A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Resumo

As proteínas do envelope nuclear desempenham um papel central em muitos processos biológicos básicos e têm sido implicadas em uma variedade de doenças humanas. Este protocolo descreve um novo modelo de camundongo baseado em Cre / Lox que permite o controle espaço-temporal da ruptura dos complexos LINC.

Resumo

A migração nuclear e a ancoragem em tecidos em desenvolvimento e adultos dependem fortemente de grandes conjuntos de proteínas macromoleculares chamados LInkers do Nucleoesqueleto e Citoesqueleto (complexos LINC). Esses andaimes de proteínas abrangem o envelope nuclear e conectam o interior do núcleo aos componentes do citoesqueleto citoplasmático circundante. Os complexos LINC consistem em duas famílias de proteínas evolutivamente conservadas, proteínas Sun e Nesprins que abrigam motivos de assinatura molecular C-terminal chamados domínios SUN e KASH, respectivamente. As proteínas Sun são proteínas transmembranares da membrana nuclear interna cujo domínio nucleoplásmico N-terminal interage com a lâmina nuclear, enquanto seus domínios SUN C-terminal se projetam para o espaço perinuclear e interagem com o domínio KASH de Nesprins. As isoformas canônicas de Nesprin têm um terminal N de tamanho variável que se projeta no citoplasma e interage com os componentes do citoesqueleto. Este protocolo descreve a validação de uma estratégia de camundongo transgênico dominante-negativo que interrompe as interações endógenas SUN / KASH de maneira específica do tipo de célula. Nossa abordagem é baseada no sistema Cre / Lox que ignora muitas desvantagens, como letalidade perinatal e fenótipos não autônomos de células que estão associados a modelos germinativos de inativação do complexo LINC. Por esse motivo, este modelo fornece uma ferramenta útil para entender o papel dos complexos LINC durante o desenvolvimento e a homeostase em uma ampla gama de tecidos.

Introdução

O envelope nuclear (NE) separa o nucleoplasma do citoplasma. É composto por uma membrana nuclear interna e externa (INM e ONM, respectivamente) que se ligam em poros nucleares. O lúmen delimitada pelas duas membranas é chamada o espaço perinuclear (SNP). A ONM é uma extensão do retículo endoplasmático rugoso (ER), eo INM adere à lâmina nuclear, uma malha de nuclear-V Tipo de filamentos intermediários representados por A e do tipo B lamins ^1,2. Ligantes do Nucleoskeleton e do citoesqueleto (LINC) são complexos macromoleculares conjuntos que abrangem todo o envelope nuclear para ligar fisicamente o interior do núcleo de filamentos do citoesqueleto e motores ....

Protocolo

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Washington em St. Louis.

1. Rato Reprodução e Genotipagem

1. Raça ratos com Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratos para produzir Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Nota: Embora o restante deste protocolo centra-se na utilização da linha de Tg (PCP2-Cre) do rato para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje no cerebelo, um procedimento semelhante pode ser seguido com qualquer outra Tg (CRE) de ratinho ( A Figura 2A).

Resultados

Este protocolo ilustra a utilidade do (EGFP-KASH2 / CAG-LacZ) modelo de ratinho Tg para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje do cerebelo usando Tg (PCP2-CRE) ratinhos. Em Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, a grelha de leitura aberta de LacZ / V5 é excisado em P6 pela recombinase Cre conduzindo assim à expressão de EGFP-KASH2 especificamente direccionada para células de Purkinje (Figura 2A). Como esperado, EGFP-KASH2 é voltado para o envelope nuclear, tal como indicado .......

Discussão

O passo mais importante para estudar o papel com sucesso de complexos LINC in vivo utilizando o modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) é identificar uma linha de murganho adequados Cre (s). Com efeito, se Cre está activo em outros tipos de células-envolvidas em vias semelhantes, que podem complicar a interpretação dos resultados. Por isso, é importante examinar as células vizinhas, como mostrado nas camadas celulares e moleculares granulares do cerebelo (Figura 2B). Do mesmo modo, para maximizar .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sacarose	Sigma	Aldrich S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Solução de Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Slides	de Adesão StatLab	M1000W
Soro de Burro	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anticorpo Anti-Calbindina	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Abcam		ab13970
Anti-Nesprin2 Anticorpo			Anteriormente descrito na Ref. 21
Montagem Fluorescente Mídia	Dako	S3023
2-metil butano	Sigma Aldrich	O3551