Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Aged em neurônios do hipocampo

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

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Artigo de método

Fluorescência e imagem de bioluminescência subcelular Ca

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DOI:

10.3791/53330

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1 de dezembro de 2015

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

Neste artigo

Resumo

A remodelação intracelular de Ca²⁺ no envelhecimento pode contribuir para a excitotoxicidade e danos aos neurônios, processos mediados pela sobrecarga de Ca²⁺. Nosso objetivo foi investigar a remodelação de Ca²⁺ no cérebro envelhecido usando imagens de fluorescência e bioluminescência de Ca²⁺ citosólico e mitocondrial em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos, um modelo de envelhecimento neuronal.

Resumo

Suscetibilidade a morte celular neuronal associada a neurodegeneração e isquemia são extremamente aumentada no cérebro envelhecido mas os mecanismos responsáveis são mal conhecidos. A excitotoxicidade, um processo que se acredita contribuir para a lesão neuronal induzida por ambos os insultos, é mediada pela activação de receptores de glutamato que promove ^influxo de Ca2 + mitocondrial e ^sobrecarga de Ca2 +. Uma mudança substancial na homeostase intracelular ^de Ca2 + ou remodelação de ^Ca2 + intracelular homeostase pode favorecer danos aos neurônios nos neurônios velhos. Para investigar Ca ²⁺ remodelação no envelhecimento temos usado imagens de células vivas em culturas de longo prazo de neurônios do hipocampo de ratos que se assemelham em alguns aspectos neurônios in vivo com idade. Para este fim, as células do hipocampo são, em primeiro lugar, recém-dispersa de novas hipocampo de ratos recém nascidos e semeadas em lamelas revestido, vidro poli-D-lisina. Em seguida, as culturas são mantidas em meios controlada durante vários dias ou vários weeks para investigar jovens e velhos neurônios, respectivamente. Em segundo lugar, os neurónios em cultura são carregados com fura2 e submetido à medição da concentração citosólica ^de Ca2 + utilizando imagiologia digital de relação de fluorescência. Em terceiro lugar, neurônios cultivados são transfectadas com plasmídeos que expressam um conjunto de aequorin baixa afinidade e GFP alvejado a mitocôndria. Após 24 horas, aequorin dentro das células é reconstituído com coelenterazina e neurônios são sujeitas a imagem de bioluminescência para monitorização da concentração ^de Ca2 + mitocondrial. Este processo de três passos permite a monitorização de citosólica e respostas de Ca ²⁺ mitocondriais a estímulos relevantes como, por exemplo, o agonista do receptor de glutamato NMDA e comparar se estas e outras respostas são influenciadas pelo envelhecimento. Este processo pode produzir novos conhecimentos sobre a forma como o envelhecimento e influência citosólica ^de Ca2 + mitocondrial respostas a estímulos seleccionados, bem como o teste de fármacos seleccionados que visam prevenir células neuronaismorte em doenças relacionadas à idade.

Introdução

A excitotoxicidade é um dos mecanismos mais importantes que contribuem para o dano neuronal e morte celular em insultos neurológicos tais como a isquémia, e em algumas doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer ^1. Este tipo de neurotoxicidade é mediada principalmente pela glutamato atuação no Ca ²⁺ -permeable, receptores NMDA (NMDAR ionotrópica) ^2. A exposição de culturas de neurónios ao glutamato pode levar a excitotoxicidade ^3, o que provoca a apoptose neuronal ^4. Nós e outros autores relataram anteriormente que a vulnerabilidade neuronal para a apoptose induzida por NMDA podem mudar com o desen....