Artigo de método

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

DOI:

10.3791/53340

⸱

29 de dezembro de 2015

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muitos dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para uso no estudo da eletrotaxia. No entanto, nenhum desses chips permite o estudo eficiente dos efeitos simultâneos de campo químico e elétrico (EF) nas células. Desenvolvemos um dispositivo à base de polimetilmetacrilato que oferece FE coexistente melhor controlada e estimulação química para uso em pesquisa de eletrotaxia.

Resumo

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O comportamento de migração direccional de células sob uma corrente eléctrica directa de campo (dcEF) é referido como electrotaxis. O papel fisiológico significativo de dcEF em guiar o movimento de células durante o desenvolvimento embrionário, a diferenciação celular, a cicatrização de feridas e tem sido demonstrada em vários estudos. Através da aplicação de chips microfluídicos para um ensaio electrotaxis, o processo de investigação é encurtado e erros experimentais são minimizados. Nos últimos anos, os dispositivos microfluidicos feitos de substâncias poliméricas (por exemplo, polimetilmetacrilato, PMMA, ou acrílico) ou polidimetilsiloxano (PDMS) têm sido amplamente utilizados no estudo das respostas das células à estimulação eléctrica. No entanto, ao contrário de numerosos passos necessários para fabricar um dispositivo de PDMS, a construção simples e rápido dos micro chip de acrílico fl uidic o torna adequado tanto para dispositivo de prototipagem e produção. No entanto, nenhum dos dispositivos relatados facilitar o estudo da química eficiente e simultânea DCEF efeitos sobre as células. Neste relatório, nós descrevemos nosso projeto e fabricação de um chip de múltiplos canais de base acrílica dual-elétrico-campo (MDF) para investigar o efeito simultâneo de química e estimulação elétrica em células de câncer de pulmão. O chip MDF fornece oito combinações de estímulos elétricos / químicos em um único teste. O chip não só reduz drasticamente o tempo necessário experimental, mas também aumenta a precisão na electrotaxis estudos.

Introdução

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O comportamento de células aderentes que se deslocam em relação um ânodo ou cátodo sob uma corrente eléctrica directa de campo (dcEF) é referido como electrotaxis. O comportamento electrotactic de células desempenha um papel importante na embriogénese, a regeneração do nervo, e a cicatrização de feridas. 1 As células de tumor, tais como células de cancro da próstata de rato, células de cancro da mama, 2 e 3 de adenocarcinoma do pulmão de células 4-8 mostraram movimento electrotactic sob uma dcEF aplicada . O EF fisiológica foi medido em tecidos glandulares. 9,10 Electrotaxis também tem sido relatada em células de tumor da glândula associada a 2,3. Tomados em conjunto, os electrotaxis de células cancerosas é considerado um factor de metástase. 11 Controlando a orientação eléctrica de células cancerosas sob dcEF pode ser uma abordagem potencial para o tratamento futuro de cancro. No entanto, hoje, o mecanismo molecular detalhada de electrotaxis permanece controverso. Portanto, uma investigação do influence da estimulação elétrica sobre a migração de células de câncer pode facilitar o desenvolvimento de estratégias para o tratamento do câncer.

Recentemente, dispositivos bio-microfluídicos foram fabricadas para estudar as respostas celulares a fluir força de cisalhamento, 12 gradientes químicos, 13 e estímulos elétricos 4 in vitro. O fabrico de dispositivos de microfluidos que utilizam bio-polidimetilsiloxano (PDMS) ou polimetilmetacrilato (PMMA, também conhecido como acrílico) conseguiu reduzir a taxa de falha de tais experiências. Além disso, a utilização de dispositivos de microfluidos de base acrílica como um protótipo para investigar temas biológicos é mais simples do que utilizando PDMS fichas. Várias funções em dispositivos à base de acrílicos têm sido desenvolvidos para electrotaxis estudo. No entanto, nenhum dos modelos anteriores são capazes de testar simultaneamente os efeitos de várias condições químicas e o campo eléctrico sobre as células para electrotaxis estudo. Assim, foi desenvolvido um dispositivo microfluídico-o multichannel dual-elétrico-campo (MDF) de quatro canais independentes de cultura e oito condições experimentais diferentes em um único chip contendo chips.

O chip de MDF à base de acrílico, relatada pela primeira vez por Hou et ai., 8 integra estimulação eléctrica e vários canais quimicamente isolado. Estes canais quimicamente isoladas podem ser usadas para a cultura de células de diferentes tipos em um experimento. O dcEF nos canais é produzido por uma fonte de alimentação elétrica. Dois campos elétricos independentes, um com a força aplicada de campo elétrico (EFS) e outro com 0 EFS, são realizados em cada canal quimicamente isolado. Deste modo, o chip fornece EF-coexistente controlado melhor e estimulação química. Além disso, os resultados da simulação numérica da difusão química dentro do chip MDF indicar que não ocorreu contaminação cruzada entre os canais, após um período experimental de 24 horas. 8

Em comparação com o device relatado por Li et al., 14 o chip MDF fornece uma área de cultura em geral, o que permite, para posterior análise bioquímica das células estimuladas electricamente. Além disso, com a área de observação maior do chip MDF, mais células podem ser observados no teste, de modo que a análise de velocidade de migração ou direcionamento das células estimuladas electricamente é mais preciso. Os desenhos de chips de um único canal de estudos anteriores relatados por Huang et al. 4 e Tsai et al. 15 permitir que apenas um tipo de célula ou de produto químico a ser testado. No entanto, o chip de MDF podem ser utilizados para investigar os efeitos de vários produtos químicos na electrotaxis, bem como os efeitos da estimulação eléctrica sobre diferentes tipos de células. Em outras palavras, o chip MDF permite o estudo eficiente de dependências químicas de dose.

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Protocolo

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1. Projeto e Fabricação do Chip MDF

  1. Desenhe um padrão de camada de acrílico individual utilizando software comercial, como AutoCAD, e salvar o padrão.
    1. Rever o desenho do padrão de folha de acrílico de quatro camadas na Figura 1A e confirmar as conexões inter-camada.
  2. Fabricar todas as chapas acrílicas ea fita dupla face por ablação a laser utilizando um CO 2 riscador laser (Figuras 1B, 2A, e 2B). 16
    1. Ligue o riscador de laser e ligar o aparelho ao computador portátil de controle.
    2. Execute o software comercial e abrir o padrão desenhado na etapa 1.1, clicando em "arquivo padrão desenvolvido."
    3. Coloque um pedaço de folha de acrílico branco ou fita dupla face no palco XYZ do riscador laser.
    4. Definir o foco do feixe de laser na superfície da folha de acrílico ou fita adesiva de dupla face com uma auto-alignment vara fornecida pelo fabricante do riscador laser.
    5. Envie o padrão projetado para o riscador laser para usinagem direta da chapa acrílica ou fita dupla face.
  3. Retire o papel protetor das placas de acrílico usando uma pinça e soprar a superfície limpa com azoto gasoso.
  4. Empilhar as folhas de acrílico e Bond-los juntos sob uma pressão de 2 kg / cm 2, num Bonder térmico durante 45 min a 110 ° C para formar o conjunto do canal de fluxo de estimulação / eléctrica.
  5. Prepara-se o vidro de cobertura de microscópio como o substrato de cultura de células no chip.
    1. Coloque a tampa de vidro em uma tina de coloração e encher o frasco com uma diluição de dez vezes do detergente listado na lista de material.
    2. Coloque a tampa de vidro e tina de coloração em uma steri-limpador ultra-sônico e limpar o vidro da tampa para 15 min.
    3. Despeje o detergente diluído para fora da tina de coloração, encher o frasco com água destilada e repita o passo 1.5.2 3 vezes.
    4. Seque o vidro da tampa limpos por sopro com azoto gasoso antes de aderir-lo para a fita dupla face.
  6. Aderem a tampa de vidro limpos para o conjunto do canal de estimulação do fluxo / elétrico com a fita dupla face modelado no passo 1.2.
  7. Aderem 13 peças de acrílico adaptadores para as aberturas individuais em uma camada do conjunto de chips MDF com super cola. O conjunto de chip de MDF é então completo (Figura 2D).
  8. Esteriliza-se o conjunto completo de chip MDF com 30 min de irradiação UV antes de ser utilizado.

2. Configuração da Ponte de Rede do Chip MDF Sal

  1. Antes da utilização, esterilizar todos os tubos de plástico, porcas com os dedos, e tubos de microcentrífuga mostrados na Figura 3B, definindo um tempo de retenção de 15 min a 121 ° C na autoclave.
  2. Ligue os tubos Fluoroplastic (Figura 3B-i) ao conjunto de chips MDF através do meio de entradae adaptadores de saída mostrado na Figura 1A.
  3. Conecte o cone Luer do meio de entrada e saída de tubos de plástico na Figura 3B-i para o 3-way torneiras.
  4. Retirar 2,5 ml de CO 2 salina tamponada com fosfato -equilibrated (PBS) utilizando uma seringa de 3 ml e ligar-se a seringa para a torneira de 3 vias do tubo de entrada de plástico. Ligar uma seringa de 3 ml vazio à torneira de 3 vias do tubo de saída de plástico. As duas seringas são assim interligados por meio do chip de MDF.
    NOTA: Incubar a PBS no 37 ° C 5% de CO 2 incubadora de cultura de células O / N para se obter CO 2 -equilibrated PBS.
  5. Selar as aberturas do azul e os adaptadores verdes (Figura 1A) na folha de PMMA Camada 1 com nozes dedo-tight sólidos brancos (Figura 3B-iii).
  6. Preencha os canais de ponte de sal e câmaras de cultura com o CO 2 -equilibrated PBS na seringa descrito na configuração do passo 2.4. Evitara formação de bolhas.
  7. Em seguida, coloque o CO 2 -equilibrated PBS contendo chip de MDF no 37 ° C 5% CO 2 celular cultura incubadora de O / N incubação. Isso permite que o ar dissolvido na fita de dupla face para formar bolhas nas câmaras.
  8. Lave as bolhas para longe nos canais por um fluxo rápido de PBS no canal utilizando as duas seringas. Bombear o PBS e para trás, se necessário.
  9. Drenar o PBS nos canais através da torneira de 3 vias ligado ao tubo de saída média.
  10. Utilizando uma nova seringa de 3 ml, retirar 2,5 ml de CO 2 -equilibrated de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (ver passo 3.5), e substituir a seringa ligada à entrada com o novo. Reabastecer os canais com o meio.
  11. Preparação da rede de ponte de sal.
    1. Temporalmente remover os sólidos porcas (Figura 3B-III) nos adaptadores verde (Figura 1A) e injectar 3% quente (> 70 ° C) de agarose para o sal BRIdge canal através da abertura na adaptadores verde (Figura 1A).
      NOTA: Preparação de agarose quente: Dissolve-se 1,5 g de pó de agarose em 50 ml de PBS. Esterilizar por fixação de um tempo de retenção de 20 min a 121 ° C na autoclave.
    2. Pare injectando a agarose, quando o líquido enche três quartos do comprimento do canal de ponte salina.
    3. Selar os poros nos adaptadores verde (Figura 1A) apertando as porcas de sólidos (Figura 3B-III) após a injecção de agarose.
    4. Substitua as porcas sólidas sobre as placas azuis (Figura 1A) com as porcas de dedo-apertado tubulares translúcidos (Figura 3B).
    5. Carregar a 3% de agarose pré-aquecida para as porcas tubulares (Figura 3B-IV).
    6. Incorporar os eléctrodos Ag / AgCl (Figura 3B-v) nas porcas tubulares (Figura 3B-iv) antes dosolidificação da agarose.
  12. Após concluir a configuração da rede de ponte de sal, injetar as células de câncer de pulmão CL1-5 para as câmaras de cultura, uma câmara de cada vez.

3. Preparação das células cancerosas e configurar para Electrotactic Experiment

  1. Cultura regular da linha de células de câncer de pulmão CL1-5.
    1. Cultura das células de cancro do pulmão, CL1-5 obtidos a partir de Prof. Pan-Chyr Yang, 17 em meio completo num frasco de cultura de células a 37 75T ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. O meio completo é composto de DMEM e 10% de soro fetal de bovino (FBS). Sub-cultura das células a cada 3 a 4 dias. As células utilizadas para a realização de experimentos electrotaxis têm menos de 25 passagens da fonte original.
  2. Adicionar 2 ml de tampão de tripsina a 0,25% para as células em crescimento exponencial CL1-5 e incubar durante 2 minutos em 37 o ° C 5% de CO 2 incubadora para cultura de células de células detachment.
  3. Terminar o processo de desprendimento com 6 ml de meio DMEM FBS a 10% e centrifuga-se as células a 300 g durante 5 min à temperatura ambiente. Depois descarte a forma e suspender o sedimento de células com 5 ml de PBS.
  4. Contar o número de células em PBS. Então, 1 x 10 6 células e centrifugar a 300 g durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Descarte o PBS. Suspender as células pré-aquecido com CO 2 -equilibrated DMEM e ajustar a densidade celular para ser de 1 x 10 6 células / ml.
    NOTA: Incubar o meio completo no 37 ° C 5% de CO 2 incubadora de cultura de células O / N para se obter o CO 2 -equilibrated DMEM.

4. Configurar para Electrotactic Experiment

  1. A partir da saída do chip MDF, injectar 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, as células no chip.
  2. Incubar o chip MDF célula-semeado na incubadora de cultura celular (fixada em 37 ° C e 5% CO2) durante 2-4 horas.
  3. Configuração de MDF microsistema fluídico.
    1. Instale o sistema microfluídico MDF em um aquecedor de vidro transparente de óxido de índio-estanho (ITO). Medir a temperatura do chip de MDF com um termopar tipo K grampeado entre o chip de MDF e o vidro ITO. Controlar o aquecedor ITO com um controlador proporcional-integral-derivativo (PID). Defina o MDF temperatura de incubação sistema microfluídico para 37 ° C com o controlador PID.
      NOTA: O fabrico do aquecedor de ITO e a configuração do sistema de aquecimento de cultura celular são descritos em relatórios anteriores 18,19.
    2. Montar o conjunto de chips MDF com temperatura controlada no XYZ estágio motorizado controlado por computador em um microscópio invertido. O uso da platina motorizada é descrito na etapa 5.1. Bombear o meio completo para dentro das câmaras através das entradas de cultura com uma bomba de seringa de quatro canais.
  4. Bombear o meio completo para o chip de MDF com um caudal de 20 l / h. Os resíduos da cultura para foravamos é coletada nos tubos de microcentrífuga (indicados como "resíduos" na Figura 3A).
  5. Incubar as células para outra 16-18 h a 37 ° C no chip de MDF.
  6. Para substituir o meio, bombear o meio contendo 50, 25, 5 e 0 uM de inibidor de cinase, respectivamente, em cada câmara de cultura a uma taxa de fluxo de 20 mL / min durante 10 min.
    NOTA: Prepara-se uma solução estoque de 10 mM do inibidor de proteína-quinase associada a Rho-Y27632 por adição de 3 ml de água estéril para o inibidor de cinase de 10,6 mg. Dilui-se a solução stock de 10 mM para 50, 25, e 5 uM, respectivamente, usando 10% de FBS DMEM.
  7. Incubar as células em que o inibidor de cinase durante mais 60 minutos a 37 ° C. Definir a taxa de fluxo médio de 20 l / h. Use a mesma temperatura da cultura e taxa acima descrito em etapas posteriores fluir.
  8. Use fios eléctricos para ligar uma fonte de alimentação DC para o chip de MDF através dos eléctrodos de Ag / AgCl sobre o chip.
  9. Serially conectar um amperímetro in o circuito elétrico. Use o amperímetro para monitorar a corrente elétrica no chip MDF.
  10. Ligue a fonte de alimentação DC e definir o amperímetro atual para 86,94 mA, ajustando a tensão de alimentação entre 15 e 19 V.
    NOTA: Tendo em conta a lei de Ohm, E = I / (σA FEP), onde I é a corrente eléctrica que flui através do material a granel, ou seja, o meio de cultura na câmara electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 M - 1) é o condutividade do meio de cultura, um FEP (= 0,21 mm2 para uma largura de 3 mm x 0,07 mm de altura) é a área em secção transversal efectiva da câmara de electrotactic, e a corrente eléctrica (I) necessária para gerar uma 300 mV / mm EF no chip MDF é 86,94 mA.

5. Aquisição e Análise de Imagens de celular

  1. Controlar o estágio motorizado usando um programa MATLAB GUI. Com o sistema de microfluidos de MDF montado no microscope, mover o chip para as regiões de observação usando o estágio motorizado.
  2. Imagens de células gravar usando uma câmera de single-lens reflex digitais (SLR) montado no microscópio.
  3. Tome imagens microscópicas, utilizando uma lente de objectiva de 4X em intervalos de 15 minutos durante 2 horas.
  4. A análise de migração celular.
    1. Execute NIH ImageJ 1,47 V.
    2. Analisar a distância a partir do inicial para as posições finais do centróide da célula.
    3. Vá em "Arquivo" → "Importar" → "Sequência de Imagens", e importar nove imagens para análise de migração celular. A primeira imagem é o resultado do tempo zero, e a última imagem é o resultado de 120 min.
    4. Vá em "Analisar" → "Definir Medidas" e marque a caixa ao lado de "Centroid"
    5. Clique no ícone "Freehand Seleções".
    6. Descrevem a borda das células seleccionadas na primeira imagem.
    7. Vá em "Editar" → "Seleção" → "Adicionar ao Manager"
    8. Ir para o nono imagem e descrever o bordo das mesmas células seleccionadas na primeira imagem. As posições de células pode ser rastreada usando a segunda e a oitava imagens.
    9. Vá em "Editar" → "Seleção" → "Adicionar ao Manager"
    10. Repita os passos 5.4.5 a 5.4.9 para coletar dados de 90 a 100 células.
    11. Vá em "Analisar" → "Measure" para obter o resultado das posições iniciais e finais das células selecionadas.
      NOTA: a velocidade de migração é definida como o comprimento médio do movimento das células por hora. O direcionamento é definido como co-seno, onde é o ângulo entre o vector da dcEF (do ânodo para o cátodo) e o vector a partir do ponto de partida de uma célula para a sua posição final. O direcionamento é -1 para as células migram para o ânodo e um para as células que migram em direção ao cátodo. Para um grupo de aleatoriamente migradeamento de células, o direcionamento é 0. 2

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Resultados

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Fabricação e montagem do dispositivo de MDF

Um diagrama esquemático do chip MDF à base de acrílicos é mostrado na Figura 1A. Quatro placas de acrílico, uma tampa de vidro, 13 adaptadores de acrílico, e um pedaço de fita dupla face foram utilizados na montagem do chip MDF concluída (Figura 2D). Há apenas quatro canais independentes de cultura no dispositivo de ...

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Discussão

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Encontramos o processo de adesão adaptadores de acrílico para Camada 1 do chip MDF a ser complicado. A aplicação de apenas 1 a 2 ul de super-cola é suficiente para aderir firmemente o adaptador no chip MDF. Grandes quantidades de cola resultou em uma polimerização incompleta do super-cola e falta em aderir. Uma vez que os adaptadores de acrílico foram firmemente aderido no chip MDF, fuga de líquido no sistema microfluídico raramente ocorria. Além disso, O / N incubação dentro da câmara de vácuo ajudou a remover o ar pre...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado financeiramente pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan (Contrato nº. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) e o Programa de Pesquisa em Nanociência e Nanotecnologia, Academia Sinica, Taiwan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
DMEM médioGibco, Invitrogen, EUA12800-017
Soro bovino fetalGibco, Invitrogen, EUA16000-044
TripsinaGibco, Invitrogen, EUA25200-072
PBSBasic LifeBL2651
Y-27632 (cloridrato)Cayman Chemical Co10005583
agaroseLONZO, EUASeringa SeaKem LE AGAROSE
Terumo3 ml com torneira Luer cônica
de 3 viasNiprocom cone
PMMA (acrílico)HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwanespessura 1mm, 2mm
adaptador acrílicoKuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan1/4-28 porto, porca personalizada 10x10x6 mm
Thermo Fisher Scientific Inc.UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Vidro de cobertura do microscópioDeckglä ser, Alemanha24x60 mm
fita dupla face3MPET 8018
super cola3MScotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergenteFranklab, FrançaTFD4
limpador de esterilização ultrassônicoLEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonderKuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwangrupo personalizado
do LTT do scriber do laser do CO2, controladorISL-II
JETEC Electronics Co., JapenTTM-J40-R-AB,
tipo K-tipoTECPELTPK-02A
bomba de seringa de 4 canaisKdScientific, EUA250P
DCGWInstek, Taiwan
Estágio do motor XYZTanLian, EO Co. Ltd., Taiwanmicroscópio
Olympus, JapãoCKX41
câmera digital SLRCanon, Japão60D
Luer proporcional-integral-derivado (PID) de Taiwan par fonte de alimentação invertido personalizado

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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