Os mecanismos moleculares de descondensação da cromatina mitótica altamente compactada são mal definidos. Apresentamos um ensaio livre de células baseado em aglomerados de cromatina mitótica isolados de células HeLa e extrato de ovo de Xenopus laevis que reconstitui fielmente o processo de descondensação in vitro.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante o ciclo celular dos vertebrados, a cromatina sofre extensas mudanças estruturais e funcionais. Após a entrada mitótica, ele se condensa massivamente em cromossomos em forma de bastonete que são movidos individualmente pelo aparato do fuso mitótico. A condensação da cromatina mitótica produz cromossomos compactados cinquenta vezes mais densos como na interfase. Durante a saída da mitose, os cromossomos precisam restabelecer seu estado de interfase funcional, que é envolvido por um envelope nuclear e é competente para replicação e transcrição. O processo de descondensação é morfologicamente bem descrito, mas em termos moleculares mal compreendido: não temos conhecimento sobre os eventos moleculares subjacentes e, em grande medida, os fatores envolvidos, bem como sua regulação. Descrevemos aqui um sistema livre de células que recapitula fielmente a descondensação da cromatina in vitro, com base em aglomerados de cromatina mitótica purificados a partir de células HeLa sincronizadas e extrato de ovo de X. laevis. Nosso sistema livre de células fornece uma ferramenta importante para uma maior caracterização molecular da descondensação da cromatina e sua coordenação com processos que ocorrem simultaneamente durante a saída mitótica, como a remontagem do envelope nuclear e do complexo de poros.
Introdução
Xenopus laevis extrato de ovo é uma ferramenta poderosa e amplamente aplicada para estudar eventos celulares complicados na simplicidade de um ensaio livre de células. Desde a sua primeira descrição por Lohka & Masui 1 eles têm sido amplamente utilizados para estudar a mitose, como condensação da cromatina 2, conjunto do eixo 3, desagregação envelope nuclear 4, mas também o transporte nucleocitoplasmático 5 ou 6 DNA replicação. Os eventos que ocorrem no final da mitose, necessários para a reforma do núcleo interphasic tais como reforma envelope nuclear e poro nuclear remontagem complexo são mu....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Mitótico Chromatin Isolamento Cluster a partir de células HeLa
1. Preparativos
- Soluções de cultura de células
- Prepare meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) por adição de 10% de soro fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM para o DMEM. Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 10 mM de Na 2 HPO 4 2H 2 O e 2 mM de KH 2 PO 4, em água desionizada e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10N.
NOTA: PBS pode ser mantido como solução de r....
- Prepare meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) por adição de 10% de soro fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM para o DMEM. Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 10 mM de Na 2 HPO 4 2H 2 O e 2 mM de KH 2 PO 4, em água desionizada e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10N.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Dependência do tempo da reação descondensação
A Figura 1 mostra um típico campo de tempo do ensaio descondensação. O conjunto de cromossomas visíveis no início da reacção decondenses e funde-se com uma única volta e núcleo liso. Quando o extracto de ovo é substituído por tampão de sacarose a agrupar continua a ser condensado cromossoma, que sugerem que a actividade descondensação está presente no extracto de ovo.
Descondensação cromatina é um pro.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Xenopus laevis extractos de ovos são uma ferramenta muito útil para reproduzir fielmente processos celulares in vitro, e este sistema foi utilizado com sucesso na caracterização do ciclo celular e divisão celular eventos 2, 3,5,6,17. Devido a grandes lojas de componentes nucleares sequestrados no ovo durante a ovogênese, extratos de ovos são uma excelente fonte de componentes celulares. Em comparação com outras abordagens, como RNAi em linhas celulares de tecido de mamífero ou de .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa e da ERC (AN377 / 3-2 e 309.528 CHROMDECON para WA) e PhD Fellowship da Boehringer Ingelheim Fonds para AKS Figura 1 e 2 são reimpressos de Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., RuvB-como função ATPases na cromatina descondensação no final da mitose, 305-318, 2014, com a devida permissão de Elsevier.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| tetracloridrato de espermina | Fluka analytical | 85610-25G | |
| tricloridrato de espermidina | Sigma | S2501-5G | |
| digitonina de alta pureza | Millipore | 300410-1GM | tóxico |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | |
| timidina | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazol | Calbiochem | 487928 | solução tóxica |
| de formaldeído a 37% Solução tóxica de azul de | Roth | 7398-1 | |
| (0,4% ) | Sigma | T8154 | tóxico |
| 1,4-ditiotreitol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| cloridrato AEBSF | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatina | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptina | Roth | CN334 | |
| aprotinina | Roth | A162.3 | |
| Percoll (partículas de sílica coloidal GE | Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² frascos de cultura de tecidos | Greiner Bio-one | 658175 | |
| soro fetal bovino inativado por calor (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogeneizador (moedor de tecidos de 40 ml) | de | Neubauer 357546 | |
| 441/1 | |||
| Tubos de Centrífuga Oak Ridge, policarbonato (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µ filtro de células m, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| citocalasina B | Applichem | A7657,0010 | |
| cicloheximida | Roth | 8682.3 | |
| L-cisteína | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG disponível como Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG disponível como Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mistura de cálcio-magnésio-sal) | Enzo | ALX-450-002-M010 | |
| agulhas de seringa tóxica (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| sal dissódico de fosfato de creatina | Calbiochem | 2380 | |
| creatina fosfoquinase | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Tubos | 10236276001 | |
| PFA | Sigma | P-6148 | |
| para TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 pol.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (pontas com abertura ampla, 1.000 µ l) | Biozym | 729065 | |
| solução de glutaraldeído a 50%, grau I | Sigma alderich | G7651-10 ml | tóxico |
| 0,1% (p / v) solução de poli-L-lisina | Sigma | P8920-100 ml | |
| tubos de fundo plano (6 ml, 16,0 / 55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield meio de montagem | Vector laboratories | H1000 | |
| tubos para TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 pol.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (pontas com abertura ampla, 200 µ l) | Biozym | 729055 | |
| lamínulas de 12 mm | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Referências
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg ext....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
