Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Resumo

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Resumo

A fagocitose é um processo fundamental através do qual as células imunes inatas engolir bactérias, células apoptóticas ou de outras partículas estranhas, a fim de matar ou neutralizar o material ingerido, ou apresentá-lo como antigénios e iniciar respostas imunes adaptativas. O pH de fagossomas é um parâmetro crítico de fissão regulação ou fusão com endomembranas e activação de enzimas proteolíticas, eventos que permitem que o vacúolo fagocítica de amadurecer em um organelo degradativa. Além disso, a translocação de ^H + é necessária para a produção de níveis elevados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), as quais são essenciais para a morte eficiente e de sinalização a outros tecidos do hospedeiro. Muitos patógenos intracelulares subverter assassinato phagocytic limitando phagosomal acidificação, destacando a importância do pH em biologia phagosome. Descrevemos aqui um método para a medição raciométrica phagosomal pH em neutrófilos usando isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com zimosano como fagocítica targets e geração de imagens de células vivas. O ensaio baseia-se nas propriedades de fluorescência do FITC, que é extinta por pH acídico, quando excitado a 490 nm, mas não quando excitado a 440 nm, permitindo a quantificação de uma relação dependente do pH, em vez de fluorescência absoluta, de um único corante. Um protocolo detalhado para a realização do corante calibração in situ e a conversão de relação a valores de pH verdadeiro também é fornecido. -Dye único raciométrica métodos são geralmente considerado superior ao comprimento de onda único ou protocolos pseudo-ratiometric dual-dye, como eles são menos sensíveis a perturbações tais como o branqueamento, o foco alterações, variações laser e rotulagem irregular, que distorcem o sinal medido. Este método pode ser facilmente modificado para medir o pH em outros tipos de células fagocíticas, e zymosan pode ser substituído por qualquer outra partícula contendo amina, a partir de drageias inertes para os microorganismos vivos. Finalmente, este método pode ser adaptada para fazer uso de outras sondas fluorescentes sensíveis a diferentes gamas de pH ou outro phagosomatividades de al, tornando-se um protocolo generalizado para a imagiologia funcional de phagosomes.

Introdução

Fagocitose, o processo pelo qual as células imunes inatas engolem grandes partículas, evoluiu do mecanismo alimentar de organismos unicelulares e envolve a ligação a um alvo, envolvendo-o com uma membrana e comprimindo a membrana para formar um vacúolo dentro do citosol chamado fagossomo. Enquanto a membrana fagossômica é derivada da membrana plasmática, a classificação ativa de proteínas e lipídios, bem como a fusão com endomembranas durante a formação do fagossomo, transformam o fagossomo em uma organela distinta dentro da célula com propriedades degradativas que permitem a morte, neutralização e quebra do material ingerido^1-3. Esse processo, chamado de maturação fagossomal, depende da entrega de uma série de enzimas proteolíticas e microbicidas, incluindo a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, que transfere elétrons para os fagossomos produzindo o forte oxidante O₂^- e suas espécies reativas de oxigênio (ROS) ^{derivadas 2,4}.

O pH luminal dos fagossomos tem uma influência profunda em vários eventos necessários para a função do fagossomo. Primeiro, o pH influencia o tráfego de endomembranas em geral, pois as mudanças conformacionais dependentes do pH dos reguladores do tráfego transmembrana alteram o recrutamento de determinantes do tráfego, como Arfs, Rabs e proteínas do revestimento vesicular, que por sua vez definem quais vesículas podem se fundir com fagossomos ^5-8. Em segundo lugar, a composição iônica do lúmen fagossômico também é transformada à medida que os fagossomos amadurecem, e alguns transportadores de íons, como o trocador Na⁺/H⁺ ou os antitransportadores Cl^-/H⁺ da família ClC, que promovem a função fagocítica, dependem da translocação H^{+ 9,10}. Da mesma forma, a produção de ROS está intimamente ligada ao pH fagossomal. As EROs e seus subprodutos oxidantes tóxicos são reconhecidos há muito tempo como cruciais para a morte fagossômica em neutrófilos ^4,11,12 e demonstraram desempenhar papéis críticos em outros fagócitos, incluindo macrófagos, células dendríticas (DCs) e ameba ^13-16. A NADPH oxidase é uma enzima eletrogênica que libera H⁺ no citosol à medida que o NADPH é consumido, e que requer a transferência simultânea de H⁺ através de canais HVCN1 companheiros ao lado dos elétrons transportados para o lúmen fagossomal, a fim de aliviar a despolarização maciça que, de outra forma, levaria à auto-inibição da enzima ^17-21. Finalmente, várias enzimas proteolíticas têm atividade ideal em diferentes pH, portanto, as mudanças de pH fagossômicas dependentes do tempo podem influenciar quais enzimas estão ativas e quando. A importância do pH fagossômico é destacada por organismos como Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis e Salmonella typherium, que subvertem a morte fagocítica, pelo menos em parte, alterando o pH fagossomal ^22-24.

Nos mamíferos, os principais fagócitos são neutrófilos, macrófagos e células dendríticas e, dependendo do tipo de célula, as alterações de pH fagossômicas dependentes do tempo podem variar amplamente e parecem desempenhar papéis diferentes. Nos macrófagos, uma acidificação forte e rápida mediada pela ATPase vacuolar da bomba de prótons dependente de ATP (V-ATPase) é um dos principais fatores que medeiam a morte ^{25-27, assemelhando-se} aos mecanismos presentes na ameba que utiliza a fagocitose como mecanismo de alimentação ²⁸. Nessas células, acredita-se que a ativação de proteases ácidas desempenhe um papel fundamental. Em contraste, a morte de neutrófilos depende mais de ROS, bem como de HOCl produzida pela mieloperoxidase (MPO)¹¹, e o pH permanece neutro ou alcalino durante os primeiros 30 minutos, acidificando apenas mais tarde ^29,30. O pH neutro tem sido sugerido para favorecer a atividade de proteases oxidativas, como certas catepsinas. Em DCs, o pH fagossômico é controverso, com alguns relatando acidificação e outros pH neutro ou alcalino ^31,32, mas ROS e pH podem influenciar profundamente a capacidade dessas células de apresentar antígenos às células T, uma de suas principais funções ³³.

É importante ressaltar que hormônios, quimiocinas e citocinas podem produzir eventos de sinalização que induzem maturação e mudanças no comportamento dos fagócitos e, por sua vez, influenciam o pH fagossomal ^34,35. Da mesma forma, medicamentos, por exemplo, a cloroquina antimalárica, que também é considerada para terapias anticancerígenas ³⁶, podem afetar o pH fagossomal e, portanto, os resultados imunológicos. Assim, uma variedade de biólogos celulares, imunologistas, microbiologistas e desenvolvedores de medicamentos podem estar interessados em medir o pH fagossomal ao buscar entender os mecanismos subjacentes aos efeitos de uma determinada interrupção genética, composto bioativo ou microrganismo nas respostas imunes inatas e adaptativas.

Aqui descrevemos um método para medir o pH fagossômico em neutrófilos que nos permitiu mostrar a importância do canal HVCN1 na regulação do pH fagossômico de neutrófilos ¹⁹. O método baseia-se na propriedade raciométrica do isotiocianato de fluoresceína (FITC), cuja emissão de fluorescência a 535 nm é sensível ao pH quando excitada a 490 nm, mas não a 440 nm ³⁷. Quando esse corante é quimicamente acoplado a um alvo, neste caso zimosano, ele pode ser seguido usando microscopia de fluorescência de campo amplo, onde as células são visualizadas à medida que fagocitam e as mudanças de pH fagossômico são medidas em tempo real à medida que o fagossomo amadurece. O pH real é então obtido realizando um experimento de calibração em que as células que fagocitaram são expostas a soluções de pH diferente que contêm os ionóforos nigericina e monensina, que permitem o rápido equilíbrio do pH dentro dos fagossomos com a solução externa. Os valores da razão são então comparados com o pH conhecido das soluções, uma curva de calibração é construída por regressão não linear e a equação resultante é usada para calcular o pH a partir do valor da razão.

Protocolo

Declaração de Ética: Todas as manipulações em animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê da Universidade de Genebra Research Animal.

1. Preparação de Metas fagocíticas

1. Adicionar 20 mg de zimosan secou-se para 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Agitar em vórtice e aquecimento num banho de água a ferver durante 10 min. Arrefecer e centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
2. Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de PBS e sonicado durante 10 minutos num banho de água sonicador. Transferir 500 uL de dois tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min.
3. Repita a lavagem com 500 mL PBS. O zimosan fervida pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C.
4. Lavar duas vezes zimosan em 500 ul preparadas de fresco 0,1 M _Na 2 CO _3, pH 9,3 como anteriormente (passo 1.2).
5. Ressuspender em 490 mL após a lavagem final. Adicionar 10 ul de 10 mg / ml de FITC dissolvido em dimetil sulfoxidE (DMSO), vortex, cobrir com folha, e incuba-se com agitação durante 4 h à TA.
6. Para remover o corante não ligado, lavar como indicado acima (passo 1.2), em primeiro lugar com 0,5 mL de DMSO + 150 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 300 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 450 ul de PBS, em seguida, apenas PBS.
7. Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro. Adicionar 1 ml de zymosan a 500 ul de PBS, vórtice, em seguida, adicionar 10 ul para a extremidade da câmara de hemocitómetro, onde se encontra com a lamela colocada sobre a grelha central. Montar o hemocitómetro em um microscópio de campo brilhante equipado com uma objectiva 20X.
8. Concentre-se no canto superior esquerdo contendo 16 quadrados e contam todas as partículas de zimosan nesta área, utilizando um contador de contagem mão. Repita com o canto inferior direito. Calcular a concentração de zimosan com a seguinte equação: concentração Zymosan = Contagem / 2 x 500 x 10 ⁴ zimosan / ml. Zimosan marcado pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C.
9. Opsonizar o wi zymosan rotuladath um anticorpo de coelho anti-zimosan na diluição 1: 100. Vortex e incubar durante 1 hora em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul de PBS como acima (passo 1.2).
   Nota: A sonicação é altamente recomendada, particularmente depois de opsonização, como zimosan tende a formar grumos que podem tornar mais difícil a análise mais tarde. A opsonização com 65% v / v de soro de rato ou humano podem ser utilizados como uma alternativa.
10. Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro como descrito nos passos de 1,7-1,8, e diluir para 100 x 10 ^{6 de} partículas / ml. A opsonização com outros estimuladores fagocíticas, tais como o complemento ou nenhuma opsonização, pode ser alternativamente realizada.

2. Live Video Microscopia

1. Isolar neutrófilos primários de ratinho, tal como descrito em detalhe noutro local ^38.
   1. Como alternativa, use qualquer tipo de célula fagocitária. Manter em gelo neutrófilos no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 5% de soro de vitelo fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a uma concentração de 10 x 10 ⁶ células / ml até estar pronto para utilização. Outros tipos de células podem ser semeadas 1-4 dias antes.
2. Adicionar 2 x 10 ⁵ (20 ul) de neutrófilos para o centro de um prato de 35 mm com fundo de vidro, gota a espalhar pela adição de 50 uL de meio e incubar a 37 ° C durante 5 min para permitir que as células a aderirem.
3. Adicionar 1 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) aquecido a 37 ° C contendo o inibidor de MPO específico hidrazida 4-aminobenzóico (4-ABH, 10 uM). Os inibidores não-específicos de MPO, tais como azida de sódio (5 mM), também podem ser usados, mas têm sido sugeridos recentemente para exercer efeitos não-específicos adicionais de pH ^39.
4. Montar o prato num microscópio de campo amplo de fluorescência equipado com um sistema de aquecimento de 37 ° C e uma objectiva de óleo de 40X. Incubar as células sem imagem durante 10 min para permitir que as células e material para equilibrar.
5. Ajuste as configurações de microscópio para adquirir uma imagem de transmissão de campo brilhante [phase ou contraste de interferência diferencial (DIC) se disponível] com 440 nm ou 490 nm de excitação e 535 nm de emissão a cada 30 seg.
6. Ajuste o tempo de exposição e freqüência de aquisição de acordo com o sistema de microscópio para evitar o excesso de fotodegradação e fototoxicidade e, dependendo das questões experimentais sejam colocadas. Comece a aquisição de imagem.
7. Após 2 minutos, adicionam-se 10 x 10 ⁶ (50 ul) pelo zimosan opsonizado com FITC para o centro do prato. Ajuste alvo: rácios de células, dependendo do tipo de fagócitos e alvo utilizado.
8. Continuar imagiologia durante 30 min. Após 30 min parar a aquisição de lapso de tempo e iniciar um temporizador. Mova o palco e capturar 10 ou mais instantâneos em diferentes campos de visão a imagem outros phagosomes, tudo dentro de 5 min.

3. Calibração e Controle de Experimentos

1. Prepare as soluções de calibração pH (receitas estão descritos na Tabela 1) antes do dia de experimento e congelar em alíquotas de 10 ml.Descongelar as soluções de calibração e aquecer até 37 ° C num banho de água. Verificar o pH com um medidor de pH e registrar o pH real de soluções.
2. Montar uma bomba peristáltica na parte inferior prato de vidro antes da aquisição da imagem e realizar microscopia de vídeo ao vivo como descrito acima (seção 2).
3. No final do período de aquisição 30 min ligar a bomba para remover a solução dentro do prato, adicionar 1 ml da primeira solução de calibração e parar a bomba.
4. Aguarde até que o sinal estabilize, geralmente 5 min. Repita com cada solução de calibração.
   1. Executar, pelo menos, uma calibração por dia experimental, calibrar e começando com o mais elevado pH e trabalhando sequencialmente para o mais baixo, bem como a partir do pH mais baixo e trabalhar sequencialmente para o mais alto.
5. Como um controlo, adicionar 100 uL de 100 uM de inibidor de NADPH-oxidase iodeto difenil propionium (DPI), diluída em HBSS para as células em 900 ul de HBSS no prato de vidro de fundo, eincube durante 10 min.
6. Comece aquisição e adicionar zymosan como acima (passo 2.7). Após 15 min de fagocitose, adicionar 10 ul de 10 mM de inibidor V-ATPase concanamycin A (ConcA) diluídos em HBSS e continuar imagiologia durante mais 15 minutos adicionais.

4. Análise

1. Análise de filmes de lapso de tempo e instantâneos fagosoma.
   Nota: As instruções a seguir são específicos para ImageJ. Passo-a-passo as instruções podem variar muito, dependendo do software utilizado, mas as funções descritas nesta seção estão disponíveis na maioria dos softwares de análise de imagem profissional.
   1. Abra as imagens com software de análise de imagem profissional. Subtrair o fundo no canal 490 por desenhar um pequeno quadrado ROI com a ferramenta de seleção polígono quadrado em uma área onde não há células e clicando em Plugins> BG Subtração de ROI. Em seguida, fazer o upload do mesmo ROI no canal 440, clicando em Editar> Seleção> Restaurar seleção e repita.
   2. Faça uma imagem de relação de 32-bit do 490 canal dividido pelo canal 440, clicando em Processo> Calculadora da imagem ..., selecionando as imagens apropriadas nos menus drop-down Image1 e Image2, em seguida, selecionando 'Divide' no menu drop-down Operação e verificando resultado caixa de seleção de 32 bits (float).
   3. Alterar tabela de consulta a codificação de cores para uma codificação de cores proporção compatível clicando Image> Tabelas de Pesquisa> Rainbow RGB. Limite a relação da imagem para eliminar a 0 e infinito pixels clicando Image> Adjust> Threshold .... Ajuste as barras de rolagem para que zymosan aparece em vermelho e clique em Aplicar, certificando-se os Set pixels de fundo caixa de seleção para NaN é selecionado.
   4. Combine isso pilha relação com o canal de campo brilhante em um composto multi-canal clicando em Imagem> Cor> Mesclar Canais, e seleccionando a imagem de campo brilhante no menu canal suspenso cinza ea imagem relação no menu dropdown canal verde, e seleccionando oMantenha imagens de origem check-box. Digitalizar os filmes de lapso de tempo ou instantâneos para determinar quais phagosomes estão a ser analisadas. O canal de campo brilhante é útil para este.
   5. Desenhe regiões de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção polígono oval em torno phagosomes, e adicioná-los para o gerente ROI clicando Analisar> Ferramentas> ROI Manager> Adicionar. Meça o seu rácio de intensidade zymosan clicando em Mais> Multi-Measure e de-selecionar o Uma linha fatia check-caixa por.
   6. Para filmes de lapso de tempo, trilha fagossomos um de cada vez, desenhando um ROI, digitando Ctrl + M para medir cada ponto de tempo, e movendo o ROI quando necessário para rastrear valores de intensidade ao longo do tempo. Copie as medidas da janela de resultados em um software de planilha.
      Nota: Análise de 15 (5 cursos de tempo por experimentação x 3) experiências independentes é ideal, mas mais ou menos pode ser necessária, dependendo da variabilidade observada. Guardar as ROIs é sempre recomendável. Alguns pacotes de software permitem que regi imagemstration e atualização dinâmica de ROIs, facilitando dessa parte da análise.
2. A conversão de fluorescência a valores de pH
   1. Medir a razão 490/440 para phagosomes na calibração filmes de lapso de tempo como descrito na seção 4.1.
   2. Em uma planilha, traçar os valores da relação com o tempo, e calcular os valores médios da relação de todos os phagosomes dentro do campo de visão (geralmente, entre 5-20) a partir de 5 pontos temporais no meio do período de tempo correspondente a cada calibração de pH solução. (Veja também as caixas vermelhas na Figura 5A.)
   3. Traçar estas médias de 490/440 valores da razão contra o pH de medição atual. Combinar pelo menos 3 calibrações independentes num único gráfico. Use um pacote de software estatístico ou numérica para executar uma regressão não linear (curva de melhor ajuste), geralmente a uma equação sigmoidal.
      Nota: Por exemplo, na Figura 5B a equação utilizada foi uma sigmoidal de Boltzmann [Y = Fundo + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], onde valores Y são as relações 490/440, X são os valores de pH e parte superior, inferior, parâmetros V50 e inclinação são calculados pelo software.
   4. Use a equação obtida para transformar valores da relação de pH.
      Nota: Por exemplo, na Figura 5B da equação obtida para a curva de calibração na presença de azida de sódio é Rácio 490/440 = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993-pH) /0.9291)] . Resolvendo para pH dá a seguinte equação: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))].

Resultados

A seguir, são resultados representativos para um experimento onde o pH phagosomal de neutrófilos primários de rato isolados da medula óssea de tipo selvagem ou Hvcn1 ^{- / -} ratinhos foram comparados. Para uma experiência bem sucedida, é importante para obter phagosomes suficientes dentro do campo de visão durante toda a duração do filme de lapso de tempo, evitando muitas phagosomes, que mais tarde serão mais difíceis de segmento durante a análise de imagem. A Figura 1 mostra

Discussão

Apesar de ser mais demorada do que os métodos alternativos, tais como a espectroscopia e FACS, que empregam uma estratégia semelhante de um corante utilizando sensível ao pH acoplado a alvos mas medir o pH médio de uma população de fagossomas, microscopia oferece várias vantagens. Primeiro é que interno e externo ligado, mas não internalizadas, as partículas podem facilmente ser distinguidos sem ter que adicionar outros produtos químicos, tais como azul de tripano ou anticorpos, para extinguir ou rotular partículas exte...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Zymosan A pó	Sigma-Aldrich	Z4250	Existem vários fornecedores
Isotiocianato de fluoresceína	Sigma-Aldrich	F7250	Existem vários fornecedores
Anticorpo anti-zymosan (Zymosan A Reagente de opsonização de biopartículas)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 é um produto equivalente. Alternativamente, o soro a 25% pode ser usado como reagente opsonizante.
4-Hidrazida aminobenzóica (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Cloreto de difenilenoiodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Concanamicina A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Life Technologies	14200-075	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Solução salina balanceada de Hank	Life Technologies	14025092	Solução salina balanceada de Ringer ou outros tampões fisiológicos claros podem ser substituído.
Carbonato de sódio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Existem vários fornecedores
Ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Existem vários provedores
Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Existem vários fornecedores
N-Metil-D-glucamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Existem vários provedores
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetracético (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Existem vários fornecedores
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Existem vários provedores
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Existem vários fornecedores
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Existem vários fornecedores
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Existem vários fornecedores
Etanol Absoluto (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Existem
vários fornecedoresPlacas de Petri de 35 mm com fundo de vidro (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Placas Ibidi µ-transparentes ou lamínulas com câmaras de imagem apropriadas podem ser substituídas Banho-maria
sonicanizante	O. Kleiner AG		Um sonicador pode ser usado em seu lugar, existem vários fornecedores de instrumentos
Hematocitômetro	Marienfeld GmbH		Existem vários fornecedores
de instrumentosMicroscópio de imagem ao vivo de campo amplo	Carl Zeiss AG		Existem vários fornecedores de instrumentos, mas o microscópio deve ser capaz de gerar imagens de excitação/emissão 440/535 e 490/535, respectivamente. As configurações confocais de disco giratório com recursos de campo claro podem ser substituídas, mas o zymosan tende a ficar fora de foco com mais frequência.
Bomba peristáltica (Dynamax RP-1)	Rainin		Existem vários fornecedores de instrumentos
Medidor de pH	Schott Gerate GmbH		Existem vários fornecedores de instrumentos
Manual Counter	Milian SA		Existem vários fornecedores de instrumentos