A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.
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Artigo de método
Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem in vivo fornece acesso sem precedentes ao comportamento dinâmico das estruturas celulares e subcelulares em seu contexto natural. A realização de tais experimentos de imagem em vertebrados superiores, como mamíferos, geralmente requer acesso cirúrgico ao sistema em estudo. A acessibilidade óptica do peixe-zebra embrionário e larval permite que esses procedimentos invasivos sejam contornados e permite imagens no organismo intacto. De fato, o peixe-zebra é agora um modelo bem estabelecido para visualizar comportamentos celulares dinâmicos usando microscopia in vivo em uma ampla gama de contextos de desenvolvimento, desde a proliferação até a migração e diferenciação. Um desenvolvimento mais recente é o uso crescente de peixe-zebra para estudar eventos subcelulares, incluindo tráfego mitocondrial e dinâmica de centrossomas. A relativa facilidade com que essas estruturas subcelulares podem ser geneticamente marcadas por proteínas fluorescentes e o uso de técnicas de microscopia de luz para imaginá-las está transformando o peixe-zebra em um modelo in vivo de biologia celular. Aqui descrevemos métodos para gerar construções genéticas que marcam organelas fluorescentemente, destacando mitocôndrias e centrossomas como exemplos específicos. Usamos o sistema bipartido Gal4-UAS em várias configurações para restringir a expressão a tipos de células específicos e fornecer protocolos para gerar peixes transgênicos estáveis e com expressão transitória. Finalmente, fornecemos diretrizes para a escolha de métodos de microscopia de luz mais adequados para a dinâmica subcelular de imagens.
Introdução
Na imagem in vivo proporciona a visualização direta de comportamentos celulares no contexto mais fisiológica. A transparência de embriões de peixe-zebra, o seu desenvolvimento rápido e externa e uma rica variedade de ferramentas genéticas que permitem a marcação fluorescente têm contribuído para o crescente uso de microscopia in vivo para elucidar a dinâmica dos eventos fundamentais de desenvolvimento. Estudos de imagem do desenvolvimento do sistema nervoso no peixe-zebra tem, por exemplo, expandiu enormemente o nosso conhecimento do comportamento das células progenitoras neurais eo destino de seus descendentes, incluindo a sua subseqüente ....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos locais do governo da Alta Baviera (Munique, Alemanha).
1. Rotulagem organelas e outras estruturas subcelulares
NOTA: Aqui repórter genética constrói que centrossomas tag fluorescente, mitocôndrias e membranas celulares são descritos.
- Use métodos de clonagem convencionais 29 para gerar proteínas de fusão que fluorescently rotulam centrossomas e mitocôndrias. O clone da sequência de codificação de centrin4 peixe-zebra (cetn4) em grelha com uma proteína fluorescente 2 (FP), tais como ....
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Resultados
Aqui o uso de largura de campo e microscopia confocal para a mitocôndria de imagem e centrossomas em viver embriões de peixe-zebra está diretamente comparados e contrastados. Dependendo da localização das células em que a dinâmica de organelos devem ser examinadas e a frequência inerente dos eventos específicos subcelulares, em geral, quer de campo amplo ou microscopia confocal é a melhor escolha. Nós fotografada organelos nos neurónios RB localizados na superfície do embrião e em célula.......
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Discussão
Aqui, demonstramos a versatilidade do sistema de expressão de Gal4 UAS-tag fluorescente para a mitocôndria, centrossomas e as membranas celulares do-tipos específicos de células in vivo em embriões de peixe-zebra. Muitas proteínas de fusão fluorescentes que rotular outros organelos e estruturas subcelulares podem ser encontrados na literatura publicada e pode ser obtido a partir do respectivo laboratório, fontes comerciais ou depositários plasmídeo não-comerciais (por exemplo, Addgene). Para conceber u.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
P.E. é apoiado pelo Grupo de Treinamento em Pesquisa 1373 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS). G.P. foi apoiado pelo TUM-GS. L.T. é apoiado por uma bolsa EMBO (EMBO ALTF 108-2013). O trabalho de D.P. sobre o peixe-zebra foi apoiado pela DFG por meio do Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); o Centro de Ciências Integradas de Proteínas (Munique) e o Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7/2007-2013) ao abrigo do acordo de subvenção n.º 200611 (MEMOSAD). Atualmente, ele é bolsista da New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller e foi apoiado p....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Agarose (2-hidroxietilagarose) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Aquecedor de bloco tipo VII de baixa temperatura de gelificação |
| Eppendorf | Thermomixer compact | ||
| Ca(NO3)2 Nitrato de cálcio hidratado, 99,996% | Aldrich | 202967-50g | Para preparar a câmera CCD 30x da |
| Danieau | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
| Revestida de Cerâmica Dumont #5 Fórceps | Dumont - Ferramentas de Ciência Fina | 11252-50 | #5 Fórceps |
| Microscópio confocal de varredura a laser | Olympus | FV1000 Fluoview | |
| Aquecedor de pratos de cultura | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Anel de aquecimento |
| Sal de metanossulfato de etilo 3-aminobenzoato | PharmaQ | Tricaine PharmaQ-25g | Tricaína (anestésico) |
| Microscópio de dissecação de fluorescência | Leica | M205 FA | |
| Kit GeneClean | MP Biomedicals | 111001200 | |
| Placas de cultura com fundo de vidro | MatTek Corporation | P35G-0-14-C Placa de | Petri de 35 mm, micropoço de 14 mm, lamínula nº 0 |
| Agulhas de vidro | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | Para microinjeções |
| HEPES | Sigma | H3375-250g | Para preparar 30x Graxa |
| de Alto Vácuo | Danieau's Dow Corning | DCC000001242 150g | de graxa de dióxido de silício |
| KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | Para preparar 30x |
| MgSO4.7H2O de Danieau Sulfato de magnésio heptahidratado 98+% reagente A.C.S | Sigma-Aldrich | 230291-500g | Para preparar 30x |
| Microinjetor Danieau | Pontas de microcarregador Eppendorf | FemtoJet | |
| Eppendorf | 930001007 | 0.5-20 ul | |
| Micromanipulador | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts / 00-42-101-0000 / M3301R | |
| Suporte de micropipeta | Intracel P | / N 50-00XX-130-1 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcrição | Ambion | AM1340 | Para transcrever PCS-Transposase |
| NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | Para preparar 30x Nanofotômetro |
| Para medir a concentração de DNA/RNA | |||
| Extrator | agulhas Instrumento Sutter | P-1000 | Flaming/Brown |
| NIR Apo 40x/0.80W | Objetiva Nikon | de cone de imersão | |
| em água N-Feniltioureia Grau I, aprox. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (previne pigmentação) |
| Placas de Petri | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
| Moldes de plástico | Ferramentas de Ciência Adaptativa | TU-1 | Para microinjeções |
| Tampa de Plexiglas - com um furo | Feito sob medida | O furo na tampa de Plexiglas deve ser 3 mm maior que o diâmetro da objetiva do cone de imersão em água | |
| Coador de chá (Plástico) | Para coletar ovos de peixe-zebra | ||
| Controlador de temperatura | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Dual Automatic Temperature |
| Pipetas de transferência | Sarstedt AG | 86.1171 | pipetas de transferência de plástico de 3.5mL |
| UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | Objetiva de cone de imersão em água | |
| UMPlanFLN 20x/0.50W | Olympus | Microscópio de campo amplo de objetiva de cone de imersão em água | |
| Olympus | BX51WI | ||
| PTU (estoque de 50x) | Dissolver 76 mg de PTU em 50 ml de água destilada Mexer vigorosamente à temperatura ambiente Armazenar a -20 oC em alíquotas de 1 ml Usar a 1x solução de trabalho | ||
| Tricaína (20x Stock) | Dissolver 200 mg de Tricaína em 48 ml de água destilada Adicionar 2 ml de base Tris 1M (pH9) Ajustar para pH 7 Armazenar a -20 oC em alíquotas de 1 ml Usar a 1x solução de trabalho | ||
| Solução de Danieau (30x Estoque) | 1.740 mM NaCl 21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM Amortecedor HEPES Água destilada até 1 L Loja em 4 oC Uso em solução de trabalho 0,3x |
Referências
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W.
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Reimpressões e permissões
