Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

Paula Nunes; Daniele Guido; Nicolas Demaurex

doi:10.3791/53402

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Artigo de método

Medindo phagosome pH Raciometrico por microscopia de fluorescência

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DOI:

10.3791/53402

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7 de dezembro de 2015

Paula Nunes¹ , Daniele Guido¹ , Nicolas Demaurex¹

¹Department of Cellular Physiology and Metabolism, University of Geneva

Neste artigo

Resumo

O pH fagossômico influencia a maturação do fagossomo, a produção de oxidantes, a morte fagossômica, bem como a apresentação do antígeno. Aqui descrevemos um método raciométrico para medir as mudanças de pH no curso do tempo e no ponto final em fagossomos individuais em fagócitos vivos usando microscopia de fluorescência.

Resumo

A fagocitose é um processo fundamental através do qual as células imunes inatas engolir bactérias, células apoptóticas ou de outras partículas estranhas, a fim de matar ou neutralizar o material ingerido, ou apresentá-lo como antigénios e iniciar respostas imunes adaptativas. O pH de fagossomas é um parâmetro crítico de fissão regulação ou fusão com endomembranas e activação de enzimas proteolíticas, eventos que permitem que o vacúolo fagocítica de amadurecer em um organelo degradativa. Além disso, a translocação de ^H + é necessária para a produção de níveis elevados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), as quais são essenciais para a morte eficiente e de sinalização a outros tecidos do hospedeiro. Muitos patógenos intracelulares subverter assassinato phagocytic limitando phagosomal acidificação, destacando a importância do pH em biologia phagosome. Descrevemos aqui um método para a medição raciométrica phagosomal pH em neutrófilos usando isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com zimosano como fagocítica targets e geração de imagens de células vivas. O ensaio baseia-se nas propriedades de fluorescência do FITC, que é extinta por pH acídico, quando excitado a 490 nm, mas não quando excitado a 440 nm, permitindo a quantificação de uma relação dependente do pH, em vez de fluorescência absoluta, de um único corante. Um protocolo detalhado para a realização do corante calibração in situ e a conversão de relação a valores de pH verdadeiro também é fornecido. -Dye único raciométrica métodos são geralmente considerado superior ao comprimento de onda único ou protocolos pseudo-ratiometric dual-dye, como eles são menos sensíveis a perturbações tais como o branqueamento, o foco alterações, variações laser e rotulagem irregular, que distorcem o sinal medido. Este método pode ser facilmente modificado para medir o pH em outros tipos de células fagocíticas, e zymosan pode ser substituído por qualquer outra partícula contendo amina, a partir de drageias inertes para os microorganismos vivos. Finalmente, este método pode ser adaptada para fazer uso de outras sondas fluorescentes sensíveis a diferentes gamas de pH ou outro phagosomatividades de al, tornando-se um protocolo generalizado para a imagiologia funcional de phagosomes.

Introdução

Fagocitose, o processo pelo qual as células imunes inatas engolem grandes partículas, evoluiu do mecanismo alimentar de organismos unicelulares e envolve a ligação a um alvo, envolvendo-o com uma membrana e comprimindo a membrana para formar um vacúolo dentro do citosol chamado fagossomo. Enquanto a membrana fagossômica é derivada da membrana plasmática, a classificação ativa de proteínas e lipídios, bem como a fusão com endomembranas durante a formação do fagossomo, transformam o fagossomo em uma organela distinta dentro da célula com propriedades degradativas que permitem a morte, neutralização e quebra do material ingerido^1-3. Esse processo, chamado de m....