Artigo de método

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

DOI:

10.3791/53456

⸱

2 de abril de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

Neste artigo

Resumo

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A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Resumo

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A imagem in vivo fornece acesso sem precedentes ao comportamento dinâmico das estruturas celulares e subcelulares em seu contexto natural. A realização de tais experimentos de imagem em vertebrados superiores, como mamíferos, geralmente requer acesso cirúrgico ao sistema em estudo. A acessibilidade óptica do peixe-zebra embrionário e larval permite que esses procedimentos invasivos sejam contornados e permite imagens no organismo intacto. De fato, o peixe-zebra é agora um modelo bem estabelecido para visualizar comportamentos celulares dinâmicos usando microscopia in vivo em uma ampla gama de contextos de desenvolvimento, desde a proliferação até a migração e diferenciação. Um desenvolvimento mais recente é o uso crescente de peixe-zebra para estudar eventos subcelulares, incluindo tráfego mitocondrial e dinâmica de centrossomas. A relativa facilidade com que essas estruturas subcelulares podem ser geneticamente marcadas por proteínas fluorescentes e o uso de técnicas de microscopia de luz para imaginá-las está transformando o peixe-zebra em um modelo in vivo de biologia celular. Aqui descrevemos métodos para gerar construções genéticas que marcam organelas fluorescentemente, destacando mitocôndrias e centrossomas como exemplos específicos. Usamos o sistema bipartido Gal4-UAS em várias configurações para restringir a expressão a tipos de células específicos e fornecer protocolos para gerar peixes transgênicos estáveis e com expressão transitória. Finalmente, fornecemos diretrizes para a escolha de métodos de microscopia de luz mais adequados para a dinâmica subcelular de imagens.

Introdução

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Na imagem in vivo proporciona a visualização direta de comportamentos celulares no contexto mais fisiológica. A transparência de embriões de peixe-zebra, o seu desenvolvimento rápido e externa e uma rica variedade de ferramentas genéticas que permitem a marcação fluorescente têm contribuído para o crescente uso de microscopia in vivo para elucidar a dinâmica dos eventos fundamentais de desenvolvimento. Estudos de imagem do desenvolvimento do sistema nervoso no peixe-zebra tem, por exemplo, expandiu enormemente o nosso conhecimento do comportamento das células progenitoras neurais eo destino de seus descendentes, incluindo a sua subseqüente migração, diferenciação e integração de circuitos 1-8.

O palco já está definido para investigar a dinâmica subcelulares subjacentes a esses comportamentos celulares. De fato, peixe-zebra já estão sendo exploradas como ferramentas para a biologia celular vivo. Agora é possível visualizar mitocôndrias 9-11, centrossomas 2,8,12-14, Golgi 15, O citoesqueleto de microtúbulos 4 e actina 16, endossomas e 17 componentes da membrana apical 1,18 complexo, entre outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra in vivo. Até agora, muito do que se sabe sobre a função destes organelos vem do estudo do seu comportamento em células em cultura. Embora estudos in vitro produziram tremenda visão sobre biologia celular, células em cultura não representa totalmente a complexidade da situação in vivo e, portanto, não refletem necessariamente a função e dinâmica de organelos subcelulares in vivo. Embriões de peixe-zebra oferecer uma alternativa viável em alternativa vivo para examinar a dinâmica subcelulares.

Como vertebrados, peixe-zebra possuem diversos sistemas de órgãos (por exemplo, retina neural) que são homólogos aos encontrados em espécies de mamíferos. Para além disso, os embriões de peixe-zebra são cada vez mais utilizadas para modelar doenças humanas 19,20 , incluindo os relacionados com a função centrosomal (por exemplo, microcefalia 21 e amaurose 22 congênita de Leber) e função mitocondrial (por exemplo, doença de Parkinson 23, Tauopatias 10,24 e síndrome de Barth 25). imagiologia in vivo a nível celular e subcelular nestes casos irá permitir uma melhor compreensão da biologia celular subjacente a estes estados patológicos.

O objetivo geral dos métodos descritos aqui é fornecer um guia completo para investigar organelas e outras estruturas subcelulares em embriões de peixe-zebra usando em microscopia de luz vivo. O todo o fluxo de trabalho envolvido na visualização e rastreamento estruturas subcelulares in vivo é descrito - a partir de rotulagem abordagens genéticas, para gerar expressam transitoriamente e peixes transgénicos estáveis, e, finalmente, para imagiologia utilizando de campo amplo e microscopia confocal. Enquanto cada um destes Procedures é utilizado por numerosos laboratórios de peixe-zebra, os protocolos descritos são otimizados e simplificado para investigar a dinâmica das estruturas subcelulares. Dois aspectos específicos do trabalho aqui descrito garante menção: Em primeiro lugar, a utilização do sistema de expressão de Gal4 UAS-em múltiplas configurações geneticamente organelos etiqueta integrada tipos de células específicos. Em segundo lugar, uma comparação directa de grande campo e microscopia confocal a estruturas subcelulares de imagem in vivo.

As estratégias actuais geneticamente organelos de etiquetas e de outras estruturas subcelulares no peixe-zebra, quer fazer uso de ARNm tampado 1,4,8 ou construções de ADN com base em elementos promotores conduzir directamente a expressão de proteínas de fusão 9,14,15. Transcrito in vitro de ARN em tampado resultados rápida e expressão ampla, que não é específico do tecido entanto. Além disso, os níveis de expressão diminuir ao longo do tempo, como o RNA tampado é diluído ou degradados. Assim, o uso de ARN baseadoconstrói para examinar a dinâmica de organelos em fases posteriores do desenvolvimento é limitado (geralmente até 3 dias pós-fertilização).

Estas limitações podem ser superadas utilizando construções de ADN, em que o controlo espacial e temporal de expressão é determinada por elementos promotores específicos. Quando construções de ADN com base são utilizados no contexto do sistema Gal4-UAS melhorias significativas para os níveis de expressão do transgene são observados 26,27. Neste sistema de expressão bipartido, de tipo célula elementos promotores específicos dirigir a expressão de um activador transcricional Gal4, enquanto que os genes repórter são clonados a jusante da sequência de activação a montante Gal4 de ligação (UAS). Através da combinação de UAS de Gal4 repórteres com condutores apropriados, a expressão pode ser restringida a tipos específicos de células, evitando a necessidade de clonar genes repórter diferentes promotores para trás cada vez que é desejado um padrão de expressão específico. Além disso, a expressão de vários genes repórter pode ser UAScomandado por um único activador Gal4. O sistema Gal4-UAS proporciona, assim, uma abordagem genética versátil e flexível para a rotulagem subcelular.

Wide-campo e microscopia confocal são os burros de carga da maioria dos laboratórios. sistemas de campo amplo tipicamente usam uma lâmpada de arco como uma fonte de luz e detectar a luz emitida com uma câmara sensível que é colocado na extremidade do percurso de luz. Esta modalidade de imagem é normalmente restrito a amostras finas como fora de foco de luz obscurece a informação em foco em amostras mais espessas. Microscópios confocal diferem dos sistemas de campo amplo, na medida em que são construídos para favorecer os sinais que se originam a partir do plano focal sobre aqueles que se originam fora de foco (ou seja, "seccionamento óptico") 28. Para atingir o seccionamento de um orifício óptico é colocado no caminho de emissão em posição conjugada com a fonte de luz pontual. Os lasers são usados ​​como fontes de luz e os sinais são detectados com tubos fotomultiplicadores (PMTs). Praticamente, um laserfeixe é passado através da amostra de ponto-a-ponto e a emissão de fluorescência em cada ponto (pixel) é detectada pelo PMT.

Aqui nós imagem as mesmas estruturas subcelulares em viver embriões de peixe-zebra usando tanto de campo amplo e microscopia confocal para proporcionar uma comparação directa de ambas as modalidades de microscopia. O objectivo subjacente de fornecer tais comparações é oferecer diretrizes para a escolha da técnica de microscopia mais apropriado para a questão específica na mão.

Usando as abordagens descritas aqui demonstramos Gal4-UAS base rotulagem genética das mitocôndrias e centrossomas. Essas organelas são gravadas em diferentes tipos de células do sistema nervoso e em células musculares utilizando todo o campo e microscopia confocal para demonstrar a adequação de cada modalidade de imagem. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptado para a investigação de outros organelos e estruturas subcelulares no embrião do peixe-zebra vivos.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos locais do governo da Alta Baviera (Munique, Alemanha).

1. Rotulagem organelas e outras estruturas subcelulares

NOTA: Aqui repórter genética constrói que centrossomas tag fluorescente, mitocôndrias e membranas celulares são descritos.

  1. Use métodos de clonagem convencionais 29 para gerar proteínas de fusão que fluorescently rotulam centrossomas e mitocôndrias. O clone da sequência de codificação de centrin4 peixe-zebra (cetn4) em grelha com uma proteína fluorescente 2 (FP), tais como a proteína fluorescente amarela para gerar cetn4-YFP. Clonar a sequência de direccionamento mitocondrial da subunidade VIII do citocromo c oxidase em quadro com um FP, como proteína fluorescente ciano para gerar mitoCFP 9-11.
  2. Para restringir a expressão das proteínas de fusão (cetn4-YFP ou mitoCFP) para as células específicas do zebrafembrião ish (por exemplo, neurónios ou células musculares) utilizar o sistema de expressão de Gal4 UAS-bipartido 26,27. Em primeiro lugar gerar um constructo repórter UAS. Utilizar métodos convencionais para clonar a proteína de fusão num vector de expressão de UAS, a jusante da cassete de Gal4 UAS de ligação (variantes desde 1x até 14x UAS, ver discussão) 26,27,30 e um promotor mínimo (promotor basal E1b do carpa βactin gene), e gerar UAS: cetn4-YFP e UAS: mitoCFP.
    NOTA: Para preparar repórter UAS constrói para a geração de linhagem transgênica estável elementos adicionais precisam ser clonado (ver 3 abaixo)
  3. Para visualizar o contexto celular em que centrossomas ou mitocôndrias são rotulados, gerar repórter UAS constrói em que as membranas das células são rotulados por PQ. Clonar os primeiros vinte aminoácidos de GAP43 peixe-zebra (contendo locais de palmitoilação) em grelha com um PF de alvo que FP para a membrana celular (memFP) 31,32.
  4. obtin construções de controladores ou linhas transgénicas em que tipo de célula elementos promotores específicos conduzir a expressão do activador da transcrição Gal4-VP16 27, 33 ou Gal4FF KalTA4 30.
  5. Combinar o repórter UAS constrói com uma construção de controlador adequado para restringir a expressão do tipo de célula desejado de interesse (por exemplo, em neurónios e células musculares). Para fazer isso co-injectar Gal4 motorista e repórter UAS constrói na fase de uma célula de ovos fertilizados (para instruções detalhadas veja 2 abaixo) para gerar expressam transitoriamente peixe. Alternativamente, gerar uma linhagem transgênica estável repórter UAS (para obter instruções detalhadas consulte 3 abaixo) e atravessar para a linhagem transgênica estável Gal4 driver para gerar prole tendo ambos os transgenes.
    NOTA: Também é possível injetar UEA construção repórter / s em ovos fertilizados de uma linhagem transgênica estável Gal4 driver ou um driver Gal4 construir em FERTILIZovos ed partir de uma linhagem transgênica estável repórter UAS.
  6. Para co-expressar várias proteínas de fusão distinto que utilizam o sistema Gal4-UAS, use um driver Gal4 e UAS repórter / s em uma das seguintes configurações: A. Múltipla, construções repórter UAS separadas (por exemplo, UAS: mitoCFP e UAS: memYFP co -injected com uma construção motorista Gal4) 10, B. Várias cassetes UAS em um único repórter (por exemplo, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Repórter bidirecional UAS (por exemplo UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figura 1).

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Figura 1. Estratégias para co-expressar proteínas de fusão que utilizam o sistema Gal4-UAS.
A co-expressão de várias proteínas de fusão pode ser conseguida utilizando cassetes repórter UAS em várias configurações: (A) múltiplos, const-driven UAS separadaructs, (B) várias cassetes UAS em uma única construção ou (C) uma cassete UAS bidirecional em uma única construção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Gerar expressam transitoriamente Peixe

NOTA: O seguinte é uma adaptação de protocolos previamente publicados 34,35. Uma configuração básica de injecção deve incluir um estereomicroscópio com uma gama de ampliação até 12x, um micromanipulador com um suporte de micropipeta e uma fonte de pressão de ar. Prepare 2,1-2,5 antes do tempo:

  1. Para preparar as câmaras de microinjecção de ovos, preparar uma solução de 1,5% (w / v) de agarose em água. Adicionar pó de agarose a água e microondas até a agarose estar completamente dissolvida. Encha uma placa de Petri (100 x 15 mm) com esta solução.
    1. Permitir que a solução de agarose a arrefecer a approximately 45 ° C, antes de colocar um molde de plástico de microinjecção (40 mm x 66 mm, com 6 x 50 mm de comprimento sulcos que têm 1,5 mm de largura, 1 mm de profundidade e espaçados a 3 mm) sobre a superfície da agarose fundida, tomando cuidado para não introduzir bolhas na interface.
    2. Após os conjuntos de agarose, armazenar a 4 ° CO / N. Retire cuidadosamente o molde com uma espátula. Prepare várias câmaras microinjeção de cada vez, armazenar a 4 ° C e usar repetidamente ao longo de várias semanas.
  2. Use um extrator micropipeta para gerar capilares de injeção de vidro com uma longa haste 36.
    NOTA: As configurações específicas utilizadas para gerar capilares de injeção deve ser determinada empiricamente. capilares de injecção pode ser retirado antes do tempo e armazenados antes da sua utilização.
  3. Medir a concentração de ADN de plasmídeo (condutor de Gal4 UAS e construções repórter) para microinjecção utilizando um espectrofotómetro de acordo com o manual do fabricante. A medida60; a razão de absorvância a 260 nm e 280 nm (A260 / 280). Dilui-se o ADN a uma concentração final de 100 ng / mL em água isenta de nuclease.
    NOTA: Um A260 proporção de ~ 1,8 / 280 significa DNA puro. Considere o uso de um kit comercial (com base na matriz de ligação à base de sílica) para purificar o ADN de plasmídeo a ser usado para injecção. O DNA de plasmídeo deve ser de elevada qualidade, para evitar toxicidade.
  4. Preparar 10 ul de injecção de mistura por combinação de ADN (de 0,5 a 2,5 ul de um estoque de 100 ng / mL para uma concentração final de 5 a 20 ng / ul), solução de Danieau (0,33 ul de 30X estoque), vermelho de fenol (0,25 ul, opcional) e livre de nuclease água até um volume total de 10 ul.
    NOTA: Empiricamente determinar a concentração de ADN que produz expressão adequado. condutor de Gal4 e os plasmídeos repórter UAS precisa ser co-injectado. Nenhuma expressão resultará quando apenas o condutor de Gal4 UAS ou plasmídeo repórter é injectada em ovos fertilizados de tipo selvagem. Se, contudo, tele ovos fertilizados são a partir de uma linha de condutor de Gal4, em seguida, a injecção de um ou vários plasmídeos repórter UAS suficiente. Por outro lado, se microinjecção para uma linha de UAS repórter, apenas o plasmídeo condutor de Gal4 precisa ser injectada. Finalmente, enquanto Vermelho de Fenol pode ajudar muito a visualizar injectáveis, também é em si um composto fluorescente. Portanto, Vermelho de Fenol poderia obscurecer PQ visualizando se imaging está prevista antes de 24 horas após a fecundação (hpf), pois pode não ser suficientemente diluída por esta altura.
  5. A noite antes de injecções são planejadas, configurar vários pares (tipicamente de 5 a 10) do macho e da fêmea de peixe-zebra para reprodução. Use tanques de criação com uma inserção que contém um fundo quadriculado e uma divisória removível para separar a peixes machos e fêmeas.
    NOTA: macho e fêmea de peixe-zebra pode geralmente ser distinguidos pela sua forma do corpo. Os machos tendem a ser esbelta enquanto as fêmeas tendem a exibir um abdômen protuberante ventrally. Os machos, adicionalmente, tendem a ter uma col vermelho-amareladaoring na sua área abdominal ventral.
  6. Imediatamente antes das injecções de DNA, remover os divisores para permitir que o macho e fêmea para acasalar. Aproximadamente 15 a 30 minutos após a remoção do divisor, vá para os ovos na parte inferior do tanque. Transfira o peixe adulto usando uma rede de pesca para um novo tanque de criação.
  7. Verter a água, contendo os ovos fertilizados recém-preparado, para fora do tanque de reprodução em uma peneira (por exemplo, um plástico de chá do filtro). Lave os ovos na peneira usando um frasco de spray contendo solução de Danieau. Inverta a peneira para uma placa de Petri e usar uma garrafa de pulverização com a solução de Danieau para recuperar todos os ovos (tipicamente de 50 a 200 ovos por criação de animais par de peixes adultos).
  8. Com uma pipeta microloader, back-preencher um capilar de injeção puxou com a injeção de mistura de ADN. Monte o capilar injecção no titular de um micromanipulador e aparar a ponta, sob o controle visual de um microscópio estereoscópico, usando uma pinça para criar uma micropipeta que podem penetrate o córion e citoplasma da célula, enquanto ser capaz de entregar um volume adequado do DNA.
    NOTA: O grau em que a ponta do capilar de injecção é cortado deve ser determinado empiricamente e pode ser melhor avaliada quando injectar ovos.
  9. Para determinar o volume de ADN para injecção, descarregar uma gota da solução de injecção em óleo mineral. Meça o raio (r) da queda utilizando um micrômetro de calibração e calcular o seu volume (4/3 π r 3). Modular o volume, ajustando a pressão de injecção e / ou a duração de cada impulso de injecção.
  10. Usando uma pipeta de plástico, transferir todos os ovos recolhidos (tipicamente 50-200, de 2,7 acima) para as trincheiras de uma câmara de microinjeção. Sob o controlo visual de um estereomicroscópio, utilizar uma pinça para orientar os ovos de modo a que o citoplasma das células (transparente) e gema (densa, não transparente) pode ser facilmente identificado.
  11. Sob o controlo visual de um estéreomicroscópio, injectar o DNA no citoplasma da célula do ovo fertilizado, tendo o cuidado de assegurar que o volume injectado (1-2 nl) corresponde a aproximadamente 10% do volume da célula.
    NOTA: fenol vermelho na SIDA solução de ADN na visualização do volume injectado.
  12. Após a injeção, solte os ovos das trincheiras do molde de injeção por rubor-los com um frasco de spray contendo solução de Danieau. Subsequentemente transferir os ovos para uma placa de petri fresca usando uma pipeta de transferência de plástico e manter numa incubadora C 28,5 S.
  13. Manter os ovos injetados-un como controles para determinar se as injecções contribuir para altas taxas de mortalidade, seja como resultado de danos físicos sofridos durante a penetração micropipeta ou a mistura de DNA.
    Nota: As taxas de mortalidade elevada após as injecções pode ser devido a vários fatores, incluindo volumes de concentração ou de injeção excessivamente elevado de DNA e / ou plasmídeos com contaminaNTS. Para prevenir a toxicidade de preps de ADN de baixa qualidade, kits comerciais (com base na matriz de ligação à base de sílica) pode ser usado.
  14. Em intervalos regulares seguintes injeções, usar um microscópio estereoscópico para triagem de ovos não fertilizados e embriões mortos ou malformados e descartar estes.
    NOTA: Deem os ovos que parecem estar na fase de uma célula várias horas após a fertilização, como não fertilizado. Identificar embriões mal formados por defeitos anatômicos brutas, tais como uma comprometidos eixos corporais ântero-posterior. material amorfo dentro de um córion sugere que o embrião não proceder através de estágios de desenvolvimento e morreu. Para verificar se os embriões que foram microinjetados passar por um curso normal de desenvolvimento consultar o atlas anatômicas 37.
  15. Transferir os embriões utilizando uma pipeta de transferência de plástico para a solução da Danieau 1x contendo 1-fenil-2-tioureia (1xPTU) entre 10 e 24 HPF para prevenir a formação de pigmento. Manter os embriões em cont a solução da Danieauaining PTU para a duração da experiência.
    NOTA: Para além melanóforos, iridóforos sobre a superfície da pele pode ser problemático para imagiologia. Enquanto o PTU não inibe a formação iridophore, linhas mutantes com números reduzidos de iridóforos tais como Roy orbison (Roy) existem e podem ser utilizados 38.
  16. Após a eclosão embriões (geralmente no pós-fertilização segundo ou terceiro dia, 2 ou 3 dpf), descartar as córions e trocar solução do Danieau contendo PTU.
    NOTA: Estes passos são importantes para assegurar a qualidade do meio de embrião e a viabilidade dos embriões saudáveis.

3. Gerar linhagens transgênicas estáveis

NOTA: Estável linhas transgénicas podem ser eficientemente gerada utilizando o sistema de transposão Tol2. Um vector contendo o transposão Tol2 transgene de interesse é a co-injectada juntamente com o mRNA que codifica a enzima transposase em fertilizamovos d na fase de uma célula. Proteína transposase derivado a partir do ARNm injectado catalisa a excisão da cassete do transgene a partir do vector de transposão e a sua integração no genoma 39.

  1. Clone da cassete repórter transgene (por exemplo, UAS: mitoCFP) entre Tol2 repetições terminais invertidas em um dos vectores Tol2 actualmente utilizados na comunidade peixe-zebra, tal como descrito 40.
    NOTA: Tol2 vectores que contêm uma cassete de selecção em que os elementos promotores dirigem a expressão em sistemas de órgãos FP não relacionadas com a área de interesse (por exemplo, coração 41 ou da lente 42) são úteis para o rastreio de linhas transgénicas UAS repórter na ausência de transactivação Gal4.
  2. Utilizando um estojo comercial (com base na matriz de ligação à base de sílica), purificar o ADN de plasmídeo a ser usado para injecção. Assegure-se que o DNA de plasmídeo é de alta qualidade, para evitar toxicidade.
  3. Transcrever o ARNm que codifica uma transposase Tol2 usandovector de transcrição apropriado, como PCS-TP 43. Resumidamente, linearizar PCS-TP e usar um kit comercial para gerar ARNm tapado e seguir o protocolo do fabricante. Tome cuidado para evitar a contaminação com RNases (por exemplo, usar RNase pontas para pipetas e tubos). Alíquota do ARN, a uma concentração de 100 ng / ul, para uso único e armazenar a -80 o C.
  4. Na manhã do dia das injecções, descongelar uma alíquota de ARNm da transposase em gelo. Misturar o vector de ADN de transposão (2 ul de 100 ng / ul) e transposase ARNm (2 ul de 100 ng / mL) em uma proporção de 1: 1, e adicionar 6 mL de água isenta de RNase para levar o volume total a 10 ul.
    NOTA: A concentração de 20 ng / uL é recomendado para cada, mas a concentração óptima deve ser determinada empiricamente. Use água livre de RNAse para a diluição. Use luvas ao manusear a mistura injeção de DNA-RNA e mantê-lo no gelo durante todo o período de injeções para evitar a degradação do mARN.
  5. Usando as instruções detalhadas na seção 2 acima, injetar a mistura de injeção de DNA-RNA em ovos fertilizados na fase de uma célula. Sob o controle visual de um microscópio estereoscópico alvo o citoplasma da célula na fase de uma célula para as mais altas taxas de eficiência transgenia. Manter os embriões injetados em 28,5 o C até que esteja pronto para triagem de expressão do transgene.
    NOTA: A PCR pode ser realizada para verificar a eficiência da transposase Tol2 como previamente descrito 44.
  6. embriões tela em uma placa de Petri para a transgenia utilizando as oculares de um microscópio de fluorescência de dissecação.
    NOTA: Use os filtros adequados do microscópio para visualizar a expressão FP da cassete selecionável (ou seja, a fluorescência no coração ou lentes) a 2 ou 3 dpf. Identificar potenciais embriões transgênicos pela expressão (no coração ou na lente) e levantar esses embriões para a vida adulta (F 0 geração) usando o padrãoprotocolos 45. Alternativamente, identificar potenciais embriões transgênicos por PCR como descrito no 46.
  7. Uma vez que o repórter F UAS 0 peixes são 2,5 - 3 meses de idade, atravessá-los (ver 2.5 para mais detalhes) para não-transgênico do tipo selvagem de peixe para adquirir ovos para estabelecer uma geração F 1. Alternativamente, atravessar o repórter UAS F 0 peixe para uma linha de motorista Gal4 para estabelecer uma geração F 1. Neste último caso, o transgene-driven UAS pode ser monitorizada directamente nos embriões obtidos a partir do cruzamento.
  8. Utilize uma fluorescência microscópio de dissecação para a tela F 1 embriões para a expressão do transgene ou cassete seleccionável.
    NOTA: Quando a expressão é confirmada em seguida, o transgene pode ser dito para ser germinal transmitida. Transgénese é não-Mendeliana no estádio F 0. O número de embriões que expressam o transgene podem variar a partir de um número pequeno para a grande maioria em clutche indivíduos. Integração de transposões em diferentes F 0 peixe pode variar muito, o que resulta em diferentes padrões de expressão. Portanto manter F 1 peixes de diferentes F 0 fundadores como sub-linhas separadas. Integrações transposon em F 1 peixes são estáveis ​​e são passados ​​para as gerações seguintes de uma forma mendeliana.
  9. Manter cada F 0 peixes em tanques separados para voltar a identificar portadores do transgene.

4. Prepare embriões para criação de imagens em um microscópio vertical

NOTA: Os procedimentos descritos aqui foram otimizados para geração de imagens em microscópios verticais com objetivos distância água-dipping de cone longo de trabalho.

  1. Utilize uma fluorescência microscópio de dissecação para a tela embriões para a expressão do transgene.
    NOTA: A expressão de um transgene repórter UAS dependerá da linha específica condutor de Gal4 utilizado. Selecionar embriões para experimentos com imagens baseadas em exp desejadopadrão ression.
  2. Transferir os embriões selecionados utilizando uma pipeta de plástico para uma placa de Petri separado contendo tampão de Danieau com 1x PTU e 1x tricaina.
    NOTA: Quando a rotulagem é escassa (apenas algumas células em um sistema do órgão) montar os embriões em agarose (ver 4,3-4,7 abaixo) e tela para a expressão do transgene utilizando um microscópio de campo amplo com os objetivos de alta ampliação (ver 5.1 abaixo). Tricaina anestesia do peixe e deve ser eficaz dentro de segundos. Se o peixe não são imobilizados é provável que o tricaina degradou. As possíveis razões para esta degradação incluem mau armazenamento de tricaina, que é sensível à luz 47.
  3. Preparar a agarose para incorporar o peixe por dissolução de baixo ponto de fusão de agarose em pó em tampão de Danieau para uma concentração final de 0,7%. Alíquota (1 ml) e mantê-la num bloco de calor a 40 ° C até estar pronto para usar.
    NOTA: concentrat Superioriões de agarose (até 1,5%) também pode ser utilizado para incorporar os peixes.
  4. Adicionar 50 ul de estoque de um 20x tricaina e 20 ul de uma solução de estoque de 50x PTU à alíquota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão e misturar bem tocando no lado do tubo. Devolver o tubo para o bloco de calor. Usando uma pipeta de transferência de plástico, gentilmente pipeta alguns (1-10) em embriões anestesiados a agarose, a transferência de líquido tão pouco quanto possível para evitar a diluição da agarose.
  5. Usando uma pipeta de transferência de plástico todos os embriões com uma pequena quantidade de agarose para um vidro de fundo placa de Petri.
  6. Trabalhando relativamente rápido, utilizar uma pinça para posicionar os embriões na orientação desejada, dependendo da estrutura a ser trabalhada.
    NOTA: embriões Orient do seu lado, se a retina ou Rohon-Beard (RB) neurônios sensoriais devem ser trabalhada.
  7. Permitir que a agarose solidificar durante pelo menos 15 minutos. Adicionar tampão de Danieau contendo 1xPTU e 1xTricaine para cobrir os embriões embutidos em AgaroSE. Coloque o prato contendo embriões incorporado-agarose em uma incubadora a 28,5 ° C até que esteja pronto para a imagem.

5. geração de imagens celulares e subcelulares estruturas usando Wide-campo ou microscopia confocal

NOTA: Largo-campo microscopia e microscopia confocal ponto de varredura são as modalidades mais utilizadas para a imagem embriões de peixe-zebra fluorescente etiquetado tabela 1 resume as principais vantagens e desvantagens de ambos os sistemas.. Para ambas as formas de microscopia, os embriões são montados em agarose, como descrito no ponto 4 acima, e mantida a 28,5 ° C ao longo da experiência de imagem usando uma câmara de aquecimento com a fase de microscópio. É importante ressaltar que o prato com embriões incorporado-agarose é deixada equilibrar a 28,5 o C antes de imagem começa como flutuações de temperatura causar deriva na dimensão z. Ao realizar experimentos com imagens de longo prazo (mais several hora), colocar uma tampa de Plexiglas sobre a placa de petri de reduzir a evaporação do tampão.

Largo-campo Confocal ponto-scanning
Custo Relativamente barato Caro (aprox. 5x mais)
Photo-branqueamento Baixo Alto. A amostra é exposta à luz do laser acima e abaixo do plano focal.
Photo-toxicidade Baixo Alta (ver foto-branqueamento acima)
velocidade de aquisição Rápido Lento
Resolução em xy A lei de Abbe A lei de Abbe (pode ser melhorada através da aplicação de 40%, utilizando um orifício muito pequeno;. No entanto, ema maioria das configurações isso tem pouca aplicação prática)
seccionamento óptico Pobre Sim (pode ser ajustado pelo tamanho do furo de pino)
penetração nos tecidos Limitado a estruturas superficiais (por exemplo, células ou fibras musculares Rohon-Beard) Limitado a <100 mm a partir da superfície do embrião

Tabela 1. Comparação Geral de campo amplo e microscopia confocal ponto-scanning

  1. Microscopia de campo amplo
    NOTA: Aqui orientações são fornecidas para imagiologia embriões de peixe-zebra usando um microscópio de campo amplo na posição vertical com objetivos distância água-dipping de cone longo de trabalho. O microscópio é equipado com uma câmara CCD arrefecida, e os conjuntos de filtros para visualizar diferentes fluoróforos montado sobre uma roda de filtro automatizado para aquisição rápida de múltiplos canais.Aquisição de imagem é controlada por μManager, um pacote de software de fonte aberta microscopia 48. Um exemplo específico para imagiologia de mitocôndrias em neurónios sensoriais Rb é fornecida. Células RB são geneticamente marcados utilizando membrana alvo YFP e suas mitocôndrias são CFP-marcado (ver 1.1 acima).
    1. Embriões montar em seu lado em baixo ponto de fusão agarose como descrito no ponto 4 supra.
    2. Permitir que o prato com peixe montado para equilibrar a 28,5 ° C numa câmara de aquecimento na fase de microscópio antes do início de imagem.
    3. Use uma baixa ampliação objetivo água-dipping de cone e olhar através das oculares do microscópio para escolher uma área na superfície do embrião para a imagem.
      NOTA: Se a linha MitoFish repórter transgénico estável, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) mde6, é utilizado em conjunto com uma linha de condutor tal como HuC: Gal4, em seguida, os neurónios mais RB são rotuladas, e aparecem como uma densa mesH-obra de mandris de neurites na superfície do embrião. Se microinjecção de construções de DNA é usada para conseguir rotulagem esparsos (por exemplo, Sensorial: Gal4-VP16 com o UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP), embriões de tela para identificar as células de marcação dupla.
    4. Abra o software microscópio (μManager 1.4) e clique em "Iluminação '' em" Definições de configuração "para definir os conjuntos de filtros corretos para o comprimento de onda de interesse (YFP ou PCP para o exemplo atual). Em" Configurações de câmera "introduzir o tempo de exposição exigido para adquirir uma imagem adequada.
      NOTA: As "Configurações de Iluminação" é pré-definido pelo usuário no momento da instalação do software e é carregado ao abrir μManager. Se o software não está configurado para controlar a roda de filtro, mover manualmente a roda de filtro na torre para a posição apropriada.
    5. Mudar para um objectivo de água-dipping-cone distância longa de trabalho que vão desde 40-100x ampliação. Escolhero objectivo que tem a mais elevada abertura numérica (NA) e é corrigida cromaticamente (Apochromat).
    6. Clique em "Live" para escolher o campo de visão: No caso do neurônio RB, imagem Transporte mitocondrial no axônio-tronco, que emana do corpo celular, ou no caramanchão periférica.
      NOTA: Os mandris periféricos dos neurónios RB na aleta dobra caudal do embrião proporcionar uma oportunidade ideal para uma imagem de grande campo de visão que é plana e, por conseguinte, pode ser capturado numa única estrutura com um microscópio de campo amplo. É, portanto, importante para montar o embrião como categoricamente quanto possível do seu lado, de modo que a dobra caudal é paralelo ao fundo da placa de Petri.
    7. Depois de escolher um campo de visão, clique no botão "seleção retangular" no menu ImageJ, definir uma região de interesse (ROI) e clique em "ROI" na janela de μManager. Depois de selecionar o ROI para geração de imagens, clique em "Stop" e "Salvar" para take uma imagem do canal YFP para gravar a morfologia do local de neurites / s.
    8. Para a imagem de transporte mitocondrial clicar sobre o "Multi-D Acq." botão. Observe uma janela adicional ( "Multi-dimensional Aquisição") e selecione o número de pontos de tempo, bem como o intervalo entre os pontos temporais nesta janela. Use taxas de quadro de 0,3-1 Hz. Realizar gravações durante pelo menos 10 minutos para recolher o maior número de dados de pontos possível.
    9. Na janela "Multi-dimensional Aquisição", clique em "Canais", adicionar e definir o comprimento de onda para a imagem latente (PCP para mitocôndrias neste exemplo) e do tempo de exposição. Mantenha os tempos de exposição para abaixo de 400 ms para geração de imagens de transporte mitocondrial.
    10. Clique na opção "Salvar Imagens" na janela "Multi-dimensional Aquisição", para salvar automaticamente os arquivos em uma pasta específica descrita no 'root Diretório'. Clique em "Adquirir" no canto superior direito para iniciar timimagiologia e-lapse.
    11. reajustar o foco manualmente durante a gravação de lapso de tempo para compensar qualquer desvio na dimensão z.
      NOTA: Utilizando estes parâmetros de transporte mitocondrial em neurônios RB podem ser visualizados durante o tempo que 4 horas.
  2. A microscopia confocal
    NOTA: Aqui orientações são fornecidos para geração de imagens com um microscópio confocal Olympus FV1000 vertical e objetivos água-dipping de cone distância longa de trabalho. O microscópio é equipado com várias linhas de laser e vários detectores (PMT convencionais e detectores de arsenieto de gálio de fosforeto mais sensíveis) que permitem a imagiologia multicanal. é feita referência específica ao software Olympus Fluoview. No entanto, os parâmetros de imagem descritos aqui deve ser facilmente transferível para outros sistemas confocais.
    1. Montagem embriões em baixo ponto de fusão de agarose numa orientação apropriada para o órgão / estrutura a ser trabalhada, como descrito no ponto 4 acima.
    2. Deixar a cápsula com peixes montado para equilibrar a 28,5 ° C numa câmara de aquecimento na fase de microscópio antes do início de imagem.
    3. Use distância objectivos água-dipping de cone longo trabalho para microscopia confocal em uma configuração vertical. Escolha objectivos com o mais alto possível de NA para maximizar a quantidade de sinais de fluorescência que pode ser recolhida e tem a melhor poder de resolução. Ao recolher imagens de vários canais de escolher objetivos cromaticamente corrigidos (Apochromat).
    4. Abra o software microscópio e clique em "Trans lâmpada" ou "Lâmpada Epi" para usar luz transmitida ou de fluorescência, respectivamente, para identificar a região de interesse através das oculares do microscópio.
    5. Use o software para configurar os seguintes parâmetros de digitalização para adquirir pilhas de imagens:
      1. Na janela "Aquisição Setting" verificar que o objetivo escolhido para a imagem latente corresponde ao objectivo que aparece no drop-dowMenu n dos objectivos disponíveis.
        NOTA: Este é garantir que todos os parâmetros pré-calculados para um objectivo específico (por exemplo, lateral e resolução axial, tamanho da abertura confocal etc.) são verdadeiras e podem ser usados ​​de forma confiável.
      2. Selecione os filtros de linha de laser / s, e excitação e dicróicas adequadas de emissões imagem proteína fluorescente específica (s). Faça isso clicando no botão "lista Dye" na janela "Aquisição de Imagem Controle" e escolher o apropriado fluoróforo / s. Como alternativa, clique no botão "caminho Luz e corantes" para definir estes parâmetros manualmente.
        NOTA: Quando a opção do botão "Lista Dye" é escolhido, o software seleciona automaticamente os filtros apropriados dicróicas linhas de laser, excitação e emissão e ajusta o tamanho da abertura confocal de forma adequada.
      3. Na janela "Aquisição Setting", ajustar o fator de "Zoom" e "asp Tamanhorácio ect "(ou seja, 512x512, 1024x1024 etc.) da imagem digitalizada para obter o tamanho do pixel necessária para melhor resolver as estruturas sendo fotografada. Defina o tamanho do pixel em cerca de metade da resolução teórica do objectivo, seguindo assim critérios de amostragem de Nyquist . para determinar o tamanho do pixel da imagem, clique adquirida no botão com o símbolo de informações ( "i") na janela "Aquisição de imagem Controle".
      4. Defina a velocidade de digitalização para o mais rápido possível (2 uS / pixel) na janela "Aquisição Setting".
      5. No "Aquisição de Imagem Controle" janela, clique em Kalman linha média para reduzir o fator de noise.A de 2 a 3 normalmente é suficiente.
      6. Selecione um modo de digitalização sequencial quando imagiologia fluoróforos com sobreposição de espectros. Para fazer isso, clique em "Sequential" e "Linha" na janela "Aquisição de Imagem Controle".
      7. Ajustar a potência de saída da linha de laser / s relevantes (tipicamenteabaixo de 5%). Os valores específicos têm de ser determinada empiricamente.
      8. Clique em "XY Repeat" ou "x2 Focus" ou "Foco x4" botão para fazer a varredura continuamente a região selecionada ao ajustar as definições do detector para cada canal. Ajuste "HV", "Gain" e "offset" para cada canal para obter imagens que têm a maior gama dinâmica de valores de cinza.
        NOTA: Os valores específicos para essas configurações precisam ser determinadas empiricamente. "HV" ajusta a tensão no detector para alterar a sua sensibilidade, "offset" ajusta o sinal de saída do detector e "ganho" multiplica o sinal de saída do detector por um factor constante.
      9. Pressione Ctrl + H para visualizar as imagens obtidas através de uma tabela look-up (HiLo) que identifica sub-saturada (aparecem em azul) e mais saturado pixels (aparecem em vermelho), os quais devem ser evitadas. Re-avaliar a potência do laser relevante line / s e as definições do detector.
        NOTA: A utilização de alta potência de laser e níveis elevados da "HV" do detector levará a mais sinal. potência do laser mais elevada vai, porém, levar a um aumento de branqueamento e foto-toxicidade. Aumentar o "HV" levará a um aumento de ruído. Portanto, um compromisso precisa ser encontrado ao definir potência do laser e "HV" para adquirir imagens com níveis aceitáveis ​​de ruído, evitando foto-dano (ver também Quadro 1).
      10. Recolhe imagens a partir de um volume definido, centrando-se nos limites superiores e inferiores da área de interesse. No "Aquisição Setting" janela, clique nos botões "End Set" e "Start Set" conjunto de janela do z-stack nos limites superior e inferior do volume a ser trabalhada. Seleccionar um tamanho de etapa que é metade da resolução-z para o objectivo determinado (por exemplo., Se a resolução z é 2 uM escolher 1 uM). Para determinar o z-resolução da objective clique no botão com o símbolo de informações ( "i") na janela "Aquisição de Imagem Controle".
      11. Configurar uma série de tempo para recolher z-stacks a uma frequência temporal que é apropriado para a dinâmica da estrutura subcelular sendo trabalhada. No sub-janela "TimeScan" introduzir a frequência em que z-stacks deve ser adquirida ( "Interval") e o número de vezes que as imagens devem ser adquiridas ( "Num").
      12. Clique na "profundidade" e os botões "Time" na janela "Aquisição de Imagem Controle" para confirmar que um z-stack e time-series serão adquiridos. Finalmente, clique no botão "XYZT" para começar a aquisição de imagens de lapso de tempo.
      13. Após a conclusão da aquisição da imagem, observar "Série Feito" na interface do software. Clique nele e salvar as imagens no formato "OIB" para gravar as imagens e metadados associados a eles.
        Nota: As imagens obtidas namicroscópio de campo amplo e microscópio confocal podem ser visualizados e analisados ​​utilizando software como Fiji, um programa de processamento de imagens de domínio público gratuito.

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Resultados

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Aqui o uso de largura de campo e microscopia confocal para a mitocôndria de imagem e centrossomas em viver embriões de peixe-zebra está diretamente comparados e contrastados. Dependendo da localização das células em que a dinâmica de organelos devem ser examinadas e a frequência inerente dos eventos específicos subcelulares, em geral, quer de campo amplo ou microscopia confocal é a melhor escolha. Nós fotografada organelos nos neurónios RB localizados na superfície do embrião e em célula...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, demonstramos a versatilidade do sistema de expressão de Gal4 UAS-tag fluorescente para a mitocôndria, centrossomas e as membranas celulares do-tipos específicos de células in vivo em embriões de peixe-zebra. Muitas proteínas de fusão fluorescentes que rotular outros organelos e estruturas subcelulares podem ser encontrados na literatura publicada e pode ser obtido a partir do respectivo laboratório, fontes comerciais ou depositários plasmídeo não-comerciais (por exemplo, Addgene). Para conceber u...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.E. é apoiado pelo Grupo de Treinamento em Pesquisa 1373 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS). G.P. foi apoiado pelo TUM-GS. L.T. é apoiado por uma bolsa EMBO (EMBO ALTF 108-2013). O trabalho de D.P. sobre o peixe-zebra foi apoiado pela DFG por meio do Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); o Centro de Ciências Integradas de Proteínas (Munique) e o Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) ao abrigo do acordo de subvenção n.º 200611 (MEMOSAD). Atualmente, ele é bolsista da New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller e foi apoiado por uma bolsa da Academia Alemã de Ciências Leopoldina. L.G. é apoiado por financiamento da DFG através do SFB 870 "Montagem e Função de Circuitos Neuronais", Projeto A11.

Somos gratos a Kristina Wullimann por manter nossas instalações de pesca, Yvonne Hufnagel pelo suporte técnico e Thomas Misgeld pelos comentários sobre o manuscrito. Somos gratos a R. Köster (Technische Universität Braunschweig) por fornecer o vetor M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) a partir do qual clonamos Centrin-YFP e S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (Universidade de Washington) por fornecer o cerúleo 14xUAS:MA que usamos para gerar a construção repórter para fazer o CentrinFish. Agradecemos ainda a S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (Universidade de Washington) pela linha transgênica Otx2:Gal4, A. Sagasti pela construção Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) e M. Nonet (Universidade de Washington em St. Louis) pelo vetor pCold Heart Tol2. Agradecemos a Bettina Schmid, Alexander Hruscha e Christian Haass (Centro Alemão de Doenças Neurodegenerativas de Munique - DZNE) por contribuírem para o desenvolvimento do MitoFish.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agarose (2-hidroxietilagarose)Sigma-AldrichA4018-10GAquecedor de bloco tipo VII de baixa temperatura de gelificação
EppendorfThermomixer compact
Ca(NO3)2 Nitrato de cálcio hidratado, 99,996% Aldrich202967-50gPara preparar a câmera CCD 30x da
DanieauQimagingRetiga Exi Fast 1394
Revestida de Cerâmica Dumont #5 FórcepsDumont - Ferramentas de Ciência Fina11252-50#5 Fórceps
Microscópio confocal de varredura a laserOlympusFV1000 Fluoview
Aquecedor de pratos de culturaWarner Instrument CorporationDH-35Anel de aquecimento
Sal de metanossulfato de etilo 3-aminobenzoatoPharmaQTricaine PharmaQ-25gTricaína (anestésico)
Microscópio de dissecação de fluorescênciaLeicaM205 FA
Kit GeneCleanMP Biomedicals111001200
Placas de cultura com fundo de vidroMatTek CorporationP35G-0-14-C Placa dePetri de 35 mm, micropoço de 14 mm, lamínula nº 0
Agulhas de vidroWorld Precision Instruments Inc. TW100F-4Para microinjeções
HEPESSigmaH3375-250gPara preparar 30x Graxa
de Alto VácuoDanieau's Dow Corning DCC000001242 150gde graxa de dióxido de silício
KCl 99%Sigma-AldrichS7643-5kgPara preparar 30x
MgSO4.7H2O de Danieau     Sulfato de magnésio heptahidratado 98+% reagente A.C.SSigma-Aldrich230291-500gPara preparar 30x
Microinjetor Danieau Pontas de microcarregador EppendorfFemtoJet
Eppendorf9300010070.5-20 ul
MicromanipuladorMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts / 00-42-101-0000 / M3301R
Suporte de micropipetaIntracel P/ N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcriçãoAmbionAM1340Para transcrever PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5%Sigma-AldrichP9541-1kgPara preparar 30x Nanofotômetro
Para medir a concentração de DNA/RNA
Extratoragulhas Instrumento SutterP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W Objetiva Nikonde cone de imersão
em água N-Feniltioureia Grau I, aprox. 98%SigmaP7629-10GPTU (previne pigmentação)
Placas de PetriSarstedt AG 82147292 x 16mm 
Moldes de plástico Ferramentas de Ciência AdaptativaTU-1Para microinjeções
Tampa de Plexiglas - com um furoFeito sob medidaO furo na tampa de Plexiglas deve ser 3 mm maior que o diâmetro da objetiva do cone de imersão em água
Coador de chá (Plástico)Para coletar ovos de peixe-zebra
Controlador de temperaturaWarner Instrument CorporationTC-344BDual Automatic Temperature
Pipetas de transferênciaSarstedt AG 86.1171pipetas de transferência de plástico de 3.5mL
UMPlanFI 100x/1.00WOlympusObjetiva de cone de imersão em água
UMPlanFLN 20x/0.50W OlympusMicroscópio de campo amplo de objetiva de cone de imersão em água
OlympusBX51WI
PTU (estoque de 50x)Dissolver 76 mg de PTU em 50 ml de água destilada
Mexer vigorosamente à temperatura ambiente 
Armazenar a -20 oC em alíquotas de 1 ml
Usar a 1x solução de trabalho
Tricaína (20x Stock)Dissolver 200 mg de Tricaína em 48 ml de água destilada
Adicionar 2 ml de base Tris 1M (pH9)
Ajustar para pH 7 
Armazenar a -20 oC em alíquotas de 1 ml
Usar a 1x solução de trabalho
Solução de Danieau (30x Estoque)1.740 mM  NaCl 
21 mM          KCl 
12 mM          MgSO4.7H2O 
18 mM          Ca (NO3)2
150 mM      Amortecedor HEPES 
Água destilada até 1 L 
Loja em 4 oC 
Uso em solução de trabalho 0,3x
Danieau's de de controlador

Referências

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