A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Summary

As proteínas do envelope nuclear desempenham um papel central em muitos processos biológicos básicos e têm sido implicadas em uma variedade de doenças humanas. Este protocolo descreve um novo modelo de camundongo baseado em Cre / Lox que permite o controle espaço-temporal da ruptura dos complexos LINC.

Abstract

A migração nuclear e a ancoragem em tecidos em desenvolvimento e adultos dependem fortemente de grandes conjuntos de proteínas macromoleculares chamados LInkers do Nucleoesqueleto e Citoesqueleto (complexos LINC). Esses andaimes de proteínas abrangem o envelope nuclear e conectam o interior do núcleo aos componentes do citoesqueleto citoplasmático circundante. Os complexos LINC consistem em duas famílias de proteínas evolutivamente conservadas, proteínas Sun e Nesprins que abrigam motivos de assinatura molecular C-terminal chamados domínios SUN e KASH, respectivamente. As proteínas Sun são proteínas transmembranares da membrana nuclear interna cujo domínio nucleoplásmico N-terminal interage com a lâmina nuclear, enquanto seus domínios SUN C-terminal se projetam para o espaço perinuclear e interagem com o domínio KASH de Nesprins. As isoformas canônicas de Nesprin têm um terminal N de tamanho variável que se projeta no citoplasma e interage com os componentes do citoesqueleto. Este protocolo descreve a validação de uma estratégia de camundongo transgênico dominante-negativo que interrompe as interações endógenas SUN / KASH de maneira específica do tipo de célula. Nossa abordagem é baseada no sistema Cre / Lox que ignora muitas desvantagens, como letalidade perinatal e fenótipos não autônomos de células que estão associados a modelos germinativos de inativação do complexo LINC. Por esse motivo, este modelo fornece uma ferramenta útil para entender o papel dos complexos LINC durante o desenvolvimento e a homeostase em uma ampla gama de tecidos.

Introduction

O envelope nuclear (NE) separa o nucleoplasma do citoplasma. É composto por uma membrana nuclear interna e externa (INM e ONM, respectivamente) que se ligam em poros nucleares. O lúmen delimitada pelas duas membranas é chamada o espaço perinuclear (SNP). A ONM é uma extensão do retículo endoplasmático rugoso (ER), eo INM adere à lâmina nuclear, uma malha de nuclear-V Tipo de filamentos intermediários representados por A e do tipo B lamins ^1,2. Ligantes do Nucleoskeleton e do citoesqueleto (LINC) são complexos macromoleculares conjuntos que abrangem todo o envelope nuclear para ligar fisicamente o interior do núcleo de filamentos do citoesqueleto e motores moleculares (Figura 1A). Eles consistem de interações entre motivos evolutivamente conservadas que caracterizam duas famílias de proteínas transmembrana integrantes do NE: Sun (Sad1 / Unc84) proteínas e Nesprins (SPectRINS Envelope Nuclear). Nos mamíferos, Sun1 e Sun2 arproteínas transmembranares e do INM nucleoplásmica cuja região N-terminal interage directamente com A e do tipo B laminas ^3-5. Por outro lado do INM, dentro do SNP, proteínas Sun Harbor um estiramento evolutiva-conservada de ~ 150 aminoácidos C-terminais do domínio chamado sol. SUN domínios interagir diretamente com o evolucionário conservado KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologia) de domínio, a assinatura molecular de Nesprins. Kash domínios consistem de um troço de ~ 30 aminoácidos C-terminais que se projeta para o SNP seguido por um domínio transmembranar ^6. Pelo menos quatro genes distintos (Nesprin1-4 Nesprin) codificam proteínas contendo KASH que localizam no NE ^7. As regiões citoplasmáticos de Nesprins, cujos tamanhos variam de ~ 50 kDa (Nesprin4) para uma surpreendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contêm spectrin múltiplas repetições, bem como os motivos específicos permitindo a sua interação com os componentes do citoesqueleto de actina, tais como, plectina e motores moleculares ^{8- 13.}

Estudos em vertebrados e invertebrados mostraram que Lamin / Sun / Nesprin / motores moleculares constituem um "eixo" evolutivamente conservada controlar a migração e ancoragem nuclear. Vários knock-out (KO) modelos do rato do LINC componentes complexos têm sido descritos e eram instrumentais em fornecer um quadro para entender os papéis de proteínas Sun e Nesprin no NE durante o desenvolvimento dos mamíferos ^9,14,15. No entanto, estes modelos apresentam várias desvantagens significativas, principalmente: 1) dificuldade em interpretar fenótipos devido à célula efeitos não-autónomos, 2) dificuldade em distinguir as contribuições fenotípicas de KASH contendo vs. KASH-less Nesprin isoformas ^16, 3) a redundância funcional de proteínas Sun e Nesprin no NE em numerosos tipos de células requer esquemas de melhoramento complexas para inativar todas as interacções SUN-Kash em camundongos ^{17 e} 4) a letalidade perinatal de camundongos deficientes para a KASH-domínio de ambosNesprins1 e 2 opõe-se à análise de fenótipos adulto ^18.

Este protocolo descreve um novo modelo de ratinho concebido para romper todas as interacções SOL-Kash in vivo, numa célula de forma autónoma e regulada pelo desenvolvimento, ignorando assim muitas das desvantagens descritas acima. Este modelo de ratinho Cre / à base de LOX assenta em dois conceitos importantes: 1) o domínio KASH de qualquer proteína Nesprin conhecida é suficiente para atingir EGFP ao NE em sistemas de cultura de células e 2) domínios SUN interagir promiscuamente com domínios Kash, portanto, sobre-expressão de qualquer domínio KASH vai saturar todos os domínios SUN endógenos e inactivam os complexos LINC de uma forma dominante negativa ¹⁷ (Figura 1B). Este protocolo descreve a colheita de tecidos e etapas de processamento usados ​​para confirmar a interrupção de todas as interações SUN-Kash em células de Purkinje do cerebelo.

Protocol

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Washington em St. Louis.

1. Rato Reprodução e Genotipagem

1. Raça ratos com Tg Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) (PCP2-Cre) ratos para produzir Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Nota: Embora o restante deste protocolo centra-se na utilização da linha de Tg (PCP2-Cre) do rato para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje no cerebelo, um procedimento semelhante pode ser seguido com qualquer outra Tg (CRE) de ratinho ( A Figura 2A).
2. Realizar genotipagem para identificar filhotes abrigando ambos os transgenes EGFP e Cre como descrito anteriormente ^19.

2. Preparação de Materiais para Dissecção e Tissue Colecção

1. Preparação de 100 ml de 30% de sacarose em PBS (30 g de sacarose / 100 ml de PBS 1x) e armazenar a -20 ° C. O dia de tecido harvesting, degelo e de carga ~ 30-35 ml da solução de sacarose em uma seringa de 35 ml para perfusões transcardial.
2. Preparar 40 ml de 4% de PFA em PBS (10 mL 16% de paraformaldeído e 30 ml de PBS). Carga ~ 30-35 ml de 4% de PFA em uma seringa de 35 ml para perfusões transcardial.
3. Encha uma placa de cultura de tecido de 10 cm com 10 ml de PBS por dissecção de tecidos.
4. Preparar um cocktail de cetamina / xilazina que consiste em 16 mg / ml de cetamina e 3 mg / ml de xilazina.
5. Prepara-se uma solução de etanol a 70% para a dissecação.

3. Dissecção e Recolha de Tecidos

1. Usando uma seringa de 1 ml, injectar 500 ul do cocktail de cetamina / xilazina por 25 gramas de peso corporal e esperar para ~ 15 min. Em alternativa, utilizar um outro método de sedação institucional aprovado que é apropriado para o sistema biológico de interesse.
2. Após sedação, aperte suavemente a pata traseira para confirmar a falta de resposta à dor, o pino todas as patas em uma bandeja de isopor com o lado dorsal dorato virado para baixo.
3. Pulverizar o abdômen com 70% de etanol e fazer uma incisão de abdômen inferior para a parte superior da caixa torácica para ter acesso ao coração.
4. Fazer uma pequena incisão no átrio direito do coração e inserir a seringa contendo a solução de sacarose a 30% para o ventrículo esquerdo do coração.
5. Perfundir a solução a uma taxa de ~ 2-5 ml por min. Quando vazio, remover a seringa e repita com a solução PFA 4%.
6. Desafixar o rato da bandeja de isopor e decapitar para acessar o cérebro.
7. Retire a pele ao redor da cabeça do animal usando uma pinça e tesouras. Fazer um buraco na parte posterior do crânio com uma agulha e remova cuidadosamente o crânio com tesouras e pinças de dissecação.
8. Uma vez que o cérebro é claramente acessíveis, utilizar uma pinça para remover o cerebelo e colocá-lo em PBS. Dividir o cerebelo no plano sagital com um bisturi e transferir para a solução de sacarose a 30% durante a noite a 4 ° C. Nota: Para prepararsão secções de parafina, fixar o cerebelo durante a noite a 4 ° C em 4% de PFA antes da incorporação do tecido e de corte.

4. Tissue Processing e Seccionamento

1. Prepara-se uma suspensão de gelo seco e 2-metilbutano. Permitir que a temperatura do banho a equilibrar durante 5 min.
2. Encher um composto com cryomold PTU e colocar uma metade do cerebelo bissectado no molde.
3. Usando um microscópio de dissecção e um par de fórceps posição do cerebelo, de modo que a superfície bissectado (perto da linha média do cerebelo) é voltada para cima.
4. Transferir a cryomold para a pasta de gelo seco durante 5 minutos até que o composto de outubro formou uma matriz sólida em torno das branco espécime de tecido. Nota: Os espécimes congelados podem agora ser armazenados a -20 ° C se necessário.
5. Etiqueta pré-tratados lâminas poli-lisina para a recolha de tecidos e secções do crióstato preparar de acordo com as instruções do fabricante, a fim de recolher 15 um secções do Cerebellum. Para coletar as seções, entre em contato com cuidado a seção de outubro com o lado revestido a poli-lisina do slide. Para preservar a orientação da secção, não rodam a lâmina durante este passo.
6. Cortes de tecido loja C a -20 ° até prosseguir com coloração e tratamento de imagens.

5. Coloração e imagem das Cerebelo Secções

1. Prepare as seguintes soluções antes da coloração de tecidos:
   ~ 50 ml de PBS
   ~ 5-10 ml de 4% de PFA em PBS
   ~ 10-20 ml de 0,5% de Triton X-100, 10% de soro de burro em PBS
2. Seções cerebelar descongelar. Importante, minimizar sua exposição a qualquer fonte de luz contínua e intensa para evitar o desbotamento de EGFP.
3. Usando uma caneta barreira hidrofóbica, desenhe um retângulo em torno das secções de tecido.
4. Post-fixar as seções com PFA 4% para 5 min. Use líquido suficiente para cobrir toda a área delineada pela barreira hidrofóbica (usualmente ~ 500 mL). Usando um aspirador ou pipeta, remover o fixador ser particularmente cuidadosos para não perturbar as secções de tecido.
5. Com uma pipeta, aplicar suavemente PBS na lâmina sem perturbar as secções de tecido. Após 5 min usar o vácuo ou pipeta para remover cuidadosamente o líquido. Repetir a lavagem de PBS um total de três vezes.
6. Usando uma pipeta, aplicam-se cuidadosamente uma diluição adequada de anticorpos primários (3 ul Calbindina e / ou anticorpo Nesprin2 por 900 ul de solução) em 0,5% de Triton X-100, 10% de soro de burro em PBS. Incuba-se durante uma hora à temperatura ambiente no escuro.
   Nota: EGFP-KASH2 será visível por microscopia de fluorescência directa em secções congeladas, e não é necessário utilizar um anticorpo anti-EGFP. No entanto, se secções de parafina foram preparadas, imagiologia de EGFP-KASH2 requer imunodetecção com um anticorpo anti-EGFP.
7. Remover a solução de anticorpos e enxaguar com PBS três vezes.
8. Prepare 1: 1000 de anticorpos secundários diluições Alexa Fluor-em 0,5% de Triton X-100,10% de soro de burro em PBS e armazenar no escuro.
9. Suavemente remover o enxaguamento final PBS e aplicar a diluição do anticorpo secundário durante uma hora no escuro.
10. Remover a solução de anticorpo secundário, enxaguar e lavar a secção de três vezes. Se necessário, aplicar um corante nuclear, tais como DAPI (~ 300 nM), durante a primeira aplicação de PBS.
11. Completamente remover a solução PBS de todo o tecido e lugar ~ 5-7 ul de montagem de mídia na secção de tecido. Coloque uma lamela de vidro na parte superior da secção de tecido e retiradas para ~ 15-30 min à temperatura ambiente no escuro.
12. Usar um microscópio de fluorescência equipado com os filtros apropriados para visualizar EGFP e quaisquer outros comprimentos de onda adequados para os anticorpos secundários utilizados em passos de 5,8 / 5,9. Em fatias do cerebelo, utilizar uma objectiva de 20x para visualizar EGFP-KASH2 jantes nucleares.

Results

Este protocolo ilustra a utilidade do (EGFP-KASH2 / CAG-LacZ) modelo de ratinho Tg para restringir a expressão EGFP-KASH2 para células de Purkinje do cerebelo usando Tg (PCP2-CRE) ratinhos. Em Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, a grelha de leitura aberta de LacZ / V5 é excisado em P6 pela recombinase Cre conduzindo assim à expressão de EGFP-KASH2 especificamente direccionada para células de Purkinje (Figura 2A). Como esperado, EGFP-KASH2 é voltado para o envelope nuclear, tal como indicado ...

Discussion

O passo mais importante para estudar o papel com sucesso de complexos LINC in vivo utilizando o modelo de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) é identificar uma linha de murganho adequados Cre (s). Com efeito, se Cre está activo em outros tipos de células-envolvidas em vias semelhantes, que podem complicar a interpretação dos resultados. Por isso, é importante examinar as células vizinhas, como mostrado nas camadas celulares e moleculares granulares do cerebelo (Figura 2B). Do mesmo modo, para maximizar ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sacarose	Sigma	Aldrich S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Solução de Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Sciences	15710
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Slides	de Adesão StatLab	M1000W
Soro de Burro	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anticorpo Anti-Calbindina	Sigma Aldrich	C9848
Anti-EGFP Abcam		ab13970
Anti-Nesprin2 Anticorpo			Anteriormente descrito na Ref. 21
Montagem Fluorescente Mídia	Dako	S3023
2-metil butano	Sigma Aldrich	O3551