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Artigo de método

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

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DOI:

10.3791/53409

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20 de novembro de 2015

 ,  ,  , 
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University, 2Department of Biomedical Sciences, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante. Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I. A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

Resumo

Acredita-se que a natureza invasiva das linhagens de células cancerígenas se correlacione com seu potencial metastático. A maioria dos ensaios tradicionais, no entanto, não examina essas características invasivas em um ambiente tridimensional e os dados resultantes sofrem de aplicabilidade biológica reduzida. Aqui é apresentada uma abordagem para visualizar a capacidade invasiva das linhagens celulares em um ambiente fisiologicamente relevante. O ensaio de invasão de esferóides de células cancerígenas primeiro utiliza a gravidade para gerar esferoides dentro de gotas de meio que ficam penduradas na tampa de uma placa de cultura de células. Em seguida, esses esferoides são incorporados em uma matriz 3D que consiste em uma mistura de materiais de membrana basal e colágeno tipo I. A saída de células cancerígenas dos esferoides para a matriz circundante é então monitorada ao longo do tempo. O método descrito aqui pode ser modificado para examinar a invasão após cocultura de diferentes tipos celulares, inclusão de drogas/inibidores ou alterações nos constituintes da matriz extracelular (MEC).

Introdução

Está provado que a motilidade célula cancerosa é preditiva do potencial metastático, uma vez que tal comportamento facilita a invasão através da membrana basal e da entrada no sistema circulatório 1. Mais investigação sobre a motilidade tem-se centrado na forma como as células se comportam de uma configuração bidimensional (2D), embora se tornando-se amplamente reconhecido que o movimento das células em uma matriz tridimensional (3D) é mais representativo de como estas mesmas células vão realmente 2 comportar in vivo. Sistemas de cultura 3D são cada vez mais usados ​​para estudar comportamentos celulares que vão desde a morfologia celular, a cinética de crescimento e de sensibilidade às drogas 3. O desejo de controlar a invasão de células do cancro no contexto de um meio 3D levou à síntese de técnicas anteriormente estabelecidas, envolvendo a geração de agregados de células de 3D ​​(esferóides) através do método de cultura de gota em suspensão 4, seguido por incorporação destes esferóides numa extracelular 3D matriz (ECM) composta de colágeno e da membrana basal materiais 5. Este método visa aperfeiçoar estas técnicas anteriormente estabelecidas, fornecendo uma abordagem simplificada que pode ser facilmente utilizado para comparar invasão sob uma variedade de condições experimentais.

Mais formas tradicionais para avaliar a motilidade celular in vitro são o ensaio da ferida-zero e o ensaio transwell 6. O primeiro ensaio de motilidade celular descreve uma configuração em 2D, e é, por conseguinte, independente de uma variedade de características críticas para a invasão in vivo, por exemplo, actividade de protease de 7. O ensaio de invasão de células Transwell pode melhor modelo, quando os insertos de cavidades são revestidas com substratos ECM, mas apenas um único parâmetro, isto é, o aparecimento de células sobre a superfície oposta da membrana é medida, e muitas nuances de invasão de células não são, portanto, facilmente observáveis. Em contraste com estas técnicas, o ensaio de invasão de células de cancro esferóide (figura 1 </ forte>) permite a monitorização em tempo real da invasão celular, num ambiente que não só é fisiologicamente relevante, mas também permite características importantes específica da linha de células a serem visualizadas, tais como migração de células indivíduo vs colectiva 8. Este método também proporciona vantagens em relação aos ensaios padrão de crescimento de cultura 3D. A geração de agregados celulares através do método de gota em suspensão inicialmente restringe o movimento celular, de modo a que as células serão incentivados a invadir após esta restrição será levantada. Além disso, uma vez que a restrição é levantada, a saída de células irá prosseguir numa direcção uniforme, que pode então ser convenientemente quantificado.

Os materiais de ECM mais populares usados ​​para esferóides ensaios de células de câncer são Matrigel e colágeno tipo I, em que cada um destes componentes tem papéis importantes e distintas em influenciar o comportamento metastático. Matrigel é uma mistura de proteínas segregadas por células de sarcoma produzidos Engelbreth Holm Swarm-rato, e é enriquecido em basemeproteínas da membrana nt, tais como laminina, entactina, e colágeno tipo IV 9. Por esta razão Matrigel é doravante referido como "materiais de membrana basal." Estes materiais de membrana basal proporcionar ligandos essenciais necessários para adesão integrina durante a invasão de células de cancro 10, além de muitas outras proteínas que exercem uma variedade de efeitos no comportamento das células 11. Em comparação, o colagénio do tipo I, geralmente preparado a partir de digestões de ácido dos tendões e outras estruturas de colagénio densas 12, é um material de matriz muito mais simples que serve como um elemento estrutural do tecido do estroma e tecidos conjuntivos de suporte e órgãos do corpo. Foi demonstrado que as características físicas do colagénio pode regular um número de características de motilidade celular; Por exemplo, o alinhamento de fibras de colagénio na interface tumor-estromal permite que as células cancerosas migram subsequentemente ao longo dessas fibrilas ao invadir o estroma 13 em. No ensaio aqui apresentado, tanto o colágeno tipo I e materiais da membrana basal são utilizados como ferramentas para estudar as interações célula de câncer 3D-estroma.

O efeito de inibição ou estimulação de caminhos que controlam invasão pode ser monitorizada após as células terem sido incorporados na matriz 3D. As células podem ser pré-tratados durante o crescimento nas gotas de suspensão ou aquando da transferência para a cultura 3D, dependendo se um tratamento prolongado será necessário para modular a invasão. Para tratamentos mais curtos, recomenda-se que a droga ser misturada com a suspensão esferóide após a recolha, assim como os meios de comunicação que vai rodear as culturas em 3D, para facilitar a exposição adequada da droga para as células. Em seguida, as células normais ou associados a tumores do estroma podem ser misturados com o material de matriz para avaliar o seu papel na modulação da invasão de células tumorais, ou para determinar o comportamento de células influências parácrino e autócrino de sinalização. Esta ideia foi demonstrado em um estudo onde a co-cultura de colsobre câncer e células endoteliais em gotas de suspensão levou a uma rede vascular dentro dos esferóides 14. Finalmente, os componentes ECM também pode ser alterado, como a invasão da célula cancerosa é afetado por diferentes substratos 15. O método apresentado abaixo, assim, fornecer um quadro para a avaliação da invasão da célula cancerosa sob uma variedade de condições. De um modo geral verificou-se que nem todas as linhas de células irá criar esferóides nas gotas de suspensão e linhas de células epiteliais de aspecto tipicamente formar esferas regulares.

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Protocolo

1. Geração de esferóides

  1. Prepare a suspensão de células individuais para pendurar culturas gota a separar culturas aderentes de células de cancro de ~ 70% de confluência utilizando uma lavagem com PBS, seguido por exposição a uma solução tripsina-EDTA 0,05%.
    1. Neutraliza-se a solução de tripsina com meio de cultura de células e contagem das células, utilizando-se uma alíquota da suspensão de células. Nota: O meio de cultura de células específico dependerá da linha celular a ser testada. Seguir as recomendações da ATCC media, onde o meio de cultura celular é normalmente de DMEM + 10% de FBS. Mais informação pode ser encontrada na Tabela Materiais.
    2. Efectuar uma diluição para permitir a sementeira de 500-1000 células por 20 ul gota de meio de cultura celular.
  2. Adquirir 10 cm de placa e adicionam-se 5 ml de PBS estéril para o fundo. Nota: Esta etapa protege o enforcamento cai de evaporação. Baixo custo "bacteriológicos" pratos grau pode ser usado em lugar de pratos de grau de cultura de células, como as células não irá contactuar a superfície de cultura.
  3. Usar uma pipeta multi-canal para transferir gotas de 20 ul da suspensão de células diluída com a superfície interna da tampa.
    1. Pipetar 40 gotas (5 linhas de 8 gotas) sobre a tampa da placa de 10 cm.
  4. Inverter a tampa e coloque sobre o prato de cultura. Incubam-se as culturas de gota em suspensão a 37 ° C durante 72 h, para gerar esferóides.
    1. Vire a tampa de uma forma confiante, ainda controlada. Nota: Inverter a tampa muito rápido ou muito lento pode causar as gotículas de mudar. Algumas linhas de células podem formar esferóides em 48 horas ou menos, enquanto outros podem exigir mais do que 72 horas para produzir agregados compactos.

2. Incorporação de Spheroids em Matrix 3D

  1. Descongelar uma aliquota de crescimento reduzida de factor porão materiais de membrana, a 4 ° C durante a noite antes de incorporação dos esferóides.
    1. Opcional: poços camada com ECM de antecedência para evitar a interação potencial esferóide com o tecido culture superfície.
      1. Pipetar 200 l de ECM por cavidade em uma placa de 24 cavidades.
      2. Inclinar a placa para assegurar que a ECM cobre toda a superfície dos poços.
      3. Retirar cuidadosamente o excesso ECM com uma pipeta.
      4. Incubar a placa até que os poços estão secas: 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
  2. Recolher os esferóides inclinando a tampa da placa de cultura de tecidos e de partilha dos meios de comunicação. Transferir os meios de comunicação com os esferóides em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Permitir que 10 min durante os esferóides para assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Esferóides deve ser visível a olho nu.
  4. Misturar 100 mL de materiais de membrana basal com 100 ul de frio (4 ° C) colagénio do tipo I, em um tubo pré-refrigerada separada. Manter-se a mistura a 4 ° C para evitar qualquer gel solidifique prematuramente.
    1. Utilize pontas de pipetas pré-refrigerados se transferir pequenos volumes.
    2. Dê cuidado aomisturando o material de membrana basal e colágeno tipo I para evitar a formação de bolhas de ar. Nota: As bolhas de ar podem dificultar a imagiologia mais tarde no protocolo de se tornar incorporado no gel.
  5. Aspirar os esferóides a partir da porção inferior 40 ul do tubo de microcentrífuga, e combinar com o material da membrana basal / mistura de colagénio do tipo I. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar quando a mistura. Nota: A solução contendo 100 ul de materiais de membrana basal, 100 ul de colagénio do tipo I, e 40 ul de esferóides criará material suficiente para 4 3D culturas independentes. Isto pode ser escalado para cima ou para baixo.
  6. Pipetar 40 ul de gotas da mistura viscosa para os centros das cavidades de uma placa de 24 poços. Manter o nível de placa para evitar que a mistura de correr para o lado do poço. Nota: Uma coluna única na placa de 24 cavidades - 4 poços - é recomendado para cada condição a ser testado.
  7. Colocar a placa intoa 37 ° C incubadora e deixar em repouso por 30 min. A cultura 3D irá polimerizar durante este período.
  8. Lentamente submergir as culturas 3D em 1 mL de meios de cultura celular.
    1. Certifique-se de que a mídia está quente ao adicioná-lo nos poços para promover ainda mais a polimerização gel.
    2. Passo crítico: Delicadamente adicionar a mídia para as culturas 3D. Pipetando os meios muito rapidamente nas cavidades pode levar ao descolamento das culturas em 3D a partir da superfície da cultura de tecidos.

3. Monitoramento e Análise Spheroid Invasion

  1. Invasão imagem dos esferóides na matriz 3D circundante em pontos de tempo decidido pelo investigador. Adquirir fotografias usando um microscópio invertido com a lente objetiva de 20x. Nota: Ideal pontos de tempo irá variar de acordo com a linha de células que está sendo testado. Linhas de células mais invasivos começará sua saída dos esferóides logo após o plaqueamento e, portanto, levar fotografia inicials dentro de um par de horas após o plaqueamento. Geralmente, as fotografias são tiradas a 0 h (após o plaqueamento), 24 horas e 48 horas. Invasão conclui tipicamente de 24 a 48 h após o plaqueamento.
  2. Quantificar a capacidade invasiva utilizando software de análise de imagem como Imagem J.
    1. Analise invasão celular como a distância a partir da borda do esferóide.
      1. Use a ferramenta straight draw para marcar o raio e / ou a distância máxima invasiva.
      2. Clique em "Analisar" no menu superior e clique em "Measure" para exibir a medição do comprimento.
    2. Analisar invasão como a área total invasiva fora do esferóide.
      1. Use a ferramenta de desenhar à mão livre para traçar a fronteira do esferóide e / ou total área invasiva.
      2. Clique em "Analisar" no menu superior e clique em "Measure" para exibir a medição da área.
    3. Use um plugin como ROI Ferramentas do Gerenciador de criar medidas para uma pilha de imagens.

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Resultados

Usando o ensaio de invasão esferóide (figura 1), um painel de linhas celulares de cancro foi testado quanto à sua capacidade para formar esferóides, bem como para a quantidade de egresso de células expostas após o implante numa matriz 3D que consiste em materiais de membrana basal e colagénio tipo I (Tabela 1). Estes resultados demonstram que nem toda linha celular de cancro criará esferóides bem formadas, onde as linhas de células que possuem uma morfologia epitelial in vitro,...

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Discussão

Este estudo foi avaliado o desempenho de um painel de linhas celulares de cancro em um ensaio de invasão esferóide (Tabela 1). De um modo geral, descobrimos que a formação do esferóide é aumentada em mais as linhas de células epiteliais de aspecto, em que a presença de junções célula-célula promove a formação de uma arquitectura do tipo esferóide. Linhas celulares conhecidas que foram submetidos a uma transição epitelial-mesenquimal, tais como MDA-MB-231 não formar esferóides na cultura de gota suspensa...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Financiado pelo NIH CA051008 subvenções P30 CA009686 e T32 (ATR).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Matrigel Fator de Crescimento ReduzidoCorningCB-40234
Colágeno Tipo I, Cauda de Rato, 100 mgMillipore08-115
DMEMLife Technologies11995-065
RPMI 1640 Médio Life Technologies11875-093
PBSLife Technologies10010-023
0.05% Tripsina-EDTALife Technologies25300-054
Soro Fetal Bovino, Inativado por CalorOmega ScientificFB-12
100 mm Pratos tratados com TCCorning Incorporated430167
24 poçosNEST Biotecnologia702001
Olympus IX-71 Microscópio Invertido
As linhagens celulares foram mantidas em DMEM + 10% FBS, com a expectativa de células BT-474 e LNCaP, que foram mantidas em RPMI + 10% FBS.

Referências

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