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Fagocitose, o processo pelo qual as células imunes inatas engolem grandes partículas, evoluiu do mecanismo alimentar de organismos unicelulares e envolve a ligação a um alvo, envolvendo-o com uma membrana e comprimindo a membrana para formar um vacúolo dentro do citosol chamado fagossomo. Enquanto a membrana fagossômica é derivada da membrana plasmática, a classificação ativa de proteínas e lipídios, bem como a fusão com endomembranas durante a formação do fagossomo, transformam o fagossomo em uma organela distinta dentro da célula com propriedades degradativas que permitem a morte, neutralização e quebra do material ingerido1-3. Esse processo, chamado de maturação fagossomal, depende da entrega de uma série de enzimas proteolíticas e microbicidas, incluindo a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH) oxidase, que transfere elétrons para os fagossomos produzindo o forte oxidante O2- e suas espécies reativas de oxigênio (ROS) derivadas 2,4.
O pH luminal dos fagossomos tem uma influência profunda em vários eventos necessários para a função do fagossomo. Primeiro, o pH influencia o tráfego de endomembranas em geral, pois as mudanças conformacionais dependentes do pH dos reguladores do tráfego transmembrana alteram o recrutamento de determinantes do tráfego, como Arfs, Rabs e proteínas do revestimento vesicular, que por sua vez definem quais vesículas podem se fundir com fagossomos 5-8. Em segundo lugar, a composição iônica do lúmen fagossômico também é transformada à medida que os fagossomos amadurecem, e alguns transportadores de íons, como o trocador Na+/H+ ou os antitransportadores Cl-/H+ da família ClC, que promovem a função fagocítica, dependem da translocação H+ 9,10. Da mesma forma, a produção de ROS está intimamente ligada ao pH fagossomal. As EROs e seus subprodutos oxidantes tóxicos são reconhecidos há muito tempo como cruciais para a morte fagossômica em neutrófilos 4,11,12 e demonstraram desempenhar papéis críticos em outros fagócitos, incluindo macrófagos, células dendríticas (DCs) e ameba 13-16. A NADPH oxidase é uma enzima eletrogênica que libera H+ no citosol à medida que o NADPH é consumido, e que requer a transferência simultânea de H+ através de canais HVCN1 companheiros ao lado dos elétrons transportados para o lúmen fagossomal, a fim de aliviar a despolarização maciça que, de outra forma, levaria à auto-inibição da enzima 17-21. Finalmente, várias enzimas proteolíticas têm atividade ideal em diferentes pH, portanto, as mudanças de pH fagossômicas dependentes do tempo podem influenciar quais enzimas estão ativas e quando. A importância do pH fagossômico é destacada por organismos como Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis e Salmonella typherium, que subvertem a morte fagocítica, pelo menos em parte, alterando o pH fagossomal 22-24.
Nos mamíferos, os principais fagócitos são neutrófilos, macrófagos e células dendríticas e, dependendo do tipo de célula, as alterações de pH fagossômicas dependentes do tempo podem variar amplamente e parecem desempenhar papéis diferentes. Nos macrófagos, uma acidificação forte e rápida mediada pela ATPase vacuolar da bomba de prótons dependente de ATP (V-ATPase) é um dos principais fatores que medeiam a morte 25-27, assemelhando-se aos mecanismos presentes na ameba que utiliza a fagocitose como mecanismo de alimentação 28. Nessas células, acredita-se que a ativação de proteases ácidas desempenhe um papel fundamental. Em contraste, a morte de neutrófilos depende mais de ROS, bem como de HOCl produzida pela mieloperoxidase (MPO)11, e o pH permanece neutro ou alcalino durante os primeiros 30 minutos, acidificando apenas mais tarde 29,30. O pH neutro tem sido sugerido para favorecer a atividade de proteases oxidativas, como certas catepsinas. Em DCs, o pH fagossômico é controverso, com alguns relatando acidificação e outros pH neutro ou alcalino 31,32, mas ROS e pH podem influenciar profundamente a capacidade dessas células de apresentar antígenos às células T, uma de suas principais funções 33.
É importante ressaltar que hormônios, quimiocinas e citocinas podem produzir eventos de sinalização que induzem maturação e mudanças no comportamento dos fagócitos e, por sua vez, influenciam o pH fagossomal 34,35. Da mesma forma, medicamentos, por exemplo, a cloroquina antimalárica, que também é considerada para terapias anticancerígenas 36, podem afetar o pH fagossomal e, portanto, os resultados imunológicos. Assim, uma variedade de biólogos celulares, imunologistas, microbiologistas e desenvolvedores de medicamentos podem estar interessados em medir o pH fagossomal ao buscar entender os mecanismos subjacentes aos efeitos de uma determinada interrupção genética, composto bioativo ou microrganismo nas respostas imunes inatas e adaptativas.
Aqui descrevemos um método para medir o pH fagossômico em neutrófilos que nos permitiu mostrar a importância do canal HVCN1 na regulação do pH fagossômico de neutrófilos 19. O método baseia-se na propriedade raciométrica do isotiocianato de fluoresceína (FITC), cuja emissão de fluorescência a 535 nm é sensível ao pH quando excitada a 490 nm, mas não a 440 nm 37. Quando esse corante é quimicamente acoplado a um alvo, neste caso zimosano, ele pode ser seguido usando microscopia de fluorescência de campo amplo, onde as células são visualizadas à medida que fagocitam e as mudanças de pH fagossômico são medidas em tempo real à medida que o fagossomo amadurece. O pH real é então obtido realizando um experimento de calibração em que as células que fagocitaram são expostas a soluções de pH diferente que contêm os ionóforos nigericina e monensina, que permitem o rápido equilíbrio do pH dentro dos fagossomos com a solução externa. Os valores da razão são então comparados com o pH conhecido das soluções, uma curva de calibração é construída por regressão não linear e a equação resultante é usada para calcular o pH a partir do valor da razão.