Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Resumo

Descrevemos uma estratégia de classificação para espermátides de camundongos usando citometria de fluxo. As espermátides são classificadas em quatro populações altamente puras, incluindo espermogênese redonda (etapas 1-9 da espermiogênese), alongamento precoce (etapas 10-12 da espermiogênese), alongamento tardio (etapas 13-14 da espermiogênese) e espermátides alongadas (etapas 15-16 da espermiogênese). A coloração, o tamanho e a granulosidade do DNA são usados como parâmetros de seleção.

Resumo

A diferenciação dos espermatídeos rato é um processo crítico para a produção de uma gâmeta masculina funcional com um genoma intacto para ser transmitido à geração seguinte. Até agora, os estudos moleculares desta transição morfológica têm sido dificultados pela falta de um método que permite uma separação adequada dessas etapas importantes de diferenciação spermatid para análises subsequentes. Tentativas anteriores de gating adequada destas células usando citometria de fluxo pode ter sido difícil por causa de um aumento peculiar na fluorescência DNA em espermátides submetidos à remodelação da cromatina. Com base nesta observação, que fornecem detalhes de um simples fluxo de citometria de regime, permitindo a purificação reprodutível de quatro populações de espermatídeos rato fixas com etanol, cada um representando um estado diferente no processo de remodelação nuclear. Enriquecimento população é confirmado utilizando marcadores específicos passos e critérios morfológicos. Os espermatídeos purificados podem ser utilizados para genómico e proteomic analisa.

Introdução

As espermátides redondas haplóides se diferenciam em espermatozóides por um processo chamado espermiogênese. Isso envolve muitas etapas diferentes, incluindo a aquisição de um flagelo, remodelação da cromatina e do citoesqueleto, condensação do núcleo, bem como a perda da maior parte do citoplasma. Esses eventos celulares únicos devem ser regulados com precisão para produzir um gameta funcional maduro com um genoma intacto adequado para fertilização. A espermiogênese dificilmente pode ser estudada in vitro, uma vez que nenhum sistema de cultura celular confiável até agora foi capaz de apoiar a progressão através das diferentes etapas do processo. Além disso, as técnicas in vitro reais levam a um rendimento ruim^1,2. In vivo, transições adequadas através das diferentes etapas da espermiogênese são cruciais para a integridade funcional natural do gameta masculino. A purificação bem-sucedida das espermátides de acordo com suas etapas de diferenciação nunca foi realizada com um nível de enriquecimento suficiente para permitir a caracterização molecular da espermiogênese. Por exemplo, a purificação das principais etapas da diferenciação espermátida seria especialmente útil para estudar o acrossoma em desenvolvimento, a formação da peça intermediária³, a dinâmica da junção celular⁴, a dinâmica do RNA⁵, o processo de remodelação da cromatina^6,7 ou a estabilidade genômica⁸. A purificação das espermátides tem sido dificultada por sua transformação morfológica progressiva, pela falta de biomarcadores externos específicos do estágio conhecidos e por sua forma e tamanho peculiares.

Embora a maioria das células germinativas masculinas exiba uma relação direta entre a coloração de DNA e a ploidia (conteúdo de DNA), notamos que essa correlação positiva não é mais aplicável às espermátides. Isso decorre de nossa observação inicial de que seções de túbulos seminíferos mostram intensidade variável de coloração de DNA ao longo das diferentes etapas da espermiogênese. Embora a coloração de DNA seja consistente com seu conjunto haplóide de cromossomos das etapas 1 a 7 da espermiogênese (espermátides redondas), observamos um aumento acentuado na intensidade da fluorescência com DAPI ou SYTO 16 em torno do início da reorganização nuclear e remodelação da cromatina (etapa 8 da espermiogênese) atingindo um pico no início da condensação nuclear (etapas 11-12 da espermiogênese). Após a condensação do núcleo, a intensidade da coloração do DNA diminui até a espermiação (etapa 16 da espermiogênese). Supomos que isso provavelmente estava associado à formação de sua transição peculiar da estrutura da cromatina, onde as histonas são substituídas por protaminas. Portanto, desenvolvemos um método de citometria de fluxo confiável que permite a separação de espermátides usando a variação da intensidade do DNA das espermátides como principal parâmetro de seleção.

Uma abordagem simples de citometria de fluxo é descrita para separar espermátides de camundongos com alta pureza (95-100%) com base em seu conteúdo aparente de DNA (coloração SYTO16), tamanho e granulosidade. As espermátides são separadas em quatro populações; espermiogênese etapas 1-9, 10-12, 13-14 e 15-16. As espermátides purificadas são adequadas para análises genéticas/genômicas, bem como aplicações proteômicas, conforme descrito em uma publicação recente do nosso grupo⁹.

Protocolo

Cuidados com os animais foi em conformidade com o cuidado dos animais e uso comissão Université de Sherbrooke.

1. Tubo de Preparação

1. O dia antes da separação de células, adicionar 1-2 mL de soro bovino fetal inactivado pelo calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo, e a 15 ml e 50 ml de polipropileno tubos cónicos.
   Passo crítico: Certifique-se de que todos os tubos usados ​​no protocolo é revestido.
   Nota: revestimento FBS impede que as células germinativas de furar a parede do tubo.
2. Lentamente misturar O / N por inversão a 4 ° C para revestir uniformemente os tubos utilizando um rotor.
3. No dia seguinte, retire FBS a partir de tubos revestidos por decantação.
   1. * Passo crítico: Certifique-se de que os 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo e os 15 e 50 ml tubos utilizados para preparação de células (protocolo passos 2,1-2,11) estão completamente esvaziados de FBS para impedir Fanning (ou seja, desvio impreciso dos fluxos laterais). Usar uma pipeta de P200 para remover o FBS.
      Nota: Residual FBS em tubos antes da classificação pode levar a uma perda de células ou contaminação de outros tubos utilizados durante a separação de células,
   2. Deixar um pequeno volume residual de FBS (cerca de 100-200 mL) no 5 ml de polipropileno rodada tubos de fundo utilizados para a recolha de células purificadas.

2. Preparação celular

1. Sacrificar um rato macho sob anestesia com _O2 / isoflurano (indução 5%, em seguida, mantida a 2%), seguida _por asfixia com CO2.
2. Especial e do decapsulate ambos os testículos e mediu com pequenas tesouras em 500 ul de tampão de triagem para um tubo de 1,5 ml.
3. Lavar as células germinativas de túbulos seminíferos por gentil pipetagem cima e para baixo no tubo de 1,5 ml, com um primeiro truncado 100-1.000 ul ponta, e depois com uma ponta intacta 100-1.000 ul.
4. Remover detritos e aglomerados por uma etapa de filtração usando um filtro de células 40 pm e recolher filtrado para 50 ml prev tubo cônicoiously revestido com FBS no passo 1.
5. Lavar o filtro uma vez com tampão de triagem para um volume total de 3 ml e transferência do filtrado em tubo de 15 ml previamente revestida na etapa 1.
6. Adicionar 16 ul de EDTA 50 mM, pH 8 por mililitro de suspensão de células (48 uL de 3 ml) de modo a obter uma concentração final de EDTA a 0,8 mM.
7. Para fixar as células germinativas, adiciona-se lentamente 3 volumes de etanol gelado a 100%, utilizando uma pipeta de 10 ml com agitação suave (vórtice a baixa velocidade), a qual irá produzir uma suspensão leitosa.
   Passo crítico: adição lenta de etanol é importante e crucial para preservar a integridade da preparação de células. Notamos que a rápida adição de etanol provoca a lise celular, resultando em uma importante redução de triagem eficiência. Para obter uma suspensão de células de 3 ml, 9 ml de etanol deve ser adicionado em cerca de 1 min.
8. Incubar as células em gelo durante 15 min, com mistura ocasional por inversão.
9. Centrifugar a suspensão de células a 800 xg durante 5 min e remover a clarasobrenadante.
10. Suavemente ressuspender as células germinativas fixas em 2 ml de tampão de triagem.
11. Adicionar 4 ul de corante de ADN SYTO16 (solução 1 mM em DMSO) e incuba-se durante pelo menos 30 min (protegida da luz).
    Nota: Os melhores resultados são obtidos usando triagem SYTO16 uma vez que é um corante de ADN permeável que é facilmente incorporado nos núcleos altamente compactadas de espermatídeos.

Sorter 3. celular Set Up

Nota: Aqui, a 4 de laser (405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - verde-amarelo, 633 nm - vermelho) 20 parâmetro de separação de células BDFACSAria III é usado. O software BD FACSDiva 6.1.3 é usado para visualizar e analisar os dados. As configurações podem variar dependendo do tipo de classificador utilizado.

1. Esteriliza-se o classificador de FACS através da execução de etanol a 70% como fluido de revestimento durante o processo de encerramento de fluidos (menu "Citómetro" no software) antes da triagem. Selecione "Cytometer" na barra de ferramentas do software e escolha "sh Fluidicutdown ". Siga as etapas mencionadas pelos processos.
2. Preparar e filtrar 1x PBS com um filtro de 0,22 um, de modo a eliminar quaisquer cristais e contaminantes. Encher o reservatório de bainha para a linha de soldadura superior no interior do tanque.
3. Inicie o software e fazer o login. Comece o classificador FACS para aquecer os lasers durante pelo menos 30 minutos antes da classificação. Executar dois processos de inicialização fluídicos para lavar o etanol a partir dos fluidos. Selecione "Cytometer" na barra de ferramentas do software e escolha "startup Fluidic". Siga os passos mencionados pelos processos.
   Nota: Isso restaura fluídica com fluido de revestimento normal (1x PBS).
4. Limpe o bloco de triagem e as placas de deflexão com água destilada e seque-as completamente. Sonicar um bico de 100 | iM colocada num tubo de água destilada durante 2 minutos num banho de ultra-sons. Limpe o bico minuciosamente.
5. Inserir o bocal 100 fim na célula de fluxo e virar a alavanca de bloqueio dos ponteiros do relógio para o bocal 12posição h. Defina a pressão do invólucro a 20 psi.
6. Ligue a corrente e ajustar a amplitude de obter valores-alvo para a freqüência (cerca de 30), queda de 1 (cerca de 150) e Gap (cerca de 12) e para estabelecer um padrão de gotículas breakoff estável (poucas gotas por satélite). Desligue atenuação.
7. Certifique-se de que o fluxo é linear e atinge o centro do aspirador de resíduos, alterando o ângulo do tipo bloco. Nota: Um bocal 130 uM a 10 psi também foi testado e nenhuma diferença óbvia foi encontrado.
8. Definir atraso laser para 0 para o -77,39 azul, para o vermelho, 37,33 para o violeta e -39,85 para os lasers verde-amarelo.
9. Definir áreas de escala para 1.14 para o 1.0 azul, para o vermelho, 0,75 para o violeta e 0,96 para os lasers verde-amarelo.
10. Usando um Sort Test (na "Side Stream" janela do software), certifique-se que os fluxos secundários não são abanando. Na janela "Side Stream", ajuste os controles deslizantes de tensão de cada fluxo de lado para que eles atingiram o middlE de tubo de colheita de teste. Se o fluxo de centro não é apertado, ajustar o ^2º, 3º e 4 configurações ^th gota para restringir o fluxo de centro.
11. Inicie o Setup Cytometer e Rastreamento (CS & T) na aplicação de software (menu "Cytometer").
12. Use a configuração e acompanhamento de contas de citómetro a 1 gota por cada 350 mL de automatizar a caracterização e monitoramento do desempenho citômetro utilizando as instruções do fabricante.
13. Sair da aplicação CS & T. Aplicar configuração CS & T, certifique-se os parâmetros de transmissão ainda permitir um padrão de gotículas breakoff estável e ligue o botão Sweet Spot conforme descrito nas instruções do fabricante (na "janela breakoff").
14. Otimizar o valor Gota Delay utilizando partículas fluorescentes (ver Tabela de Materiais).
    1. Instale os tubos de coleta no suporte. Abra a porta do bloco de classificação. Na janela "Side Stream", ligue tensão, em seguida, selecione "Teste de tipo "e clique no botão Aspirador gaveta para abrir a gaveta e ter acesso aos tubos de coleta.
    2. Otimizar os fluxos laterais de forma que eles vão para o centro do tubo. Ajustar os valores e controles deslizantes conforme necessário.
    3. Feche a porta do bloco de classificação e certifique-se de ajustar o relógio comparador de obter o ponto mais brilhante pérola no centro. Gaveta resíduos Unselect, uma espécie de ensaio e de tensão. Retire os tubos de coleta.
    4. Optimizar a gota atraso de acordo com as instruções dos fabricantes.
       1. Resumidamente, agitar vigorosamente frasco grânulo e diluir 1 gota de contas em 0,5 ml de PBS.
       2. Usando as instruções dos fabricantes, definir o atraso gota usando o modelo experimento Gota Delay disponíveis no software. Como alternativa, use o recurso Auto Gota Delay para definir o atraso queda.
       3. Coloque o tubo de partículas fluorescentes e ajustar a taxa de fluxo até que a taxa limite é de aproximadamente 3.000 a 4.000 eventos / segundo. Defina o tipo de precisão "inicial" e últimaly "afinar" na janela "Ordenar disposição". Selecione o filtro óptico e classificar esferas. Ajustar a gota Atraso até ~ 100% são classificados para a esquerda.
          Nota: Este passo é crítico para certificar-se que as células de interesse espécie numa corrente de lado. Os grânulos e o filtro óptico são usados ​​para alcançar perto de um desvio de gotículas de 100%.
15. Coloque um ND (densidade neutra) filtro FSC 1.5 na extremidade esquerda do bloco detector FSC. Defina a extensão de janela para 2,00 ms e a escala FSC Área de 1,00 (no separador "Laser" na janela "Cytometer").
16. Antes de carregar o tubo de ensaio, colocar um filtro de linha de amostra de 50 um na extremidade da linha de amostra para evitar a aglomeração. Para fazer isso, selecione "Alterar Filtro de exemplo" no menu "Cytometer".
17. Teste a composição da amostra de fluido para alcançar uma boa separação sem abanando entre fluxo de lado e para impedir as células de degola para a Polipropiletubos ne.
    1. Coloque o tubo de amostra, ative as placas de deflexão e selecione "Test tipo" com a gaveta fechada. Olhe para fluxos secundários se a separação ocorre sem muito Fanning.
       Nota: A ventilação é provavelmente devido a uma elevada concentração de proteínas no tampão de amostra.
18. Coloque o tubo de amostra no instrumento FACS. Seleccionar uma amostra de agitação de 300 rpm e uma temperatura de amostra de 4 ° C. Selecione "Obter dados" no "Aquisição Dashboard".
19. Se necessário, diluir a amostra para alcançar uma taxa de eventos apropriado para um máximo de 5000 eventos / s (a uma taxa de fluxo máxima de 3.0). Estritamente respeitar estes limites de modo a manter a pureza das células separadas.
20. Para analisar e classificar as células, otimizar o valor limite FSC para eliminar detritos, sem interferir com a população de interesse. Em escala logarítmica, ajustar a tensão do detector de tubo foto-multiplicador (PMT), com o filtro de 530/30, a fim de fazer-se que o sinal de fluorescência da população total se encaixa dentro da escala, e portão na população positiva (Figura 1, porta 1).
21. Produzir um Scatter-área Forward (FSC-A) área-Side Scatter / (SSC-A) parcela da população positiva SYTO16 e ajustar o FSC-A para cerca de 110 V na escala linear, eo SSC-A para cerca de 150 V em escala logarítmica para visualizar todos os eventos enquanto excluindo muito grandes células e agregados celulares.
22. Na janela "Ordenar Layout", defina o "Classificar Precision Mode" para "pureza 4-way" (máscara Rendimento: 0, Máscara Pureza: 32, máscara de fase: 0). Selecione "Continuous" no menu "alvo Eventos" para triagem contínua.
23. Adicionar populações para classificar no campo correspondente aos tubos (na janela "Ordenar Layout"). Populações lugar com freqüências mais elevadas no meio e aqueles com freqüências mais baixas nas extremidades. Defina as placas de tensão a 2.500 V. Durante a triagem, manter a coleta de amostra tUBEs no gelo.

4. celular Seleção

1. Imediatamente antes da classificação, as células de filtro usando um filtro de 50 mm em uma previamente revestida 5 ml de polipropileno rodada tubo inferior.
2. Lavar o filtro extensivamente com 1-2 ml de tampão de triagem.
3. Células germinativas Ordenar fixas usando um classificador de células 488 nm equipado com laser seguindo o esquema gating detalhado na Figura 1. Recolha frações purificadas em 5 ml de polipropileno tubos de fundo redondo previamente revestidas no ponto 1 no gelo.
   1. Certifique-se de que 100-200 uL de SBF é mantido no interior dos tubos de recolha, para evitar a aderência das células escolhidas para a parede do tubo.
   2. Certifique-se de que a concentração de saturação é SYTO16 para evitar flutuações de fluorescência durante o período de triagem. SYTO16 está saturando quando não há nenhuma outra variação de intensidade da coloração de células no Alexa Fluor 488 parâmetro (coloração de DNA) nos gráficos de triagem. Se necessário, adicione 1 ml deSYTO16 para o tubo de triagem para atingir a saturação.
   3. Mostrar o total de eventos em um gráfico mostrando os seguintes parâmetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Seleccionar as células positivas de coloração de ADN com uma porta, como mostrado na Figura 1.
      1. Células Mostrar os porta 1 em um gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parâmetros
         1. Selecione as células com Gate 2, como mostrado na Figura 1.
         2. Células Mostrar os Gate 2 em um gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
         3. Selecione as células com portão 5 e 6 no Portão Gate 2 gráfico, como mostrado na Figura 1.
         4. Exibir separadamente Portão 5 e 6 no Portão gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
         5. Selecionar spermiogenesis passos 1-9 espermátides no Portão 5 gráfico e spermiogenesis passos 10-12 espermátides no portão 6 ilustrações, como mostrado na Figura 1.
      2. Displaycélulas do portão 1 em um gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros
         1. Selecione as células com Portão 3 e Gate 4, como mostrado na Figura 1.
         2. Exibir separadamente Portão 3 e Gate 4 de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parâmetros.
         3. Selecionar spermiogenesis passos 13-14 espermátides no gráfico Portão 3 e spermiogenesis passos 15-16 espermátides no gráfico Gate 4, como mostrado na Figura 1.

Resultados

Gating estratégia utilizada com citometria de fluxo

A Figura 1 representa a estratégia utilizada gating em citometria de fluxo para classificar quatro populações espermátide altamente puros. Resumidamente, as células com coloração positiva de ADN (Alexa Fluor 488-A) são primeiro seleccionadas com portão 1. Espermátides de spermiogenesis etapas 1-12 são seleccionado (porta 2) sobre um gráfico de pontos mostrand...

Discussão

Células espermatogênicas foram sempre um desafio para o estudo, dada a complexidade do epitélio seminífero, bem como o sucesso limitado de cultura in vitro. Ao longo dos anos, muitas abordagens para purificar as células germinais de diferentes espécies foram desenvolvidos. Técnicas de sedimentação utilizando purificação gravidade com Percoll ou gradientes de albumina do soro bovino geralmente oferecem um bom rendimento de células germinais intactas, mas falta definição adequada entre alguns tipos de células, co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Isoflurano	ABBOT	05260-05	Para anestesia de camundongos antes da eutanásia
Soro fetal bovino	Wisent	90150	Para revestimento de tubo
1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	Para preparação de tampão de classificação
HEPES	Sigma	H	Para preparação de tampão de triagem
100% Etanol	Les alcools de commerce	092-09-11N	Para fixação celular
SYTO 16	Life Technologies	S7578	Coloração de DNA
ml de polipropileno tubos de fundo redondo	BD Falcon	352063	Coleção de células classificadas
15 ml de tubos de fundo cônico de polipropileno	PROgene	1500
50 ml de tubos de fundo cônicos de polipropileno	PROgene	5000
Vaporizador anestésico TEC4	Ohmeda	1160526	Para eutanásia de rato
Tanque de gás CO2	Praxair	C799117902	Para eutanásia de rato
Tanque de gás O2	Praxair	O254130501	Para eutanásia de rato
Câmara de gás			Para eutanásia de rato
40 µ m Filtro de célula Falcon	Corning Incorporated	352340
50 μ m filtros de linha de amostra	BD Biosciences	649049
misturador Vortex	Labnet international, inc.	S0200	Para fixação celular
Centrífuga Dynac	Clay Adams	101
Celltrics 50 µ m filters	Partec	04-004-2327
Classificador de células a laser de 488 nm	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS			FBS é inativado por calor. Faça uma solução fresca, 0,22 μ m filtrado e manter a 4 ° C.