A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.
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Artigo de método
O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6
Neste artigo
Resumo
Resumo
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune com diversas manifestações clínicas e imunológicas. Vários modelos animais espontâneos e induzíveis espelham componentes comuns de doenças humanas, incluindo o modelo de transferência de bm12. Após a transferência de esplenócitos bm12 ou células T CD4 purificadas, os camundongos C57BL / 6 desenvolvem rapidamente grandes frequências de células T foliculares auxiliares (Tfh), células B do centro germinativo (GC) e células plasmáticas, seguidas por altos níveis de anticorpos antinucleares circulantes. Como este modelo utiliza camundongos em um fundo C57BL / 6 puro, os pesquisadores podem estudar rápida e facilmente a progressão da doença em cepas de camundongos transgênicos ou knockout em um período de tempo relativamente curto. Aqui descrevemos protocolos para a indução do modelo e a quantificação de células Tfh, GC B e plasmócitos por citometria de fluxo multicolorida. É importante ressaltar que esses protocolos também podem ser usados para caracterizar a doença na maioria dos modelos de LES em camundongos e identificar Tfh, células B GC e células plasmáticas em outros modelos de doenças.
Introdução
O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada complexo prototipicamente pelo anticorpo anti-nuclear (ANA) produção e glomerulonefrite. Numerosas outras sequelas, incluindo dérmica, cardio-pulmonar, lesões hepáticas e estão associados com a doença em alguns indivíduos. As estimativas de prevalência em os EUA variam muito, desde 150,000-1,500,000 1,2, com particular incidência em alta mulheres e minorias 3. Embora a etiologia do LES tem sido difícil de discernir, pensa-se que surgem a partir da interação de vários fatores genéticos e ambientais, que culminam na auto-imunidade sistêmica.
Inúm....
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Protocolo
Trabalho animal foi realizada em condições livres de patógenos específicos de acordo com diretrizes estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care Internacional e nossa Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).
NOTA: Incorporar camundongos que expressam um marcador congénica como CD45.1 de cada doador ou animais receptores, se possível, porque isso permite a monitorização da eficiência doador do enxerto e expansão específica do doador população de células T CD4. Se considerando o uso de camundongos geneticamente modificados como outra forma de doadores ou beneficiários, garantir a tensão está ....
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Resultados
Ratinhos doentes desenvolvem esplenomegalia em menos de 14 dias, apresentando os baços 2-3 vezes o tamanho dos ratinhos saudável em termos de massa e celularidade (Figura 2).
Os esplenócitos são sequencialmente fechado na dispersão de luz (FSC-SSC-A por A), a eliminação de dupletos (FSC-W ou -H pelo FSC-A), células viáveis (baixa coloração do corante de viabilidade) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Células dadoras são distinguidas das célu.......
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Discussão
O modelo induzível BM12 é uma maneira relativamente fácil e eficiente para estudar os processos celulares e moleculares do LES. A activação crónica de células T CD4 adoptivamente transferidos dirigidos contra auto-antigénios conduz à acumulação de TFH, GC células B, e células de plasma que pode ser medido por citometria de fluxo, tal como descrito aqui. Estudos futuros utilizando este modelo pode rapidamente e facilmente interrogar o papel dos genes candidatos e novas terapias nos processos centros germinativos auto-imu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (para EMJ) e Albert J. Ryan Fellowship (para JK). Somos gratos pelo apoio e instrumentação fornecidos pelo Núcleo de Citometria de Fluxo de Pesquisa na Divisão de Reumatologia do Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati, apoiado em parte pelo NIH AR-47363, NIH DK78392 e NIH DK90971.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| B6. SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1 + BoyJ cepa de camundongo |
| B6 (C) -H2-Ab1bm12 / KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | cepa de camundongo Bm12 |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Enzima de digestão de restrição para genotipagem |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Tubo de Separação de Plasma (PST) | BD | 365974 | Tubo de coleta de sangue com EDTA Dipotássico |
| Tubo de Separação de Soro (SST) | BD | 365967 | Tubo de coleta de sangue com ativador de coágulo / Gel SST |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Solução de separação de células de alta densidade |
| Linfólito-M | Cedarlane | CL5030 | Solução de separação de células de alta densidade |
| GL-7-biotina | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Estreptavidin-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Corante de viabilidade fixável ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| 1,2 ml FACS inserções de tubo, racked | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Tubos de fundo redondo | BD | 352017 |
Referências
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
- Somers, E. C., Marder, W., e....
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Reimpressões e permissões
