Estratégias experimentais para Ponte grandes lacunas de tecido na medula espinhal ferido após aguda e lesão crônica

Resumo

Lesões graves na medula espinhal geralmente resultam em defeitos teciduais. Duas possibilidades são descritas para preencher com sucesso essas lacunas para promover a adaptação tecidual, respostas regenerativas e melhora funcional em ratos por meio do implante de um sistema de microconectores mecânicos após lesão aguda e cinco semanas após a transecção completa da medula espinhal.

Resumo

Depois de uma lesão da medula espinal (SCI) forma-se uma cicatriz no núcleo lesão axonal que dificulta a regeneração. Transpondo o local da lesão após um insulto para a medula espinhal, ressecções de tumor, ou defeitos do tecido resultantes de acidentes traumáticos pode ajuda e facilitar a reparação dos tecidos em geral, bem como o crescimento regenerativo de fibras nervosas para dentro e para além da área afectada. Duas estratégias de tratamento experimentais são apresentados: (1) a implantação de um novo dispositivo microconnector em uma medula espinhal de ratos torácica aguda e totalmente seccionado se readaptar cortado tocos tecido da medula espinhal, e (2) enchimento de polietilenoglicol do site da SCI em ratos cronicamente lesionados após ressecção da cicatriz. A lesão medular crônica neste modelo é uma transecção medular completa, que foi infligido 5 semanas antes do tratamento. Ambos os métodos têm recentemente alcançado resultados muito promissores e promovido rebrota axonal, invasão celular benéfica e melhorias funcionaisem modelos de roedores de ferimento da medula espinal.

O sistema microconnector mecânica (MMS) é um sistema multi-canal composto de polimetilmetacrilato (PMMA) com um sistema de tubulação de saída para aplicar pressão negativa para o MMS lúmen puxando, assim, os cotos da medula espinhal nos orifícios estruturado em favo de mel. Após a sua implantação em tecido o fosso um milímetro o tecido é sugado para dentro do dispositivo. Além disso, as paredes interiores das MMS são microestruturada para uma melhor adesão do tecido.

No caso da abordagem de ferimento da medula espinal crónicas, tecido da medula espinhal - incluindo a área da lesão a cheio de cicatriz - é ressecado por uma área de 4 mm de comprimento. Após a ressecção da cicatriz microcirúrgico da cavidade resultante é preenchido com polietileno glicol (PEG 600), que se verificou proporcionar um excelente substrato para a invasão celular, revascularização, a regeneração axonal e mesmo a remielinização in vivo compacto.

Introdução

Uma lesão traumática da medula espinal, não só conduz à perda de axónios mas novos resultados em defeitos de tecidos que impedem qualquer resposta regenerativa (para revisão ver ^1,2). tecido da medula espinhal muitas vezes é perdido através de degeneração secundária que conduz à formação de cistos ou furos em torno da área da lesão. A maioria das intervenções terapêuticas experimentais focar incompletos danos na medula espinhal como transecção, esmagamento ou contusão lesões parciais, com uma borda restante do tecido saudável. Para lesões completas como totais transecções resultantes de acidentes traumáticos ou intervenções cirúrgicas, tais como ressecções tumorais, apenas a opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis hoje ^3,4. Após transsecção completa, a tensão mecânica dos resultados dos tecidos em retracção coto espinal, deixando uma pequena abertura na medula espinhal. A maioria das estratégias concentrar em preencher esta lacuna com tecidos, células ou matrizes ^5,6.

Aqui, uma estratégia diferenteé apresentada, ou seja, re-adaptação dos tocos separados usando um novo dispositivo microconnector ^7. A fim de readaptar os dois cotos, força mecânica tem de ser aplicado como uma ligeira pressão negativa para alcançar este (Figura 1). O sistema microconnector mecânica (MMS) é um sistema multi-canal de polimetilmetacrilato (PMMA) com buracos em forma de favo de mel (Figura 1A), munido de um sistema de tubulação de saída. É implantado tecido na abertura resultante da transecção da medula espinal completa no rato (Figura 1C). Um tubo pode ser ligado a uma bomba de vácuo para aplicar pressão negativa para o MMS (Figura 1D). A pressão puxa os cotos medulares desconectados em os furos em forma de favo de abelha do MMS, que têm paredes microestruturadas para manter o tecido no lugar quando a pressão é libertada (Figura 1B). A tubagem pode ser deixada intacta após a cirurgia e ligado a uma mini-bomba osmótica, a fimsubstâncias para infundir para o núcleo da lesão (Figura 1E-F).

Além de uma transecção aguda da medula espinhal outro tipo de resultados lesão completa da remoção cirúrgica de um tumor espinhal ou uma cicatriz lesão crônica sólida levando a grandes lacunas de tecido de vários milímetros, o que não pode ser superado pelo MMS até agora. A maioria dos pacientes com trauma da espinal medula sofre de lesões crónicas. Nesses pacientes, uma cicatriz totalmente desenvolvido ocupa o núcleo lesão. A remoção cirúrgica da lesão cicatriz é um conceito para o tratamento, que é actualmente investigada após SCI experimental ^8,9. Enquanto o procedimento de ressecção em si pode ser realizada sem causar dano adicional considerável, o hiato de tecido resultante tem de ser ligados em ponte com uma matriz adequada que permite e promove a regeneração de tecido e, no caso específico de lesões da medula espinal, a regeneração das fibras nervosas para manter e promover funções locomotoras. isso foiverificaram que de baixo peso molecular, polietileno-glicol (PEG 600) é um material muito adequado para este fim. Sua falta de imunogenicidade e da viscosidade muito baixa permitem uma integração harmoniosa no tecido circundante. A inserção do biopolímero só promove a invasão de células benéficos, incluindo células endoteliais, células de Schwann, periféricos, e os astrócitos, e - muito importante - a regeneração e alongamento dos axónios de descendente e ascendente feixes de fibras, bem como a sua ensheathment por mielina compacta ^8. Estas respostas regenerativas foram encontrados para ser acompanhada de longa duração melhorias funcionais. A combinação de ressecção do tecido cicatricial e subsequente implantação de PEG 600 apresenta um meio seguro e simples, mas muito eficaz para atenuar os defeitos de tecidos de medula espinal substanciais.

Protocolo

diretrizes institucionais para a segurança do animal e conforto foram cumpridas, e todas as intervenções cirúrgicas e cuidados pré e pós-cirúrgico animais foram fornecido em conformidade com a lei de Proteção Animal Alemão (Secretaria de Estado, Meio Ambiente e Defesa do Consumidor da Renânia do Norte- Vestefália, LANUV NRW ).

1. transecção completa da medula espinhal torácica de ratas Wistar (220-250 g)

1. Preparação da Medula Espinhal
   1. Utilizar anestesia por inalação de isoflurano (2-3% de isoflurano em _O2 / NO ₂ numa proporção de 1: 2) e injecção de bolus de carprofeno (por via subcutânea [SC] 5 mg / kg). A combinação de buprenorfina e carprofeno opióide (0,02 mg / kg sc) é recomendado. Comece a cirurgia, quando pálpebra reflexo ao toque leve com um cotonete e da pata reflexo de retirada para beliscar estímulo com uma pinça não são mais observadas.
   2. Colocar o animal sobre uma manta de aquecimento a 37 ° C para manter a temperatu do corpore durante a cirurgia e colocar pomada nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
   3. Raspar as costas do animal e de preparar a pele com um desinfectante da pele.
   4. Cortar a pele na linha média ao longo das vértebras torácica para 4 cm, com uma lâmina cirúrgica e abri-lo. A partir desta etapa, use esterilizado instrumentos cirúrgicos para todos os procedimentos (autoclavado ou imersão-esterilizado).
   5. Retrair os músculos acima da vértebra torácica, usando uma pequena músculos braçadeira.
   6. Remover os processos espinhosos no nível torácico 8 (TH8) e Th9 com um rongeur óssea por cautela recorte pequenos pedaços de osso até que os ossos vertebrais são planas.
   7. Use uma pinça anatômicas para levantar a coluna vertebral no processo espinhoso Th7 e usar um rongeur para cortar pequenos pedaços de osso vertebral de caudal a rostral até uma laminectomia é realizada a TH8 e Th9. Expor a dura-máter sem o danificar, removendo cuidadosamente poucos e muito pequenos pedaços de osso vertebral de cada vez.
   8. Prender o esqueleto por 2 grampos de estabilização de processos espinhosos Th7 e Th10, levante o animal para desacoplar os movimentos respiratórios do vértebras.
2. Conclua transecção medular em Thoracic Nível 8/9
   1. Levante a dura-máter com uma pinça fina, corte a dura-máter com uma tesoura olho finos no sentido transversal.
   2. Segurar a extremidade do corte lateral da dura-máter com uma pinça fina e inserir um gancho da coluna vertebral para dentro do espaço entre a dura-máter subarachnoidic e Arachnoidea. Evitar danos das meninges, não picar na pia ou dura-máter, quer com fórceps ou gancho medula espinhal.
   3. Lentamente gire o gancho para colocá-lo ao longo de todo o tecido da medula espinhal, tomando cuidado para não picar na dura-máter (pia ainda está intacto).
   4. Levantar a medula espinhal durante cerca de 1 - 2 mm para cima, até que uma abertura é visto no lado ventral da medula espinal entre o tecido e a dura.
   5. Insira tesoura olho finos no espaço betweeN dura-máter e Pia e corte da espinal medula enquanto o gancho da coluna vertebral é deixado no lugar.
   6. Levante os dois tocos da medula espinhal com duas pinças e visualmente garantir transecção completa.
   7. Para os animais lesionados de controlo e animais com uma lesão crônica, feche a dura por suturas interrompidas com monofilamento não-absorvíveis 9,0 threads.
   8. Para lesões crônicas siga parte 1.6.
3. MMS Implantação
   1. Coloque MMS acima do local da lesão, com os dois tubos encontram-se em cada face lateral da vértebra e baixá-la para dentro da cavidade lesão.
   2. tubos de sutura para os músculos na parte lateral da vértebra com não-reabsorvível 4-0 para assegurar a estabilização do MMS. Certifique-se de uma fixação do MMS usando uma pinça durante esta etapa.
   3. Remover o pino de ligação MMS por corte com um par de tesouras finas.
   4. Feche a dura acima das MMS e sutura com 9,0 threads.
   5. Anexar um tubo para a bomba de vácuo, e selara outra por aperto.
   6. Aplicar pressão negativa suave para o MMS por uma bomba de vácuo através do tubo aberto, sugando os cotos da medula espinhal para a luz MMS. Aplicar a pressão negativa durante vários minutos (no máximo durante 10 minutos) e monitorizar, através de sensores (250-350 mbar).
   7. Corte os tubos de perto o MMS e remover os tubos. Continue com a Etapa 1.6.
4. Ressecção de tecido da medula espinhal Incluindo o Scar lesão crônica na Semana 5 após a lesão inicial
   1. Siga os passos 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Identificar tecido cicatricial pela aparência castanha-amarela e tecido rígido na parte superior da medula espinhal. Remova cuidadosamente camadas superficiais de tecido cicatricial, segurando com uma pinça fina e corte com tesoura fina. Com este método, reabrir o local da laminectomia para expor o tecido que contém a área de lesão da medula espinal. Pare de preparação, quando a sutura dura é visualmente identificado.
   3. Prender o esqueleto por 2 a estabilização grampos no Spinprocessos ous TH7 e TH10, e, em seguida, elevar o animal para desacoplar os movimentos respiratórios do vértebras.
   4. Com uma pequena régua cartão medir a área da espinal medula o que é para ser ressecado (comprimento: 4 mm) e marcar as bordas desta respectiva área do tecido com incisões transversais para permitir a remoção subsequente do tecido.
   5. Remover o tecido cicatricial através de uma combinação de corte e aspiração. Retire o tecido que foi separado a partir da medula espinal com as incisões transversais. Use ligeira aspiração sempre que é suficiente para permitir a remoção do tecido. Além disso, sempre que a textura rígida do tecido da cicatriz faz a aspiração do tecido muito difícil, utilizar tesouras finas para cortar e remover este tecido.
   6. Inserir uma peça (aproximadamente 5 mm x 5 x 5 mm cubo) da esponja de gelatina hemostática na abertura do tecido até subsídios sangramento. A esponja de gelatina irá diminuir de tamanho assim que é embebido com o líquido.
5. Implantation de PEG 600
   1. Prepare 1 ml de PEG 600 puro sem diluição para injecção por aquecimento a 37 ° C.
   2. Remover esponja de gelatina.
   3. Inserir quantidade suficiente (cerca de 5-7 ul) de PEG para o fosso utilizando uma seringa de 10 ul ou 10 ul de uma pipeta.
   4. Cuidadosamente cobrir a área com uma parte (cerca de 5 mm x 4 mm) de substituição selante / dura-máter.
   5. Corrigir o vedante circundante para o tecido muscular com algumas gotas de cola de tecidos. Colocar o vedante na parte superior do hiato ressecção PEG-cheia. Para evitar o deslizamento do selante, utilizar pequenas gotas de cola de tecido para fixar os cantos do selante para o tecido muscular circundante. Nota: o evitar a fuga de cola de tecidos para o tecido da medula espinhal!
6. Encerramento do tecido e Cuidados Pós-Operatórios
   1. músculos de sutura e camada de pele para camadas com suturas interrompidas com trançados absorvíveis 4-0
   2. Injectar 2 × 2,5 ml de cloreto de sódio (NaCl[0,9%]) a 36 ° C sc para reidratação após a cirurgia. Uma única injecção de 5 ml de NaCl que esticar a pele do animal e pode causar danos desnecessários ao animal. Não deixe sem vigilância animal até a plena consciência é recuperada.
   3. Injectar carprofeno diária (sc de 5 mg / kg) durante pelo menos 2 dias após a cirurgia. Casa animal em única gaiola durante os primeiros 2 dias, depois em grupos de 2-3.
   4. Aplicar o tratamento com antibióticos (administração oral diária de enrofloxacina) para a primeira semana de pós-operatório.
   5. Faça bexiga manual de miccional em duas a três vezes por dia até gentilmente acariciando a barriga do animal de rostral para caudal. Tenha cuidado para não mover a coluna vertebral do animal e não levante o animal na cauda. anular manualmente bexiga do animal completamente spinalized diariamente durante todo o tempo de sobrevivência. Cuidados devem ser tomados para colocar pelotas de comida e garrafas de água em uma altura que pode ser alcançado pelos animais semde pé sobre suas patas traseiras. Embora sendo prejudicada em função traseira trimestre, os animais se movem e explorar as gaiolas ativamente imediatamente após a cirurgia. Recomenda-se a manter os ratos em grupos sociáveis.
   6. Para lesões crônicas deixar um tempo de sobrevivência dos animais de cinco semanas antes da ressecção da cicatriz. Siga os passos 1.4.

Resultados

Tissue Preservation, axonal rebrota e benefício funcional de MMS Implantação após aguda transecção completa da medula espinhal
Demonstrou-se que a implantação aguda dos MMS estabilizado os cotos medula espinal completamente seccionada e diminuição da contracção do tecido (Figura 2A contra B). Como visualizado por coloração com Tricromo em cortes sagitais, a coloração verde do tecido conjuntivo fibrótico da cicatriz no núc...

Discussão

Aqui duas abordagens cirúrgicas diferentes são apresentados para colmatar as lacunas de tecido da medula espinhal após o implante (1) aguda transecção completa e MMS e (2) lesão medular crônica e remoção da cicatriz fibrosa mais implantação de matriz PEG. Ambas as estratégias de levar a conservação de tecidos e de regeneração axonal, bem como a melhoria funcional significativa locomotora dos animais tratados. Para MMS implantação de uma fixação adequada do MMS dentro da medula espinhal pela sutura dura firme após a ciru...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8.170.041.000
esponja de gelatina Gelastypt	Selante Nescofilm sanofi Aventis	PZN-8789582
	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurano)	Abbvie
Kodan (desinfetante de pele)
Histoacryl (cola de tecido)
Friedman-Pearson Rongeur, copo de 1 mm, reto	Ferramentas Fine Science	16020-14
Micro Espátula Dois-em-um - 12 cm	Ferramentas de Ciência Fina	10091-12
Dumont #7 Fórceps - Inox Medical	Ferramentas de Ciência Fina	11273-20
Dumont #5/45 Fórceps - Inox Medical	Ferramentas Fine Science	11253-25
Gancho para medula espinhal	Ferramentas de Ciência Fina	10162-12
Tesouras	Grampo Fine Science Tools	14078-10
	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Pinça anatômica	Ferramentas de Ciência Fina	11000-13
Auto-retencionador	Fine Science Tools	17008-07
Grampo de pele	Ferramentas de Ciência Fina	13008-12
Aluspray	Selectavet