Long-Term Cateterismo do tronco linfa intestinal e Recolha de linfa no Neonatais Pigs

Resumo

Apresentamos um procedimento cirúrgico para cateterizar o tronco linfático intestinal em porcos neonatais para coletar grandes quantidades de componentes do metabolismo lipídico da linfa eferente.

Resumo

O cateterismo do tronco linfático intestinal em porcos neonatais é uma técnica que permite a coleta a longo prazo de grandes quantidades de linfa eferente intestinal (central). É importante ressaltar que a coleta de linfa central do intestino permite que os pesquisadores estudem os mecanismos e os constituintes lipídicos associados ao metabolismo lipídico, inflamação intestinal e metástase do câncer, bem como células envolvidas na função imunológica e imunovigilância. Uma abordagem cirúrgica da linha média ventral permite excelente exposição cirúrgica ao abdome craniano e acesso relativamente fácil ao vaso do tronco linfático intestinal que fica próximo ao pâncreas e ao segmento ventral direito da veia porta abaixo do aspecto visceral do lobo direito do fígado. O vaso é meticulosamente dissecado e liberado da fáscia circundante e, em seguida, dilatado com suturas, permitindo a inserção e posterior fixação do cateter no vaso. O cateter é exteriorizado e aproximadamente 1 L/24 horas de linfa é coletado durante um período de 7 dias. Embora essa técnica permita a coleta de grandes quantidades de linfa central por um longo período de tempo, o sucesso depende de uma dissecção cirúrgica cuidadosa, manuseio de tecido e muita atenção à técnica cirúrgica adequada. Isso é particularmente importante em cirurgias em animais jovens, pois os vasos linfáticos podem se romper facilmente, potencialmente levando ao fracasso cirúrgico e experimental. O vídeo demonstra uma excelente técnica cirúrgica para a coleta de linfa intestinal.

Introdução

O sistema linfático é uma área pouco estudada da fisiologia. Modelos pré-clínicos de cateterismo linfático ocorrer em diferentes espécies animais e ^1-8 são utilizados pelas indústrias farmacêuticas e instituições de investigação para investigar mecanismos envolvidos em lípidos ^8-12 e ^13-15 metabolismo da droga, metástase de câncer ¹⁶ com tratamento experimental ^{17, 18} e a função imunológica ^-26. Este estudo explora o uso de cateterismo intestinal tronco linfático em um modelo de porco doméstico para medir componentes do metabolismo de lipoproteínas. metabolismo das lipoproteínas está envolvido na produção e secreção de quilomicrons, bem como as alterações nos lípidos associados e proteína total. Essas considerações são importantes, pois há grandes diferenças no metabolismo lipídico entre modelos de roedores comumente usados ​​e os seres humanos e, como tal, empregando modelos de suínos para coletar linfa intestinal poderia fornecer informação mais comparável para o estudo de lipídios memetabolização em pessoas ^27-31.

Várias técnicas cirúrgicas são usados ​​para coletar a linfa intestinal em espécies de animais de grande porte: uma abordagem ombro cranial (ou seja, o cateterismo ducto torácico) ^5, uma abordagem lateral superior flanco ^32-34, e uma linha média ventral ou abordagem paramediana ^22,35. Este vídeo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico em suínos utilizando uma abordagem cirúrgica ventral para o cateterismo do tronco linfático intestinal. Cuidadosas autorizações técnicas cirúrgicas este método de cateterismo linfática para recolher grandes quantidades de linfa e dos seus componentes ao longo de períodos de tempo prolongados.

Esta técnica abre uma miríade de aplicações para muitas disciplinas que examinam várias funções fisiológicas. Aplicações podem incluir, mas não estão limitados a, todo lipoproteína corpo e o metabolismo lipídico, imunovigilância, génese de tumores e metástases, função intestinal, e a development e progressão da doença inflamatória intestinal.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais experimentais descritas, tanto no vídeo e manuscrito foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal e seguiu as orientações estabelecidas pelo Conselho Canadense de Animal Care.

1. anestesia cirúrgica e preparo cirúrgico do Pigs Neonatais

1. Em uma antecâmara separada, premedicate 25 kg porcos perto da base do pescoço, com um cocktail de drogas sedativo-anestésico intramuscular contendo: azaperona (0,3 mg / kg), cloridrato de cetamina (10 mg / kg), a dexmedetomidina (15 ug / kg).
   Nota: Adicionar buprenorfina (0,005-0,02 mg / kg) no coquetel de drogas pré-anestésica para maior controle da dor intra-operatória.
2. Anestesiar os porcos com gás para inalação de isoflurano inalado (4-5% de isoflurano em 500 ml-1000 ml / min O ₂₎ usando uma máscara facial. Visualizar as cordas vocais usando um espaço da laringe veterinário (lâmina reta 17-25 cm de comprimento), e aplicar tópica 10% spay lidocaína ao vocalcabos. Permitir que o spray de lidocaína a contactar as cordas vocais 30-60 seg antes da intubação para reduzir a possibilidade de espasmo das cordas vocais e obstrução das vias aéreas.
3. Entubar os porcos por meio de um tubo endotraqueal (5,0-7,0 mm de diâmetro interno (ID)) entre as cordas vocais e manter a anestesia com isoflurano gás (0,5-2,0% de isoflurano em 1.000-2.000 ml / min _{de O2)} usando um fechada circuito de reinalação sistema anestésico durante toda a cirurgia. Avaliar o nível de anestesia pelo tom mandíbula, e ambas as respostas reflexas dos pedais e da pálpebra. gás anestésico expirado é eliminado e ventilado fora do centro cirúrgico.
4. Limpar a superfície exterior da orelha com uma solução de limpeza cirúrgica 2,0% de clorexidina seguido por uma lavagem com álcool isopropílico a 70%. Com um cateter intravenoso 20 L, catheterize uma veia da orelha para fornecer fluidos intravenosos (solução de lactato de Ringer; 5-10 ml / kg / hr) durante a cirurgia. Garantir um oxímetro de pulso à superfície da mucosa da língua, com medfita iCal para monitorar a frequência cardíaca ea saturação de oxigenação do sangue periférico _(SpO2).
5. Coloque o porco anestesiado em uma posição reclinada dorsal e raspar o abdômen ventral a partir de meados do tórax caudalmente ao aspecto ventral do púbis. Limpar esta área com os dois alternando 2,0% clorexidina cirúrgico esfrega e lavagens de água estéril.
6. Transferir o porco anestesiados ao centro cirúrgico e aplicar a paramentação final de 70% lavagem de álcool isopropílico, deixe-a secar, e depois armar o animal.
7. Insira uma sonda de temperatura rectal cerca de 2-4 cm no recto para monitorizar a temperatura do corpo. Coloque os suínos de uma almofada de aquecimento de recirculação de água para manter a temperatura corporal normal (38-40 ° C) durante o procedimento cirúrgico.
8. Armar o porco com quatro toalhas cortinas colocadas em um padrão quadrante sobreposta em torno do abdômen. Coloque a primeira cortina em todo processo xifóide do esterno, a segunda cortina junto aspecto lateral do abdômen cerca de 5 cm lateral à linha média abdominal. Coloque a terceira cortina entre a crista do íleo da pelve e a quarta cortina, como a segunda cortina (embora no lado oposto), é colocada ao longo da face lateral do abdómen cerca de 5 cm lateralmente à linha média abdominal.
9. Coloque uma grande cortina de mesa, com uma fenda de abertura permitindo o acesso ao local da cirurgia, sobre as cortinas toalha subjacentes e cubra o porco e toda mesa cirúrgica. A cortina final é um Steri-cortina descartável colocado sobre a grande cortina mesa.

2. Cirurgia Abdominal e cateterismo do Tronco linfático intestinal

1. Faça uma incisão na pele 20 cm, com uma lâmina de bisturi para expor os músculos abdominais subjacentes. Inciso as camadas musculares abdominais com electrocauterização mono-polar (20 configuração Watts) para expor o peritoneu parietal. Abra um segmento linear 20 cm de peritônio parietal com uma tesoura Metzenbaum para acessar as vísceras abdominais e vasos linfáticos.
2. Coloque um retractor na face craniana da incisão cirúrgica para manter a cavidade abdominal aberta para a duração da cirurgia.
3. Humedecer todos os tecidos com água morna (37 ° C) de soro fisiológico estéril por todo o procedimento cirúrgico. Levante cuidadosamente um grande segmento do intestino incluindo o de cólon, ceco, íleo e jejuno da cavidade abdominal e exteriorizar-lo para o flanco esquerdo do porco para acessar a parte superior do abdome, fígado e vasos linfáticos. Fixe o intestino exteriorizado na posição com cortinas toalhas adicionais para formar um estilingue para apoiar delicadamente o intestino.
4. Localize o vaso linfático, estabelece aproximadamente 4 cm crânio-medial da veia renal direita, 6 cm ventral caudal-medial- dos capatazes cava e sob o aspecto visceral do lobo direito do fígado perto do pâncreas ^22,36,37. Identificar o vaso linfático como uma estrutura transparente justaposto ao segmento ventral direito da veia porta ^36,37.
5. Separe o Vess linfáticael dos fascia em torno suavemente provocando afastado o tecido anexado com aplicadores Q-tip. Uma vez que os aspectos laterais do recipiente são separados a partir do tecido circundante, criar uma abertura "túnel" debaixo do navio com excelentes sem corte com ponta fórceps.
6. Passe três 2-0 suturas de seda por baixo do vaso linfático com uma pinça fina. Ligadura da sutura mais caudal primeira para ocluir, dilatar e encher o recipiente com linfa. Propositadamente deixar as extremidades deste fio de sutura relativamente longo (4 cm), para fixar o cateter para o vaso linfático. Colocar duas outras suturas separadas de 1,0 cm um do outro e são de aproximadamente 1,0-1,5 cm cranianos à sutura caudal garantido. Deixar estas duas suturas com um "laço solto ligadura único" para permitir a fixação mais rápido do cateter para dentro do vaso.
   Nota: O segmento do vaso linfático localizado entre o fio de sutura liga�o da sutura e mais caudal do meio (de as duas suturas cranianas) é o local para a cateterização. Em relação sumaterial de ture, poliglactina 2-0 sutura pode substituir o fio de seda 2-0, se necessário.
7. Corte um pequeno buraco dentro do vaso com íris tesouras e dilatar o vaso com uma pinça sem corte finas. Inserção de aproximadamente 1,0-1,5 cm de tubo de cateter especializado (4,06 Diâmetro exterior (OD) X 2,31 milímetros ID) com uma extremidade chanfrada para dentro do vaso e amarrar as duas suturas cranianas para fixar o cateter no lugar. Use as extremidades longas de sutura da sutura de caudal para fixar o cateter para o recipiente.
8. Lave o intestino exteriorizado com grandes quantidades de solução salina quente e devolvê-lo suavemente para a cavidade abdominal garantindo posicionamento anatômico correto do intestino.
9. Exteriorizar o cateter no flanco meados esquerda (5-10 cm ventral da fossa paralombar). Adicione uma incisão na pele com um bisturi e passar um trocarte a partir da cavidade abdominal para a superfície da pele para criar uma abertura para a exteriorização do cateter. Use um grande fórceps de Kelly para exteriorizar o cateter da cav abdominaldade através da abertura trocar.
10. Fechar o peritônio parietal com um padrão de sutura simples contínua de poliglactina 2-0 sutura com uma agulha rodada (cônico). Feche as camadas musculares abdominais com um padrão de sutura simples interrompido com uma sutura de poliglactina 2-0 em uma agulha rodada.
11. Feche a pele em um padrão subcuticular com poliglactina 2-0 sutura em uma agulha de corte. Fixe o cateter exteriorizada na pele com um padrão de sutura em bolsa e uma sutura 2-0 nylon em uma agulha de corte.
12. Coloque um revestimento especializado no porco enquanto ainda anestesiados para facilitar sua colocação e reduzir o estresse do porco durante a recuperação.

Recuperação 3. pós-cirúrgica e Cobrança A linfa

1. Cerca de 10 minutos antes da interrupção da anestesia inalatória, administrar bupenorphine (0,1 mg / kg) por via intramuscular para fornecer imediato analgesia pós-cirurgia. Continuar bupenorphine (0,1 mg / kg) a cada 12 h durante 24-48 h, para manteranalgesia pós-cirurgia.
2. Monitorar os porcos para complicações pós-cirúrgicas a cada 8-12 horas, por um período de 7 dias.
3. Recolha a linfa em 500 ml de frascos de lavagem de polipropileno, revestido com ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), e suplementado com antibióticos; penicilina (6000 UI), estreptomicina (6 mg) e anfotericina B (3 mg) a cada 12 h durante um período de 7 dias.

4. Quantificação de Lipoproteína apoB48, triglicerídeos, colesterol e proteína total arrecadado de linfa

1. Centrifugar a amostra de linfa a 1.800 xg durante 5 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e usá-lo para a quantificação de triglicéridos, colesterol e proteína total.
2. Divide-se o sobrenadante em três amostras: uma amostra não diluída, uma amostra diluída 1:20 água destilada e uma amostra final foi diluído 1: 100 com água destilada.
3. Utilizar o sobrenadante não diluído para medir os níveis de colesterol, com um kit disponível comercialmente.
4. Use a 1:20 e 1:100 amostras diluídas para medir triglicérido e os níveis totais de proteína com um kit comercialmente disponível e o ensaio de proteína total de ácido bicinconínico respectivamente.

5. Quantificação de Lipoproteína apoB48, coletados a partir de linfa ³⁸

1. Determinar a concentração de lipoproteína de apoB48 com um método imunológico Ocidental adaptado Blotting ^38. linfa total de separada, com 3-8% de dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida Tris-etilo-(SDS-PAGE).
2. Transferir as proteínas separadas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (0,45 um) e incube-as com um anticorpo policlonal de cabra para a ApoB (1: 4000), então ligá-lo com um anticorpo secundário anti-cabra.
3. Quantificar a lipoproteína apoB48 com quimiluminescência usando uma comparação densitométrica linear com padrão de proteína apoB48 purificado roedor.

Resultados

cateterismo linfática do tronco linfático intestinal de suínos neonatal permite a coleta de cerca de 1 L / 24 hr da linfa centro durante um período de 7 dias. A linfa recolhida neste experiências continha componentes do metabolismo de lípidos, proteínas ou seja total de linfa, apoB48 lipoproteína, triglicéridos, proteína total, e colesterol. Tabela 1 destaca valores representativos destes componentes lipídicos de amostras linfáticos agrupados de três porcos. Notavelmente, o fluxo de linf...

Discussão

Coleta de linfa intestinal é um excelente método para investigar mecanismos envolvidos na lipídico ^8-12 e ^13-15 de drogas metabolismo, a metástase do câncer ^16,17, o tráfico de celular e função imunológica ^18-26, em vários modelos animais experimentais. Com efeito, a capacidade de colher grandes quantidades de um ou outro periférico (aferente) e central (eferente e grandes vasos do tronco) linfa durante um período prolongado tem sido particularmente importante para compreender...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâmina de laringoscópio Miller	Welch Allyn	68044	182 mm de comprimento
Consultor Surgivet: Monitor de sinais vitais	Surgivet	V9203
Sonda de temperatura retal	Surgivet	V3417
Gerador de eletrocirurgia monopolar	Valley Lab
Tesoura Metzenbaum	Fine Science	14518-18
Retrator Tuffier	Stevens	162-11-676
Pinça Mosquito	Stevens	162-7-10
Kelly pinça curvada (14cm)	Stevens	162-7-38
Pinça de tecido Allis	Stevens	162-7-38
Pinça curativo-olho (10,2cm)	Stevens	162-18-780
Fórceps curativo-Adison (12,1cm)	Stevens	162-17-2510
Chaves de Agulha	Stevens	162-V98-42
Tesoura de íris	Fine science	14058-11
Bomba de circulação de água	Jorvet	J-783X
Maxitherm-Vinyl blanket	Jorvet	J-784C
Q tip aplicadores	Fisher Scientific	22-037-960
Cateterismo  tubulação (4,06 OD X 2,31 ID)	Braintree Scientific Inc.	MRE-160	Tubo de implantação de micro-renatano
2-0 sutura de seda	Ethicon	LA556
2-0 sutura de poliglactina	Ethicon	J443H	2-0 vicryl
Jaqueta de animal grande	Lomir Biomedical Inc.	SSJ2YC
Frascos de lavagem de polipropileno	Fisher Scientific	03-409-22C	500 ml
Penicilina-estreptomicina	Sigma Aldrich	D4333
EDTA	Sigma Aldrich	60-00-4
Anfotericina B	Sigma Aldrich	A2411
Azaperone	Elanco Saúde		Stresnil
Cloridrato de Dexmedetomidina	Zoetis	6295	Dexdomitor
Isoflurano	Abbott Animal  Saúde	05260-5	cetamina IsoFlo
	Zoetis	2626	Cloridrato
bupenorfina	Champion Alstoe Saúde		DIN:02347510
6 mm Tubo endotraqueal	Jorvet	J-165d
10% Spray de lidocaína	AstraZeneca		DIN:02003767
4% Clorexidina esfoliação cirúrgica	Partnar Animal Health	PCH-011	Diluído: solução a 2,0%
cirúrgico 3M 3M	Health Care	1040
SDS page gel	Invitrogen	EA0375BOX	3-8% tris acetato
Membrana de fluoreto de polivinilideno	Millipore	IPVH00010	0,45 μ m tamanho de poro
ApoB anticorpo	EMD Millipore	AB742	diluição 1:4000
Burro anti-cabra IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2304
ECL Prime Western Blotting	Reagent GE Healthcare LifeSciences	RPN2232
Kit de Triglicerídeos	Wako Pure Chemicals	998-40391/994-40491
Kit de Colesterol Total	Wako Pure Chemicals	439-17501
Proteína Total	Perfurar	23225	Ensaio de ácido bicinconínico