Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Resumo

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Resumo

A fagocitose é um processo fundamental através do qual as células imunes inatas engolir bactérias, células apoptóticas ou de outras partículas estranhas, a fim de matar ou neutralizar o material ingerido, ou apresentá-lo como antigénios e iniciar respostas imunes adaptativas. O pH de fagossomas é um parâmetro crítico de fissão regulação ou fusão com endomembranas e activação de enzimas proteolíticas, eventos que permitem que o vacúolo fagocítica de amadurecer em um organelo degradativa. Além disso, a translocação de ^H + é necessária para a produção de níveis elevados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), as quais são essenciais para a morte eficiente e de sinalização a outros tecidos do hospedeiro. Muitos patógenos intracelulares subverter assassinato phagocytic limitando phagosomal acidificação, destacando a importância do pH em biologia phagosome. Descrevemos aqui um método para a medição raciométrica phagosomal pH em neutrófilos usando isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com zimosano como fagocítica targets e geração de imagens de células vivas. O ensaio baseia-se nas propriedades de fluorescência do FITC, que é extinta por pH acídico, quando excitado a 490 nm, mas não quando excitado a 440 nm, permitindo a quantificação de uma relação dependente do pH, em vez de fluorescência absoluta, de um único corante. Um protocolo detalhado para a realização do corante calibração in situ e a conversão de relação a valores de pH verdadeiro também é fornecido. -Dye único raciométrica métodos são geralmente considerado superior ao comprimento de onda único ou protocolos pseudo-ratiometric dual-dye, como eles são menos sensíveis a perturbações tais como o branqueamento, o foco alterações, variações laser e rotulagem irregular, que distorcem o sinal medido. Este método pode ser facilmente modificado para medir o pH em outros tipos de células fagocíticas, e zymosan pode ser substituído por qualquer outra partícula contendo amina, a partir de drageias inertes para os microorganismos vivos. Finalmente, este método pode ser adaptada para fazer uso de outras sondas fluorescentes sensíveis a diferentes gamas de pH ou outro phagosomatividades de al, tornando-se um protocolo generalizado para a imagiologia funcional de phagosomes.

Introdução

Fagocitose, o processo pelo qual as células imunes inatas engolem grandes partículas, evoluiu do mecanismo alimentar de organismos unicelulares e envolve a ligação a um alvo, envolvendo-o com uma membrana e comprimindo a membrana para formar um vacúolo dentro do citosol chamado fagossomo. Enquanto a membrana fagossômica é derivada da membrana plasmática, a classificação ativa de proteínas e lipídios, bem como a fusão com endomembranas durante a formação do fagossomo, transformam o fagossomo em uma organela distinta dentro da célula com propriedades degradativas que permitem a morte, neutralização e quebra do material ingerido^1-3. Esse processo, chamado de m....

Protocolo

Declaração de Ética: Todas as manipulações em animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê da Universidade de Genebra Research Animal.

1. Preparação de Metas fagocíticas

1. Adicionar 20 mg de zimosan secou-se para 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Agitar em vórtice e aquecimento num banho de água a ferver durante 10 min. Arrefecer e centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
2. Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de PBS e sonicado durante 10 minutos num banho de água sonicador. Transferir 500 uL de dois tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5....

Resultados

A seguir, são resultados representativos para um experimento onde o pH phagosomal de neutrófilos primários de rato isolados da medula óssea de tipo selvagem ou Hvcn1 ^{- / -} ratinhos foram comparados. Para uma experiência bem sucedida, é importante para obter phagosomes suficientes dentro do campo de visão durante toda a duração do filme de lapso de tempo, evitando muitas phagosomes, que mais tarde serão mais difíceis de segmento durante a análise de imagem. A Figura 1 mostra

Discussão

Apesar de ser mais demorada do que os métodos alternativos, tais como a espectroscopia e FACS, que empregam uma estratégia semelhante de um corante utilizando sensível ao pH acoplado a alvos mas medir o pH médio de uma população de fagossomas, microscopia oferece várias vantagens. Primeiro é que interno e externo ligado, mas não internalizadas, as partículas podem facilmente ser distinguidos sem ter que adicionar outros produtos químicos, tais como azul de tripano ou anticorpos, para extinguir ou rotular partículas exte.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Zymosan A pó	Sigma-Aldrich	Z4250	Existem vários fornecedores
Isotiocianato de fluoresceína	Sigma-Aldrich	F7250	Existem vários fornecedores
Anticorpo anti-zymosan (Zymosan A Reagente de opsonização de biopartículas)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 é um produto equivalente. Alternativamente, o soro a 25% pode ser usado como reagente opsonizante.
4-Hidrazida aminobenzóica (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Cloreto de difenilenoiodonium (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Concanamicina A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Life Technologies	14200-075	Tóxico, use luvas, existem vários fornecedores
Solução salina balanceada de Hank	Life Technologies	14025092	Solução salina balanceada de Ringer ou outros tampões fisiológicos claros podem ser substituído.
Carbonato de sódio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Existem vários fornecedores
Ácido 2-(N-Morfolino)etanossulfônico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Existem vários provedores
Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Existem vários fornecedores
N-Metil-D-glucamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Existem vários provedores
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N′,N′-ácido tetracético (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Existem vários fornecedores
Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Existem vários provedores
Cloreto de potássio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Existem vários fornecedores
Cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Existem vários fornecedores
Cloreto de magnésio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Existem vários fornecedores
Etanol Absoluto (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Existem
vários fornecedoresPlacas de Petri de 35 mm com fundo de vidro (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Placas Ibidi µ-transparentes ou lamínulas com câmaras de imagem apropriadas podem ser substituídas Banho-maria
sonicanizante	O. Kleiner AG		Um sonicador pode ser usado em seu lugar, existem vários fornecedores de instrumentos
Hematocitômetro	Marienfeld GmbH		Existem vários fornecedores
de instrumentosMicroscópio de imagem ao vivo de campo amplo	Carl Zeiss AG		Existem vários fornecedores de instrumentos, mas o microscópio deve ser capaz de gerar imagens de excitação/emissão 440/535 e 490/535, respectivamente. As configurações confocais de disco giratório com recursos de campo claro podem ser substituídas, mas o zymosan tende a ficar fora de foco com mais frequência.
Bomba peristáltica (Dynamax RP-1)	Rainin		Existem vários fornecedores de instrumentos
Medidor de pH	Schott Gerate GmbH		Existem vários fornecedores de instrumentos
Manual Counter	Milian SA		Existem vários fornecedores de instrumentos