência de um material, e pode também semi-quantitativamente comparar quantidades relativas de materiais em amostras.

As bibliotecas de referência espectrais criados a partir de amostras de pele de controlo positivo são apropriados para mapeamento para experimentalamostras de pele. Como pode ser visto na Figura 2, as bibliotecas espectrais de referência bem mapeada para os controlos positivos correspondentes e não são mapeadas para os controlos negativos correspondentes.

A vantagem mais significativa da técnica é a sua capacidade para detectar baixos níveis de materiais de interesse em amostras, bem como a diferenciá-los dos contaminantes. . Por exemplo, os nanotubos individuais pode ser observada nos pulmões durante a inalação de doses tão baixas como 40 ug num 20-30 g de rato ^{de 25} A Figura 3 demonstra presente em amostras de pele histológicos: enquanto algumas partículas são prontamente evidente na imagem óptica de campo escuro (coluna 2), outros são detectados usando imagens hiperespectrais (coluna 3) que poderiam ter sido perdidas usando microscopia de campo claro (coluna 1) ou outros métodos. O uso de darkfield HSI também serve para melhorar a especificidade sobre microscopia de campo claro simples. Estas imagens podem então ser sujeitas a formas mais quantitativos de análise, nanálise de partículas otably via ImageJ.

A microscopia de campo escuro reforçada tem várias aplicações diferentes, mesmo na ausência de imagem hiperespectral. O primeiro é a sua capacidade para gerar alta qualidade, imagens de alto contraste. Isto é melhor demonstrado na Figura 3, no qual as partículas de interesse são facilmente identificáveis, em comparação com os seus homólogos de campo claro. Estas imagens podem também ser objecto de análise quantitativa de partículas, embora na ausência de mapeamento hyperspectral, cautela é necessária para evitar confundir uma partícula contaminante de uma partícula de interesse.

Figura 1. Referência bibliotecas espectrais (matriz de tecido) em comparação com bibliotecas espectrais (nanopartículas em suspensão). Esta figura demonstra a importância de gerar uma biblioteca de referência espectral de nanomaterials de interesse na mesma matriz como amostras experimentais. A primeira linha mostra a biblioteca espectral de referência (RSL) para cada material neste estudo (alumina, sílica e óxido de cério). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este RSL foi criado pelo método descrito neste protocolo, onde amostras de tecido de controlo positivo foram filtrados contra amostras de tecido de controlo negativo. A segunda linha mostra bibliotecas espectrais (SL) criadas a partir das nanopartículas de interesse na suspensão líquida sobre uma lâmina de vidro. Para alumina, uma pico bimodal em comprimentos de onda de 500 e 650 foi encontrado no LSR, ao passo que um pico mais curvo e menos distinta foi observada em suspensão a alumina NP SL em cerca de 600. Para sílica, um pico a um comprimento de onda de cerca de 650 foi presente no LSR, ao passo que um pico mais curvo e menos distinta foi observada na suspensão de sílica em NP SL arouND 600. Para céria, um pico bimodal foi encontrada em comprimentos de onda de 520 e 620 no LSR, ao passo que um pico menos distinta foi observada na céria NP SL suspensão em cerca de 560. Isto sugere que a matriz na qual estão incorporados os PN cria uma mudança de espectros que podem ser consideráveis ​​quando seleccionar os controlos para criar o SL como para a experiência específica.

Figura 2. Referência bibliotecas espectrais (matriz de tecido) mapeado no controle positivo e controle negativo o tecido da pele porcina. Este valor serve como uma confirmação da ENO conforme apropriado para mapeamento para amostras experimentais, em que cada RSL (coluna da esquerda) bem mapeado no seu correspondente controlo positivo (coluna do meio) e não mapeia no seu correspondente controlo negativo (coluna da direita). Por favor clique here para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Hyperspectral mapeamento de tecido porcino experimental pele exposta a nanopartículas de óxido de metal. Fileiras de cima para baixo correspondem a diferentes camadas da pele, de superficial a camada mais profunda: epiderme, derme e tecido subcutâneo, respectivamente. A primeira linha mostra o estrato córneo da epiderme, a partir de uma amostra de pele que foi exposta à NPs de alumina em suspensão; a segunda linha foi expostos à sílica NPs em suspensão; a terceira fileira de Ceria NPs em suspensão. Cada coluna representa a mesma área da pele trabalhada com técnicas diferentes. A primeira coluna corresponde à microscopia de campo claro (40X mag .; barra de escala = 50 mm), onde a área inscrita num quadrado vermelho foi ampliado (100X mag; barra de escala = 10 mm) com a microscopia de campo escuro reforçada (EDFM) na segunda coluna, onde setas brancas estão apontando para o alto contraste NPS. A terceira coluna foi obtida com uma câmera hyperspectral (HSI), mostrando as mesmas NPs alto contraste (setas brancas). EDFM e HSI imagens foram tiradas com uma ampliação de 100X; barra de escala = 10 mm. A quarta coluna mostra a imagem HSI mapeado contra o respectivo RSL para cada grupo de exposição, onde NPs de alumina são mostrados em verde, o NPS de sílica em vermelho, e céria NPs em amarelo, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Para amostras de tecido que foram submetidos a coloração histológica convencional, a identificação e análise de nanopartículas de óxido de metal pode ser conseguida através de uma combinação de EDFM, mapeamento HSI, e técnicas de análise de imagem. Embora haja flexibilidade na preparação de amostras para histologia ou imuno-histoquímica (por exemplo, usando tecidos fixados ou congelados; tipo de mancha), é importante que as amostras são seccionados a uma espessura de 5-10 mm para melhor visualização. As amostras usadas aqui foram fixados em formalina e antes de seccionamento com um micrótomo rotativo a 6 mm de espessura embebido em parafina, montadas em lâminas de vidro para microscópio, coradas com hematoxilina e eosina e lamínulas. Tecidos da pele de suíno de um ex vivo colaboração penetração cutânea toxicologia foram usadas para este estudo. Os tecidos foram expostos a nanopartículas de óxido de metal (alumina, sílica, céria) em suspensões aquosas. Detecção da região (s) de interesse (eleme alto contrastents) com EDFM é um primeiro passo crítico que facilita a posterior mapeamento e análise HSI. Amostras de controlo positivas e negativas devem ser visualizados e analisados ​​em primeiro lugar, a fim de criar uma biblioteca espectral para referência. Os espectros coletados a partir do controlo positivo são exportados para uma biblioteca espectral controlo positivo. Em seguida, todos os espectros a partir das imagens de controlo negativo são subtraídos da biblioteca espectral do controlo positivo, a fim de melhorar a especificidade (reduzir os falsos positivos). A biblioteca espectral filtrado resultante é considerado o RSL que serve para a análise dos materiais de interesse. Todas as amostras de tecido são submetidos ao mesmo processo de imagem e são mapeados contra o LSR. A imagem resultante irá conter apenas áreas com elementos de interesse sobre um fundo preto. Esta imagem pode então ser analisado utilizando o ImageJ com as suas funções de limiar e de análise de partículas para se obter a área de partículas mapeados por campo de visão. Os dados numéricos obtidos a partir ImageJ pode ser exportaçãoed para uma planilha para análise posterior.

É importante considerar que, como amostras biológicas são inerentemente diferentes um do outro, e métodos de coloração pode afetar a visualização através EDFM e HSI, as configurações de exposição deve ser determinado de acordo com o que produz a melhor imagem de alto contraste para um tipo específico de amostra. Embora a redução de falsos positivos pode ser conseguido através da filtragem de bibliotecas espectrais, é crucial para se obter controlos negativos fiáveis ​​que têm evitado a contaminação com o elemento de interesse, como o espectro correspondente a esta contaminação poderia potencialmente ser filtrados a partir da biblioteca espectral do controlo positivo , aumentando as taxas de falsos negativos. Além disso, a faixa de intensidade espectro que é detectável com o software de imagem hyperspectral não pode ultrapassar o limite do software particular (para este estudo, ou seja, 16.000 unidades): áreas com um elevado número de partículas acumuladas que produzem spintensidades ectral acima do limite de intensidade são deixados de fora da biblioteca espectral, devido ao risco de aumentar o número de falsos negativos.

Enquanto o sistema HSI confere muitas vantagens em relação aos métodos tradicionais, existem algumas desvantagens e limitações a considerar. Uma delas é que a grande quantidade de dados ópticos recebidos podem exigir poder de computação substancial. Outra é que HSI pode ser demorada, principalmente nos estágios iniciais, quando as bibliotecas de espectros de referência estão sendo criados. Além disso, o tempo de imagem pode levar vários minutos por captura de imagem, tornando-o mais lento do que simples imagem de campo escuro; No entanto, é ainda mais rápido do que a execução preparação das amostras e visualização por microscopia electrónica. Além disso, sistemas complexos pode resultar em vários espectros característicos, que exigem o desenvolvimento de controles altamente especializados e fazer o estabelecimento de, bibliotecas de referência universais padronizados difíceis ^26. Finalmente, a tecnologianique resultados em resolução mais baixa do que as técnicas probe- ou elétron-microscopia, tais como microscopia de força atômica ou microscopia eletrônica de transmissão, que podem resolver átomos individuais. A resolução dessa técnica é limitada devido à sua natureza fotônico, que a impede de ser uma ferramenta de alta precisão para medir tamanhos de partículas no nível nanométrico ou para localizar precisamente materiais a um nível sub-micron. Enquanto que a técnica pode ser capaz de identificar partículas dentro de determinados compartimentos de tecidos ou organelas celulares superiores a 1 uM (tais como núcleos de células), ou organelos pequenos recursos são difíceis de visualizar com precisão com este método. Também digno de nota, dada a sua resolução espacial, este método não pode diferenciar entre as nanopartículas individuais e aglomerados ^11.

Outras considerações incluem: certos materiais (como metais nobres) têm muito mais elevada reflectância e perfis espectrais distintas, o que pode torná-los mais fáceis de Analyze e mapa espectral com esta ferramenta. Outros, tais como os óxidos metálicos semi-investigados neste estudo e nanomateriais à base de carbono ^{24, 27,} pode ser mais difícil, devido à sua composição elementar, forma, e de acordo com a matriz. Em dois estudos de inalação de murino por Mercer et ai., Um sistema similar ao empregue no presente estudo foi utilizada a fim de localizar os nanotubos de carbono no pulmão e nos órgãos secundários com base na sua extraordinariamente elevado contraste com os tecidos circundantes. No entanto, o mapeamento hiperespectral não foi demonstrada em qualquer um dos estudos, provavelmente porque a forma única de fibras de carbono foi suficiente para uma característica de identificação. Outra consideração refere-se especificamente aos tecidos: desde depositando nanopartículas de interesse para órgãos específicos através de processos biofísicos normais é imprevisível (e muitas vezes ele próprio objecto de estudo), determinação de um controlo positivo aplicável pode ser difícil e requer a consideração de como a geração do controle mIGHT afetar o estado de um material de interesse. Por exemplo, se uma biblioteca espectral é criado a partir de nanopartículas cristalinas de interesse, pode ser difícil para mapear a biblioteca para as mesmas nanopartículas em tecidos ou células, devido a alterações nos espectros resultantes da alteração da partícula (por exemplo, devido a alterações nas pH, dissolução, aglomeração, a ligação às proteínas) e do microambiente global ou matriz. Finalmente, a técnica está limitada na sua natureza semi-quantitativa: ela só pode ser tão quantitativa como outras técnicas de microscopia bidimensional de resolução semelhante, o que significa que não pode ser facilmente usado para executar tarefas, tais como caracterização de carga órgão total de um material.

No geral, EDFM e HSI fornecer várias vantagens em relação às técnicas convencionais de imagem e caracterização de nanomateriais, como TEM, HAADF e DIC. EDFM / HSI permite a aquisição de imagens mais rápido e análise, o que economiza tempo e custo em comparação com mais conven intensivatécnicas adicionais. Além disso, a preparação da amostra para EDFM / HSI é tipicamente tanto mínima e não destrutiva, o que poupa tempo e também permite uma análise mais flexível de uma dada amostra, uma vez que pode, em seguida, ser utilizados para outras técnicas. Além disso, a HSI é versátil, permitindo a análise de materiais em nano-escala e de muitas composições numa grande variedade de matrizes. A equipe de pesquisa está trabalhando para aperfeiçoar o método descrito aqui para outros materiais e tipos de amostras, incluindo uma avaliação aprofundada da especificidade da tecnologia. A próxima etapa crítica sob investigação pela equipa de investigação é a validação dessas técnicas em relação aos padrões tradicionais de ouro (por exemplo, Raman, TEM, SEM) para os materiais e tipos de tecido de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Unidade CytoViva 150 (condensador)	CytoViva (Auburn, AL)		montado no microscópio Olympus BX43
Microscópio Olympus BX43 - Slot do Analisador - HSI com objetivas de ar de 10x e 40x e objetiva de imersão em óleo de 100X	obtida através do CytoViva (Auburn, AL)		para uso com o condensador da unidade CytoViva 150
Câmera digital Firewire Dagexcel-M - Refrigerada; inclui o software	Exponent 7obtido através da câmera de campo escuro aprimorada CytoViva (Auburn, AL)		e do software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; inclui câmera hiperespectral Pixelfly, controlador de estágio XY, software de imagem hiperespectral ENVI	câmera hiperespectral	CytoViva (Auburn, AL)
lâminas de microscópio de vidro limpas para sala limpa (lâminas de vidro B)	Schott NEXTERION	1025087	detritos e artefatos reduzidos em comparação com lâminas de microscópio de vidro convencionais para imagens ideais
limpeza de lamínulas de microscópio de vidro limpas (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	redução personalizada	detritos e artefatos em comparação com lamínulas de vidro convencionais para imagem ótima
tipo A microscopia óleo de imersão	Fisher Scientific	12368B	fornecedores múltiplos
70% isopropanol em água			vários fornecedores
Software ImageJ	Institutes of Health (NIH)		software de código aberto gratuito download on-line
de nanopartículas de óxido metálico	fornecidas à equipe de pesquisa por parceiros		nanopartículas de alumina, sílica e céria em suspensões aquosas. Devido a um Acordo de Confidencialidade entre os autores e parceiros da indústria, mais informações sobre o produto não podem ser divulgadas.