Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.
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Artigo de método
Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós apresentamos uma técnica que combina um protocolo in vitro injecção traçador, que utiliza uma série de impulsos eléctricos e de pressão para aumentar a absorção do corante através de electroporação em explantes de cérebro com iluminação laser direcionados e correspondentes óculos com filtro durante o procedimento. A técnica descrita de electroporação in vitro, por si só produz relativamente bom controlo visual para o objectivo de certas áreas do cérebro. Combinando-a com excitação laser de marcadores genéticos fluorescentes e sua leitura através de óculos de proteção do filtro de passagem de banda, o que pode pegar as emissões das células geneticamente marcadas / núcleos e o corante de rastreamento fluorescente, um pesquisador pode aumentar substancialmente a precisão das injeções encontrando a área de interesse e para controlar a propagação de corante / absorção na área de injecção muito mais eficientemente. Além disso, a técnica de iluminação do laser permite estudar a funcionalidade de um determinado neurocircuit por provIding informações sobre o tipo de neurónios que se projectam para uma determinada área em casos em que a expressão da GFP está relacionada com o tipo de transmissor expressa por uma sub-população de neurónios.
Introdução
A fim de estabelecer um certo (micro) circuito neuronal, deve-se começar por encontrar os vários participantes do referido circuito, e seu padrão de conexão. Desde a publicação de Waller sobre rastreamento através de Lesão uma grande variedade de técnicas de rastreamento neuroanatomical neurofiber foi estabelecida. Algumas destas técnicas podem ser aplicadas no tecido fixa post mortem 2-4, outros contam com o transporte activo do corante em neurónios vivos, como descoberto em 1971 5-6. Os últimos podem ainda ser subdivididos em dois grupos que discriminam entre os métodos aproveitando retrógrada activo (a partir da zona injectada para....
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Protocolo
1. A genotipagem Optical
1. Optical Genotipagem do mouse filhotes de cachorro
- Entrada para a expressão do respectivo marcador fluorescente usando um ponteiro laser do comprimento de onda de excitação apropriado (405 nm, nas experiências descritas aqui) e correspondente óculos de filtro de bloqueio do comprimento de onda de excitação, mas passando o comprimento de onda de emissão (450 - 700 nm, nas experiências descritas aqui) . Apontar o ponteiro laser na parte posterior da cabeça ou espinal medula de rato a pup (ver Figura 1). Evitar que brilha o laser para os olhos e longa exposição da pele à luz laser.
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Resultados
As Figuras 1 e 2 mostram como o ponteiro laser e óculos de laser podem ser usados de forma rápida e barata genótipo animais positivos para GFP de uma ninhada. Em casos de jovens filhotes de rato, a técnica pode ser utilizada para identificar de forma não invasiva etiqueta GFP em cérebros do animal através do crânio e a pele sobrejacente (Figura 1A - D). A fluorescência emitida pode ser visto através da pele e o crânio de filhotes de rato, pelo menos até ao dia pós-natal 3 (Fig.......
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Discussão
A força geral de in vitro tracer eletroporação, ao contrário de estudos in vivo de rastreamento, é que ele dá aos pesquisadores um melhor acesso à área do cérebro de juros e, portanto, não envolve estereotáxica caro (e muitas vezes eletrofisiológico) equipamentos. Além disso, o período de sobrevivência requerido para os explantes cerebrais abrange apenas algumas horas (1 - 4) em vez de dias ou mesmo semanas, no caso de in vivo injecções marcador (ver uma revisão detalhada sobre a utilização de.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Financiado pelo NIH / NIDCD R01 DC 011582. experimentos de imagem foram realizados na Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus Avançado Microscopia de Luz Núcleo apoiado em parte pelo NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Número UL1 RR025780 e os Transtornos Rocky Mountain Neurlogical Núcleo Centro Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac, do Instituto Salk nos forneceu os ratos GLYT2-GFP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S7653 | Todos os produtos químicos são da Sigma-Aldrich, salvo indicação em contrário. |
| Cloreto de potássio | P9333 | ||
| Fosfato de potássio monobásico | P5655 | ||
| Fosfato de sódio di-básico | S907 | ||
| Cloreto | M2670 | ||
| Cloreto | C5080 | ||
| Glicose | G7528 | ||
| Bicarbonato | S6297 | ||
| Ácido | A4544 | ||
| Mio-inositol | I5125 | ||
| Piruvato de sódio | P2256 | ||
| de soro bovino | A2153 | opcional, para (imuno)histoquímica adicional | |
| Triton-X-100 | X100 | opcional, para (imuno)histoquímica adicional | |
| Poli(etilenoglicol), 8000 MW | P2139 | opcional, para limpeza | |
| cerebral Formamida | Fisher Scientific | F84 | opcional, para limpeza cerebral |
| Cólera | |||
| Sondas Moleculares | Dextrano tetrametil-rodamina | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescente Nissl | Invitrogen | N-21479 (azul) | |
| opcional Paraformaldeído | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Filamentos de vidro borossilicato | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Extrator de pipetas | Zeitz Instruments, Alemanha | Extrator | |
| Configuração de perfusão | Ponteiro laser personalizado | ||
| laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | ||
| Filtro/óculos de segurança | Dragon Lasers, China | LSG09 (passagem de banda 450-700 nm) | |
| Microscópio bionocular | Wild Heerbrugg, Suíça | Wild M3 | Equipado com iluminador de alta intensidade (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC com software MC Stimulus instalado | Sistemas multicanais, Alemanha (software) | ||
| Estimulador de 2 canais | Sistemas multicanais, Alemanha | STG-1002 | |
| Unidade de isolamento de estimulação | A.M.P.I., Israel | Micromanipulador Iso-Flex | |
| Narishige, Japão | YOU-1 | ||
| Vibratome | Leica, Alemanha | VT1000S |
Referências
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L.
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Reimpressões e permissões
