É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

18.3K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/53319

⸱

1 de novembro de 2015

 , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center and University of Cincinnati College of Medicine

Neste artigo

Resumo

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

Resumo

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune com diversas manifestações clínicas e imunológicas. Vários modelos animais espontâneos e induzíveis espelham componentes comuns de doenças humanas, incluindo o modelo de transferência de bm12. Após a transferência de esplenócitos bm12 ou células T CD4 purificadas, os camundongos C57BL / 6 desenvolvem rapidamente grandes frequências de células T foliculares auxiliares (Tfh), células B do centro germinativo (GC) e células plasmáticas, seguidas por altos níveis de anticorpos antinucleares circulantes. Como este modelo utiliza camundongos em um fundo C57BL / 6 puro, os pesquisadores podem estudar rápida e facilmente a progressão da doença em cepas de camundongos transgênicos ou knockout em um período de tempo relativamente curto. Aqui descrevemos protocolos para a indução do modelo e a quantificação de células Tfh, GC B e plasmócitos por citometria de fluxo multicolorida. É importante ressaltar que esses protocolos também podem ser usados para caracterizar a doença na maioria dos modelos de LES em camundongos e identificar Tfh, células B GC e células plasmáticas em outros modelos de doenças.

Introdução

O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune caracterizada complexo prototipicamente pelo anticorpo anti-nuclear (ANA) produção e glomerulonefrite. Numerosas outras sequelas, incluindo dérmica, cardio-pulmonar, lesões hepáticas e estão associados com a doença em alguns indivíduos. As estimativas de prevalência em os EUA variam muito, desde 150,000-1,500,000 1,2, com particular incidência em alta mulheres e minorias 3. Embora a etiologia do LES tem sido difícil de discernir, pensa-se que surgem a partir da interação de vários fatores genéticos e ambientais, que culminam na auto-imunidade sistêmica.

Inúmeros modelos animais têm sido empregados para fatores que levam ao início da doença e progressão estudar. Modelos clássicos de rato de SLE incluem estirpes de ratos geneticamente predispostos incluindo o NZB x NZW F1 modelo e os seus derivados, o NZM MLR / lpr estirpe, e a estirpe BXSB / Yaa e os sistemas indutíveis, tais como o pristane e modelos 4 doença crônica do enxerto-versus-hospedeiro (DECHc). Os primeiros relatórios de produção de autoanticorpos em modelos de GVHD usado várias linhagens de camundongos ou estirpes de hamster para pai em transferências F1 5 - 8; métodos mais comuns utilizados para estudar a doença de lúpus incluem atualmente o pai DBA / 2 → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, eo modelo de transferência BM12 descrito aqui. Cada modelo tem suas próprias advertências, mas eles geralmente compartilham um conjunto comum de características que se correlacionam com características clínicas da doença humana. Os parâmetros mais frequentemente reportados em modelos de murganho incluem esplenomegalia, linfadenopatia, nefrite, produção ANA, e ao nível celular, a expansão de células T helper (foliculares TFH), ao centro (GC), as células B e células germinais, de plasma.

O modelo BM12 indutível é conseguida pela transferência adoptiva de linfócitos a partir de IA BM12 B6 (C) - H2 - Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) ratinhos, uma estirpe identical para murganhos C57BL / 6 com excepção de 3 substituições de aminoácidos no MHC de classe II, em IA b C57BL / 6 (B6) ratinhos. Aloactivação de doadores células T CD4 por destinatário APCs leva a cGVHD com sintomas muito semelhantes LES. Especificamente, estas incluem a expansão do derivado do doador TFH, a expansão das células B GC derivada do receptor e as células de plasma, e a produção de ANA incluindo anti-ADNcd e anti-ssDNA, anti-cromatina, e anticorpos anti-RBC 9. Ao longo do tempo, ratinhos receptores desenvolver glomerulonef rite associada com depósitos de IgG no glomerular, intersticial, e regiões vasculares dos rins 10. Mostrámos recentemente que, semelhante à doença humana, também há um papel crítico para o IFN tipo I neste modelo 11. Notavelmente, os critérios de definição para SLE humano incluem o desenvolvimento de nefrite compatível com SLE, na presença de anti-dsADN os anticorpos 12, ambos os quais são características proeminentes deste modelo de ratinho.

Existem SEveral vantagens do modelo BM12 ao longo dos modelos espontâneos. Modelos clássicos que desenvolvam sinais LES-like espontaneamente dependem tanto linhagens de camundongos híbridos, linhagens puras não no fundo B6, ou grande loci genéticos no fundo B6, que fazem que cruzam a nocaute ou camundongos geneticamente modificado de outra forma difícil e demorado. Com o modelo indutível BM12, ratos geneticamente modificados podem servir quer como dador ou do receptor, permitindo a identificação mais rápida do compartimento celular em que os genes específicos podem ser importantes para a doença. Além disso, o desenvolvimento da doença no modelo BM12 é muito mais rápido, necessitando apenas de 2 semanas até ao aparecimento de ANA, em comparação a vários meses para os modelos mais espontâneas. Além disso, em contraste com os modelos espontâneos que desenvolvem a doença em diferentes pontos de tempo, o aparecimento e progressão da doença no modelo B6 BM12 → é altamente sincronizadas. Isto permite a geração de coortes de tamanho adequado que pode bE utilizada para estratégias de intervenção ou terapêuticos em qualquer fase do desenvolvimento da doença.

O que se segue é um protocolo detalhado para iniciar a auto-imunidade de LES como pela transferência adoptiva de linfócitos BM12 em ratinhos C57BL / 6, ou variantes genéticas no fundo B6. Além disso, descreve-se um protocolo de coloração de citometria de fluxo para enumerar TFH, GC células B, células do plasma e os tipos de células associadas com a doença humana. Mais importante, estes protocolos podem também ser utilizados para caracterizar doença na maioria dos modelos de rato de SLE e identificar TFH, GC células B e as células de plasma em outros modelos de doenças.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Trabalho animal foi realizada em condições livres de patógenos específicos de acordo com diretrizes estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care Internacional e nossa Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

NOTA: Incorporar camundongos que expressam um marcador congénica como CD45.1 de cada doador ou animais receptores, se possível, porque isso permite a monitorização da eficiência doador do enxerto e expansão específica do doador população de células T CD4. Se considerando o uso de camundongos geneticamente modificados como outra forma de doadores ou beneficiários, garantir a tensão está devidamente retrocruzadas ao fundo B6, ou células transferidas pode ser rejeitado-isso será abordado em pormenor nos resultados representativos e seções de discussão.

NOTA: As seguintes volumes detalhe os procedimentos para a recolha de 4 doador BM12 ratos, os quais devem produzir células suficientes para injetar camundongos 12-16. Seisa doze semanas de idade, ratinhos BM12 produzir cerca de 100-140 milhões de linfócitos com cerca de 25% de células T CD4. Se começando com números diferentes de ratos, ou diferentes linhagens de camundongos, volumes escala cima ou para baixo em conformidade. Murganhos C57BL / 6 geralmente dão rendimentos similares com mais perto de apenas 20% das células T CD4.

NOTA: Execute todas as etapas na RT e usar a mídia RT para evitar o calor eo frio choque, o que pode prejudicar a viabilidade dos linfócitos longo prazo. Execute-colheita de tecidos e etapas de processamento de tecido em uma capa de cultura de tecidos utilizando uma técnica asséptica. Todos os meios de comunicação neste protocolo é IMDM com 10% de FBS, a menos que indicado de outra forma, e será referida simplesmente como inactivado pelo calor "meio completo".

1. novo método para genotipagem BM12 Mice

NOTA: Um protocolo breve restrição baseada em digestão para genotipagem é fornecido aqui, como uma alternativa simples e barata de seqüenciamento, que é actualmente o único método de genotipagem publicadopara estes ratinhos.

  1. Isolar DNA genômico de rabos de rato. Por favor, referir-se a um artigo anterior JoVE para protocolos detalhados no recorte da cauda do rato e a geração de cDNA a partir de cauda digere 13.
  2. Executar uma transcriptase reversa reacção em cadeia polimerizada (PCR), 14 para amplificar um fragmento de ADN 474 bp comum de MHC-II IA b e BM12 IA utilizando os iniciadores e as condições de ciclos térmicos listados na Tabela 1.
  3. Realizar digestão de restrição em ~ 7 ul do produto de PCR, utilizando a enzima PsuI, ou um dos seus isosquizômeras (BstX2I, BstYI, MflI, ou XhoII), que corta tipo selvagem IA b, mas não IA BM12 mutante. Siga digerir protocolo fornecido pelo fabricante, que irá indicar uma mistura de água, tampão e enzima, e uma incubação de 5 min. a várias horas a 37 ° C 15.
  4. Carregar digerir produto e executar em 1% de gel de poliacrilamida com brometo de etídio 14 durante 30-45 min. em 150V-embora configurações óptimas de voltagem e de tempo irá variar, dependendo do aparelho de gel de PCR utilizado. Visualize as bandas de ADN com um iluminador UV. Os resultados representativos são mostrados na Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1. Representante BM12 resultados de genotipagem.
Para identificar os ratinhos homozigóticos para IA BM12 / BM12, ADN da cauda foi rastreada para BM12 por PCR / restrição digerir genotipagem (Passo 1). Tipo selvagem homozigoto (IA b / b) DNA produz duas bandas em 227 e 247 bp (visualizado como uma banda de espessura em ~ 250 pb); BM12 homozigoto (IA BM12 / BM12) rendimentos de ADN uma banda a 474 pb; e heterozigotos (IA BM12 / b) DNA produz duas bandas em ~ 250 e 474 pb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. A colheita de DoadoresCélulas

  1. Sacrifício camundongos doadores usando Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) -aprovado métodos de eutanásia primárias e secundárias. Por exemplo, ratinhos eutanásia por asfixia com CO 2, seguida por deslocação cervical.
  2. Utilizando uma técnica asséptica, baços de colheita e de gânglios linfáticos (cervical superficial, mandibular, braquial, axilar, mesentérica, e inguinal) em 15 ml tubos contendo 10 ml de mídia completo como em 11-13.
    NOTA: Consulte a relatórios anteriores para linfáticos detalhada protocolos nó dissecação 16 - 18. Este modelo também é bem sucedido usando apenas para a transferência de esplenócitos de ratinho, mas a adição de gânglios linfáticos reduz significativamente o número necessário de ratinhos dadores.
  3. Gerar uma suspensão de uma única célula triturando tecidos linfóides recolhidas no passo 2.2 a 70 uM filtros celulares utilizando o êmbolo de uma seringa. Para melhor rendimento, não sobrecarregue coadores de uso ~ 6 filtros para cada 4camundongos tratados, e enxaguar filtros com freqüência durante o processamento. Combinar tecidos a partir de 4 ratos em dois tubos cónicos de 50 ml, em seguida, as células de centrifugação durante 5 min a 400 xg e decantar o sobrenadante.
  4. Ressuspender as células de ambos os tubos cônicos de 50 ml de mídia completas e transferências para novo tubo cônico. Mantenha este tubo à temperatura ambiente.
    NOTA: Gordura adere aos lados do tubo, e se o tubo não está substituído, os rendimentos celulares finais podem sofrer.

3. Doador de Contagem de Células

NOTA: Para preservar a lise maior viabilidade, de glóbulos vermelhos (RBC) de toda a amostra não é recomendado.

  1. Misture a suspensão de células isoladas a partir do passo 2.4 bem, remover 1 ml e transferi-lo para um 50 ml cónico separado. Retiradas restantes, células intactas (49 ml) à temperatura ambiente durante a contagem.
  2. Adicionar 3 ml de um tampão de lise de glóbulos vermelhos à base de cloreto de amónio à amostra de 1 ml de células do doador. Misture delicadamente por 1 min. balançando, em seguida, preencha a 50 ml com meio completo, umND centrifugar durante 5 min. a 400 xg e sobrenadante decantado.
  3. Ressuspender as células RBC-lisadas em 10 ml de mídia completo e contagem (por exemplo, com azul de tripano utilizando um hemocitómetro). Resultado multiplicar por 49 este é o número total de células remanescentes na amostra não-lisadas, que foi posto de lado. Rejeitar células RBC-lise.

4. doador da célula rotulagem e / ou CD4 T Purificação celular

  1. Se desejado, purificar as células T CD4, nesta fase, embora isso não seja necessário. Além disso, se desejado, células de etiqueta com CFSE, como em 19, ou outros corantes de rastreamento de células, um exemplo dos quais é mostrado na Figura 4 da secção de resultados representativos.
    NOTA: Para CD4 T purificação de células, é recomendável selecionar magnético negativo, pois ele pode atingir uma alta pureza e deixa as células intactas com alta viabilidade, conforme descrito no 20. É importante que os tampões livres de endotoxinas são utilizados; portanto, em vez de BSA, fazer a separação sagacidade tampãoh 2% de FBS e a concentração recomendada de EDTA.

5. Injeção de células do doador BM12

  1. Após a contagem de linfócitos do doador na etapa 3 (e purificada ou rotulado como no passo 4, se for o caso), as células de centrifugação durante 5 min a 400 x g. Decantar células sobrenadante e ressuspender em PBS a 120 milhões de linfócitos por ml (ou 30 milhões de células T CD4 + purificadas por ml). Células transferência para um estéreis 5 ml de tubos de fundo redondo, ou outro tubo estéril que acomoda facilmente uma seringa de 1 ml equipado com um 27,5 G x 13 mm agulha.
  2. Antes da injecção, anular uma pequena amostra de células do dador a partir do passo 5.1 a 4 ° C para a coloração de fluxo para determinar a percentagem de células T CD4 + dentro das amostras dadoras. Mancha estas amostras, conforme descrito no Passo 8, utilizando o painel de anticorpo mínimo (Tabela 2).
    NOTA: Se as células a partir de diferentes estirpes de ratinho são utilizados como dadores separados, esta é uma consideração importante, e se as percentagens de células T CD4 variar substancialmente, purificação pode não ser necessária.
  3. Misture delicadamente as células, mas completamente. Isto pode ser feito por pipetando as células para cima e para baixo usando uma seringa de 1 ml, sem uma agulha ligada. Após a mistura, desenhar células na seringa de 1 ml. Anexar agulha depois de remover as bolhas de ar. Mantendo a agulha fora enquanto aprontar a seringa ajuda a manter a viabilidade celular.
  4. Injectar 250 jil por ratinho (que é igual a 30 milhões de linfócitos, ou 7,5 milhões de células T CD4 + purificadas por murganho) por via intraperitoneal, como descrito em 21.
    NOTA: Em experiências mostradas aqui e em nosso trabalho anterior 11, cada rato é injetado com 30 milhões de linfócitos totais de BM12 doadores, em vez dos 100 milhões de esplenócitos totais tradicionalmente utilizados. Em dados não publicados do nosso laboratório, nenhuma diferença foi observada em anti-dsDNA soro no dia 14, após as injecções de 30 ou 100 milhões de linfócitos por rato. Enquanto isto reduz significativamente o número de ratinhos necessários para as experiências, o desenvolvimento de nefrite with não foi avaliado esse número de células.

6. Determinar Enxertia Eficiência

NOTA 1: Esta secção descreverá como para determinar o grau de enxertamento célula do dador no receptor no dia 3, a fim de identificar quaisquer ratinhos que podem ter recebido injecções sub-óptimas (por exemplo, o enxerto de um rato é <10% do que a observada em Todos os outros ratinhos do mesmo grupo). Esses dados também podem ajudar a determinar se as células de uma estirpe de ratinhos geneticamente modificados forem rejeitadas em momentos posteriores (para detalhes, veja a seção de resultados representativos, Figura 6).

NOTA 2: Esta secção só é possível se doadores e receptores são de ratos em diferentes formações congênitas, por exemplo, ao utilizar doadores CD45.1 BM12 e CD45.2 C57BL / 6 destinatários, ou quando as células doadoras são marcados com um corante de rastreamento de pilha. Importante, aos 3 dias pós-injecção, as células T CD4 + foram sujeitas a expansão mínima (SEe secção representativa resultados, Figura 4), ​​de modo diferenças observadas no grau de enxertamento se devem a variabilidade em injecções, não expansão.

  1. Anestesiar ratos com 4% de isoflurano ou outro método IACUC-aprovado. Testar os reflexos do pé traseiros para assegurar o mouse está devidamente anestesiados antes de prosseguir para a coleta de sangue.
  2. Colheita de sangue 100-200 ul usando um método IACUC-aprovado, como retro-orbital punção como em 22. Recolha de sangue em tubos de microcentrífuga de 0,5 ml individuais contendo um anti-coagulante, tal como os tubos de recolha de plasma referenciados na tabela de materiais, que contêm EDTA dipotássico liofilizada. Após a coleta de sangue, aplique uma leve pressão no olho do rato usando uma toalha ou gaze estéril para garantir o sangramento parar, em seguida, coloque o mouse de volta em sua gaiola onde permanecerá até a colheita tecido final (Passo 7).
    NOTA: Não deixe ratos autônoma até ratos recuperou a consciência suficiente paradecúbito ventral manter, e não retornam ratos para a companhia de outras pessoas até que esteja totalmente recuperado.
  3. Levar o volume de sangue de 500 ul com 21 ° C, PBS e transferir para um tubo de microcentrífuga cónica de fundo, em seguida, underlay lentamente 200 ul de 21 ° C uma solução de separação de células de alta densidade com um pi pipeta de 200, tendo o cuidado de minimizar a mistura entre as duas fases ( veja Materiais tabela de soluções recomendadas). Células centrifugar a 700 xg durante 20 min a 20-25 ° C com travão de centrifugação ajustado para baixo.
  4. Remover a camada de topo contendo linfócitos com uma pipeta de 1 ml e transferência para um novo tubo de microcentrifugação de 800 ul contendo meio completo frio. Gentilmente vórtice para misturar as células. Células centrifugar a 700 xg durante 5 min a 4 ° C e o sobrenadante decantado.
  5. Ressuspender as células em 200 ul de meio completo, a transferência para uma placa de 96 poços de fundo em U, e mancha de citometria de fluxo, conforme descrito no Passo 8, utilizando um painel de anticorpos mínimo (Tabela 2) para determinar tele abundância relativa do enxerto de células T CD4 + como uma percentagem de PBMCs.

7. final em tecido Colheita

NOTA: Os experimentos descritos na seção resultados foram colhidas 14 dias após a injeção de células do doador (ou em alguns casos menos tempo), como eles se concentrar no desenvolvimento inicial de células TFH e células plasmáticas; no entanto, uma vez que este modelo é um modelo GVHD crônica de LES, doença pode ser controlada em tantos pontos de tempo posteriores. O prazo óptimo dependerá da questão de pesquisa em cada experiência individual.

  1. Num ponto de tempo predeterminado após a injecção de células dadoras BM12 (passo 5.4), sacrificar os ratinhos utilizando um método IACUC-aprovado de eutanásia. Asfixia com CO2, seguido por sangria é recomendado. Deslocamento cervical pode funcionar como um método secundário da eutanásia, mas isto pode reduzir o rendimento de colheita de sangue.
  2. Molhar o abdômen do mouse levemente com um frasco de spray contendo 70%etanol. Faça uma pequena incisão, superficial com uma tesoura cirúrgica aproximadamente 1 cm acima da genitália. Chamar de volta a pele do abdômen em direção ao esterno, tendo o cuidado de manter a fáscia peritoneal intacta.
    NOTA: ratinhos enfermas normalmente apresentam-se com 0,5-3 ml de ascite No dia 14, o qual, embora ainda não tenha sido bem caracterizados, podem ser medidos e analisados ​​como um parâmetro adicional da doença.
  3. Encaixe uma seringa de 5 ml com uma agulha de 18 G. Inserir a agulha no quadrante inferior direito do abdómen com a agulha dirigida para cima para a cabeça do animal e a 15 ° de ângulo em relação ao plano do painel de instrumentos. Posicione a ponta da agulha perto do ceco para ajudar a evitar que a agulha fique entupido com intestino enquanto aspiração ascite.
  4. Gire cuidadosamente o mouse de lado, em seguida, desenhar lentamente ascite dentro da seringa. Uma vez ascite foi recuperado, remover a seringa e registrar o volume aspirado, com base nas marcações volumétricas no lado do syriESL.
  5. Ascite descarga para um tubo de 5 ml de fundo redondo e armazenar em gelo para posterior processamento.
  6. Colheita de sangue através de sorteio a partir da veia cava inferior (VCI), essencialmente como em 22. Utilizando uma pinça sem brilho, mova suavemente intestinos para o lado esquerdo do mouse, descobrindo o IVC. Inserir uma agulha 27,5 g adequado para uma seringa de 1 ml para a VCI e desenhar lentamente 400-500 mL de sangue.
  7. Para minimizar a hemólise, injectar lentamente sangue para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml de soro ou de recolha de plasma. Para a análise do soro depois de ANAs por ELISA, manter o sangue no gelo.
  8. Dissecar e obter adicional tecidos relevantes (baço e, se desejado, rins e gânglios linfáticos, especialmente se recolha em pontos de tempo posteriores e glomerulonefrite serão marcados). Remover baço por suavemente colocando os intestinos de volta para o lado direito do animal, e puxar sobre o pâncreas, o qual é um tecido conjuntivo primário do baço.
  9. Remova qualquer pâncreas restante, em seguida, pesarbaços em uma balança de alta precisão imediatamente após a dissecação, como esplenomegalia bruta é um parâmetro comumente relatada em modelos de ratos com LES. Coloque tecidos linfóides individuais em tubos de 1,5 ml cheios com 1 ml de meio completo em gelo. Corrigir rins em 10% formalina tamponada neutra ou tirar congelar rins para histologia mais tarde, como em 23.
  10. Centrífuga de sangue dentro de 2 horas de coleta para 3 min. a 10.000 xg (4 ° C). Remover soro e armazenar a -80 ° C para posterior análise da ANA por ELISA. Consulte a relatórios anteriores para protocolos Ana Elisa detalhados 24,25. Armazenar o soro em 10-20 mL alíquotas múltiplas para minimizar a ciclos de congelamento / descongelamento, e permitir que um maior número de ensaios futuros.
  11. Centrifugar ascite 400 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta de 1 ml e alíquotas de 0,5 ml em vários tubos. Congelar sobrenadante a -80 ° C para posterior análise de anticorpos anti-nucleares (ANA) ou outros mediadores inflamatórios solúveis.
  12. Fract celular Ressuspender ião positivo em cerca de 1 ml de meio completo e transferir 200 ul de uma placa de 96 poços de fundo em U para a coloração de fluxo (tal como no Passo 8).
  13. Amasse cada baço através de 70 mm filtros de células em tubos separados e enxágüe com meio completo. Ressuspender esplenócitos com 1 ml de tampão de lise de RBC frio durante 1 min. e misture delicadamente balançando. Levar o volume até 10 ml com meio completo frio e centrifugar durante 5 min a 400 xg e decantar o sobrenadante.
  14. Ressuspender pellet celular em 5 ml de mídia completo e contagem usando um hemocitômetro. Ajustar o volume tal que 200 mL de mídia completo contém 1-3 milhões de células. Iniciar a coloração por citometria de fluxo (Passo 8) utilizando um painel alargado (Tabela 2) para quantificar dador de células T CD4 e o receptor da célula B diferenciação e expansão.
    NOTA: Dependendo do que laser, tubo fotomultiplicador (PMT), e conjuntos de filtros combinações estão disponíveis, separando painel de análise de células T e B em vários painéis podem ser necessários.
ve_title "> 8. Fluxo Coloração

  1. Transferência de 1-3 milhões de esplenócitos em 200 ul de meio completo para tubos individuais de 5 ml de fundo redondo, ou em cavidades separadas de uma placa de 96 poços com fundo em U.
    NOTA: Usando uma placa de 96 cavidades é uma maneira eficiente para corar amostras múltiplas, mas tomar cuidado para chapear amostras bem em todos os outros, a fim de evitar a contaminação cruzada. Uma placa de 96 poços pode, por conseguinte realizar 24 amostras.
  2. Placa centrifugar a 500 xg durante 3 min., Em seguida, sobrenadante filme de placa em um recipiente (Biohazard) apropriado.
  3. Ressuspender as peletes de células com 100 ul de tampão de fluxo (1% de FBS em PBS) contendo um corante de viabilidade fixável a uma concentração recomendada pelo fabricante e purificados anti-CD16 / anti-CD32 anticorpo coquetel a 1 ug / ml. Incubar durante 10 minutos a 20-25 ° C, depois adicionar 100 ul de meio completo frias para suprimem corante de viabilidade.
    NOTA: Os esplenócitos de ratos doentes geralmente contêm um número relativamente elevado de células mortas ou a morrer;portanto, a inclusão de um corante de viabilidade é recomendado para evitar a rotulagem anticorpo não específico de morte de células, resultando em dados mais limpas, mais fiáveis. Da mesma forma, o cocktail anti-CD16 / anti-CD32 é incluído para bloquear o anticorpo fluorescentemente marcado a ligação não específica por receptores Fc.
  4. Placa centrifugar a 500 xg durante 3 min., Em seguida, sobrenadante filme de placa em um recipiente de risco biológico. Ressuspender as células em 200 ul tampão fluxo. Placa centrifugar a 500 xg durante 3 min., Em seguida, sobrenadante filme de placa em um recipiente de risco biológico.
  5. Ressuspender as células em 50 ul de tampão de fluxo contendo cocktail de anticorpos (Tabela 2). Incubar durante 20 min a 4 ° C, depois adicionar 150 ul de tampão de fluxo. Repita o passo de lavagem 8.4.
  6. Ressuspender as células com 100 ul de 2% de paraformaldeído em PBS. Incubar durante 30 min a 4 ° C, depois adicionar 100 ul de tampão de fluxo. Placa centrifugar a 500 xg durante 3 min., Em seguida, sobrenadante filme de placa em um recipiente de risco biológico.
  7. ResuspeND em 200 ul de tampão de fluxo, transferir a fluir inserções do tubo ou tubos de fluxo padrão, adicionar um tampão de fluxo adicional de 100-200 uL, e armazenar a 4 ° C no escuro até adquirir no citómetro de fluxo.
  8. Adquirir num citómetro de fluxo equipado com lasers e os PMTs adequadas para os painéis de anticorpos escolhidos dentro de alguns dias de coloração. Grave largura dispersão para a frente e / ou altura, além de transmitir a área de dispersão, área de dispersão lateral, ea área dos parâmetros fluorescentes utilizadas. Para obter resultados confiáveis, adquirir ≥1,000 células do doador em cada amostra WT, ou um número equivalente de linfócitos totais em ratos manipulados geneticamente modificados ou não que mostram expansão mínima de células do doador, onde a recolha de tantos eventos pode não ser viável.
    NOTA: As análises de citometria de fluxo são descritos em detalhe na secção de resultados representativos (Figuras 3 - 6).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Ratinhos doentes desenvolvem esplenomegalia em menos de 14 dias, apresentando os baços 2-3 vezes o tamanho dos ratinhos saudável em termos de massa e celularidade (Figura 2).

Os esplenócitos são sequencialmente fechado na dispersão de luz (FSC-SSC-A por A), a eliminação de dupletos (FSC-W ou -H pelo FSC-A), células viáveis ​​(baixa coloração do corante de viabilidade) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Células dadoras são distinguidas das célu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O modelo induzível BM12 é uma maneira relativamente fácil e eficiente para estudar os processos celulares e moleculares do LES. A activação crónica de células T CD4 adoptivamente transferidos dirigidos contra auto-antigénios conduz à acumulação de TFH, GC células B, e células de plasma que pode ser medido por citometria de fluxo, tal como descrito aqui. Estudos futuros utilizando este modelo pode rapidamente e facilmente interrogar o papel dos genes candidatos e novas terapias nos processos centros germinativos auto-imu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelo Lupus Research Institute, NCI grant CA138617, NIDDK grant DK090978, Charlotte Schmidlapp Award (para EMJ) e Albert J. Ryan Fellowship (para JK). Somos gratos pelo apoio e instrumentação fornecidos pelo Núcleo de Citometria de Fluxo de Pesquisa na Divisão de Reumatologia do Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati, apoiado em parte pelo NIH AR-47363, NIH DK78392 e NIH DK90971.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
B6. SJL-Ptprca Pepcb / BoyJThe Jackson Laboratory001162CD45.1 + BoyJ cepa de camundongo
B6 (C) -H2-Ab1bm12 / KhEgJThe Jackson Laboratory001162cepa de camundongo Bm12
FastDigest PsuILife TechnologiesFD1554Enzima de digestão de restrição para genotipagem
1X RBC Lysis BuffereBioscience00-4333-57
IMDMGE HealthcareSH30228.01
Tubo de Separação de Plasma (PST)BD365974Tubo de coleta de sangue com EDTA Dipotássico
Tubo de Separação de Soro (SST)BD365967Tubo de coleta de sangue com ativador de coágulo / Gel SST
FicollGE Healthcare17-1440-02 Solução de separação de células de alta densidade
Linfólito-MCedarlaneCL5030Solução de separação de células de alta densidade
GL-7-biotinaeBioscience13-5902-82 
Estreptavidin-BUV395BD564176
CD138-BV421BioLegend142508
CD4-BV510BioLegend100559
TCRβ-BV605BD562840
CD45.1-BV711BioLegend110739
CD45.2-FITCBioLegend109806
PD-1-PEBioLegend135206
CD19-PerCPBioLegend115532
Fas-PE-Cy7BD557653
CXCR5-APCBioLegend145506
Corante de viabilidade fixável ef780eBioscience65-0865-18
CD4-BV421BioLegend100443
1,2 ml FACS inserções de tubo, rackedUSA Scientific1412-1400
BD Falcon™ Tubos de fundo redondoBD352017

Referências

  1. Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
  2. Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
  3. Somers, E. C., Marder, W., et al. Population-based incidence and prevalence of systemic lupus erythematosus: The Michigan lupus epidemiology and surveillance program. Arthritis and Rheumatol. 66, 369-378 (2014).
  4. Perry, D., Sang, A., Yin, Y., Zheng, Y. -Y., Morel, L. Murine models of systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol. 2011, 271694(2011).
  5. Lindholm, L., Rydberg, L., Strannegård, O. Development of host plasma cells during graft-versus-host reactions in mice. Eur J Immunol. 3 (8), 511-515 (1973).
  6. Fialkow, P. J., Gilchrist, C., Allison, A. C. Autoimmunity in chronic graft-versus-host disease. Clin Exp Immunol. 13, 479-486 (1973).
  7. Streilein, J. W., Stone, M. J., Duncan, W. R. Studies on the Specificity of Autoantibodies Produced in Systemic Graft-vs-Host Disease. J Immunol. 114 (1), 255-260 (1975).
  8. Gleichmann, E., Gleichmann, H. Diseases caused by reactions of T lymphocytes to in compatible structures of the major histocompatibility complex. I. Autoimmune hemolytic anemia. Eur J Immunol. 6 (12), 899(1976).
  9. Morris, S., Cohen, P. L., Eisenberg, R. Experimental induction of systemic lupus erythematosus by recognition of foreign Ia. Clin Immunol Immunopathol. 57 (2), 263-273 (1990).
  10. Chen, F., Maldonado, M., Madaio, M., Eisenberg, R. The Role of Host (Endogenous) T Cells in Chronic Graft-Versus-Host Autoimmune Disease. J Immunol. 161 (11), 5880-5885 (1998).
  11. Klarquist, J., Hennies, C. M., Lehn, M. A., Reboulet, R. A., Feau, S., Janssen, E. M. STING-Mediated DNA Sensing Promotes Antitumor and Autoimmune Responses to Dying Cells. J Immunol. 193, 6124-6134 (2014).
  12. Petri, M., Orbai, A. -M., et al. Derivation and validation of systemic lupus international collaborating clinics classification criteria for systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 64 (8), 2677-2686 (2012).
  13. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246(2007).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  15. Product information: Thermo Scientific FastDigest PsuI. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/MAN0012567_FastDigest_PsuI_UG.pdf (2012).
  16. Matheu, M. P., Parker, I., Cahalan, M. D. Dissection and 2-photon imaging of peripheral lymph nodes in mice. J Vis Exp. (7), e265(2007).
  17. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).
  18. Covelli, V. Chapter 3, Internal examination. Guide to the necroscopy of the mouse. , Available from: http://eulep.pdn.cam.ac.uk/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html (2009).
  19. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. (44), e2259(2010).
  20. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (9), e53319(2007).
  21. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), e2771(2012).
  22. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  23. Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J Vis Exp. (67), e3928(2012).
  24. Cohen, P. L., Maldonado, M. A. Animal models for SLE. Curr Protoc Immunol.. Chapter 15, Unit 15.20(2003).
  25. Seavey, M. M., Lu, L. D., Stump, K. L. Animal models of systemic lupus erythematosus (SLE) and ex vivo assay design for drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 5, Unit 5(2011).
  26. McKenna, K. C., Vicetti Miguel, R. D., Beatty, K. M., Bilonick, R. A. A caveat for T cell transfer studies: generation of cytotoxic anti-Thy1.2 antibodies in Thy1.1 congenic mice given Thy1.2+ tumors or T cells. J Leukoc Biol. 89 (2), 291-300 (2011).
  27. Scott, D. M., Ehrmann, I. E., et al. Identification of a mouse male-specific transplantation antigen H-Y. Nature. 376, 695-698 (1995).
  28. Joly, E., Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose. Nat Immunol. 4 (9), 815(2003).
  29. Brown, D. R., Calpe, S., et al. Cutting edge: an NK cell-independent role for Slamf4 in controlling humoral autoimmunity. J Immunol. 187 (1), 21-25 (2011).
  30. Morris, S. C., Cheek, R. L., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. Allotype-specific immunoregulation of autoantibody production by host B cells in chronic graft-versus host disease. J Immunol. 144 (3), 916-922 (1990).
  31. Choudhury, A., Cohen, P. L., Eisenberg, R. A. B cells require “nurturing” by CD4 T cells during development in order to respond in chronic graft-versus-host model of systemic lupus erythematosus. Clin Immunol. 136 (1), 105-115 (2010).
  32. Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Modelo BM12Células T auxiliares folicularesCélulas B do centro germinativoPlasmócitosCitometria de fluxoTransferência de esplenócitosAnticorpos antinuclearesFormação do centro germinativo
O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.