Artigo de método

Preparação de Thermoresponsive nanoestruturados Surfaces para Engenharia de Tecidos

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DOI:

10.3791/53465

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1 de março de 2016

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1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

Neste artigo

Resumo

Superfícies de ilhas marinhas nanoescalonadas compostas de copolímeros em bloco termorresponsivos foram fabricadas pelo método de Langmuir-Schaefer para controlar a adesão e o desprendimento espontâneo de células. Tanto a preparação da superfície quanto a adesão e descolamento das células na superfície foram visualizadas.

Resumo

Superfícies termorresponsivas poli(N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) imobilizadas para controle da adesão e descolamento celular foram fabricadas pelo método de Langmuir-Schaefer. Copolímeros em bloco anfifílicos compostos de poliestireno e PIPAAm (St-IPAAms) foram sintetizados por polimerização radical reversível por transferência em cadeia de fragmentação por adição (RAFT). Uma solução de clorofórmio de moléculas de St-IPAAm foi gentilmente colocada em um aparelho de calha de Langmuir, e ambas as barreiras do aparelho foram movidas horizontalmente para comprimir o filme para regular sua densidade. Em seguida, o filme St-IPAAm Langmuir foi transferido horizontalmente para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado por um dispositivo fixado na superfície. As imagens de microscopia de força atômica revelaram claramente estruturas de ilhas marinhas em nanoescala na superfície. A força, a taxa e a qualidade da adesão e descolamento celular na superfície preparada foram moduladas por mudanças na temperatura na faixa de temperatura da solução crítica inferior das moléculas de PIPAAm. Além disso, uma estrutura celular bidimensional (folha celular) foi recuperada com sucesso nas superfícies otimizadas. Essas superfícies PIPAAm exclusivas podem ser úteis para controlar a força de adesão e descolamento celular.

Introdução

superfícies nanoestruturados têm atraído recentemente a atenção substancial devido às suas várias aplicações potenciais, incluindo padronização, cultura de células, limpeza, e comutação de superfície. Por exemplo, as superfícies hidrofóbicas inspirados na nanoestrutura da folha de lótus e outras superfícies sensíveis são capazes de reagir a estímulos externos 1-4.

O filme de Langmuir é um dos revestimentos de polímero mais amplamente estudados. Um filme de Langmuir é formada por moléculas anfifílicas deixando cair sobre uma interface ar-água 08/05. A película pode então ser transferida para uma superfície sólida por adsorção física ou química, e a conformação molecular sobre uma superfície sólida pode ser controlada usando métodos de transferência verticais e horizontais 9-12. A densidade do filme de Langmuir podem ser regulados com precisão por compressão da interface ar-água. Recentemente, este método também tem se mostrado eficaz para a fabricação nanométricos structur-ilha do marES, utilizando copolímeros de bloco anfifílicos. As nanoestruturas são considerados para consistir de um núcleo de segmentos hidrófobos e uma concha de segmentos hidrofílicos 13-17. Além disso, o número de nanoestruturas sobre uma superfície é regulada, controlando a área por molécula de (A m) do copolímero de bloco na interface.

Nós nos concentramos em um original, abordagem de engenharia de tecido sem andaime única, engenharia camada de células, usando uma superfície de cultura termicamente reativo. A tecnologia desenvolvida foi aplicada a terapias de regeneração para vários órgãos 18. Uma superfície de cultura de temperatura-sensível foi fabricado por enxerto de poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), uma molécula de temperatura-sensível, para uma superfície de 19-27. PIPAAm e seus copolímeros exibem uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), em meio aquoso, a temperaturas próximas de 32 ° C. A superfície da cultura também exibiu uma temperatura alternati-responsivo em entre hidrofobicidade e hidrofilicidade. A 37 ° C, a superfície tornou-se PIPAAm-enxertado hidrofóbico, e as células proliferaram rapidamente ligados e sobre a superfície, bem como sobre poliestireno de cultura de tecidos convencional. Quando a temperatura foi baixada para 20 ° C, a superfície tornou-se hidrófila, e células espontaneamente isolada a partir da superfície. Portanto, células confluentes cultivadas na superfície poderia ser colhida como uma folha intacta, alterando a temperatura. Estas propriedades de adesão celular e descolamento também foram exibidos por uma superfície fabricada por revestimento de película Langmuir para o laboratório de demonstração 26, 27. Um filme de Langmuir de copolímeros em bloco composto por poliestireno (P (St)) e PIPAAm (St-IPAAM) foi fabricada. O filme de Langmuir com uma específica Um m poderia ser horizontalmente transferidos para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado. Além disso, foram avaliadas a adesão celular ligado e desprendimento da superfície preparada em resposta à temperatura.

_content "> Aqui, nós descrevemos protocolos para a fabricação de uma película de Langmuir nanoestruturada composto de copolímeros em bloco anfifílicos termo-sensível sobre um substrato de vidro. O método pode fornecer uma técnica de fabricação eficaz para nanofilmes orgânicos em vários campos da ciência superfície e podem facilitar mais controlo eficaz da adesão celular e descolamento em espontânea a partir de uma superfície.

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Protocolo

1. Síntese de poli bloco Polystyrene- (N -isopropylacrylamide) por duas etapas reversível adição-fragmentação cadeia de transferência (RAFT) polimerização por radicais

  1. Dissolve-se estireno (153,6 mmol), 4-ciano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) ácido sulfanylpentanoic (ECT; 0,2 mmol), e 4,4'-azobis (ácido 4-cianovalérico) (ACVA; 0,04 mmol) em 40 ml de 1, 4-dioxano. Congelar a solução em azoto líquido sob vácuo durante 15-20 min para remover as espécies reactivas e gradualmente descongelar à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução é completamente descongelado e repetir este freeze-bomba de degelo ciclo de desgaseificação três vezes.
  2. Obter o poliestireno (PSt) (PM: 13.500) como um agente RAFT macro de polimerização a 70 ° C durante 15 h num banho de óleo.
  3. Precipitado PSt agente macro balsa com 800 ml de éter e seco em vácuo.
  4. Dissolver IPAAM monómero (4,32 mmol), PSt agente RAFT macro (0,022 mmol), e ACVA (0,004 mmol) em 4 ml de 1,4-dioxano.
  5. Removero oxigénio na solução pelos ciclos de desgaseificação congelamento-descongelamento-bomba tal como mencionado no passo 1.1.
  6. Executar uma polimerização a 70 ° C durante 15 h num banho de óleo depois de desgaseificação. Obter molécula sintetizada St-IPAAM (PM: 32.800), da mesma maneira como o agente de macro RAFT PST.

2. Preparação de substratos de vidro silanada hidrofóbica Modificados

  1. Lavar substratos de vidro (24 mm x 50 mm) com um excesso de acetona e etanol e sonicado durante 5 min para remover os contaminantes da superfície.
  2. Secam-se os substratos num forno a 65 ° C durante 30 min. Em seguida, usar plasma de oxigénio (400 W, 3 minutos) para activar as superfícies dos substratos à TA.
  3. Mergulhar os substratos em tolueno contendo 1% hexyltrimethoxysilane durante a noite a RT para silanizar o substrato.
  4. Lavar os substratos silanizadas em tolueno e mergulhe em acetona durante 30 min para remover os agentes que não reagiram.
  5. substratos recozimento durante 2 horas a 110 ° C para imobilizar completamente o Sseu rosto.
  6. Corte os substratos silanizadas por um cortador de vidro de 25 mm x 24 mm para caber os pratos de cultura de células (tamanho prato: φ35 mm).

3. Preparação de Langmuir Films ea superfície transferida-Film

  1. Colocar o aparelho de Langmuir película num gabinete para evitar a acumulação de poeiras.
  2. Lava-se a calha de Langmuir (tamanho: 580 milímetros x 145 mm) e as barreiras com água destilada e etanol, para remover contaminantes.
  3. Seque o cocho e barreiras, limpando com uma toalha sem fiapos. Em seguida, preencher a calha com aproximadamente 110 ml de água destilada, e ajustar as barreiras de ambos os lados da calha. Note-se que a água destilada devem ser adicionados sem que se prolonga nos seguintes passos 3,5-3,13.
  4. Aquece-se uma placa de Wilhelmy platina (perímetro: 39,24 milímetros) para a monitorização da tensão de superfície com um queimador de gás até que a placa torna-se vermelha e, em seguida, lava-se com água destilada para remover os contaminantes. Suspender a placa de Wilhelmy em um fio ligado ao instrumento da superfície à pressão medida.
  5. Zerar o instrumento-surface-medição de pressão de acordo com o protocolo do fabricante. Comprimir a interface ar-água na calha por as barreiras em ambos os lados da calha até que a interface atinge cerca de 50 cm 2, sem quaisquer gotas de polímero.
  6. Aspirar pequenos contaminantes até que a pressão de superfície é cerca de 0 mN / m.
  7. Reposicionar as barreiras de ambos os lados, e adicionar água destilada para compensar a diminuição de água destilada a partir do passo 3.6.
  8. Dissolve-se 5 mg de a molécula de St-IPAAM sintetizado em 5 ml de uma solução de desenvolvimento de clorofórmio.
    Nota: diclorometano ou tolueno, também podem ser usados ​​como o solvente.
  9. Gentilmente queda de 27 ul de St-IPAAM dissolvidos em clorofórmio para a calha utilizando uma micro ou micropipeta.
  10. Após uma espera de 5 minutos para permitir a evaporação completa de clorofórmio, mover as duas barreiras horizontalmente para comprimir o molecu St-IPAAMle na interface. Manter a taxa de compressão das barreiras a 0,5 mm / seg, até a área de alvo de 50 cm 2 é alcançado.
    Nota: A taxa de compressão rápida provoca defeitos no filme de Langmuir.
  11. Medir a pressão de superfície (π) -A m isotérmicas com a platina placa de Wilhelmy anexada ao instrumento-surface-medição de pressão durante a compressão de acordo com o protocolo do fabricante.
  12. Depois de atingir o tamanho da área de alvo, manter a superfície durante 5 min para permitir que as moléculas de St-IPAAM para relaxar; as moléculas não atingem o equilíbrio imediatamente após a compressão.
  13. Transferir o filme de Langmuir para um substrato de vidro hidrofobicamente modificado usando um aparelho de transferência durante 5 minutos para adsorver robustamente o filme. Fixar o substrato de vidro hidrofóbicas em paralelo no dispositivo. Conecte o dispositivo a uma fase de alinhamento e mover-se perpendicularmente.
  14. Levantar o substrato horizontalmente com o aparelho de transferência e seco durante 1 dia num desiccator.

4. a cultura de células e Otimização de adesão celular e destacamento na superfície Transferido Langmuir Film

  1. Para preparar as suspensões de células, células endoteliais de cultura bovina da artéria carótida (BAECs) a um terço confluência a 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de ar em polistireno para cultura de tecidos (TCPS), com Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo 10% de fetal de soro de bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina.
  2. Após confluência é atingido, tratar BAECs com 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C em 5% de CO 2 e 95% de ar.
  3. Desactivar a tripsina-EDTA, adicionando 10 ml de DMEM contendo FBS a 10%, e recolher a suspensão de células para um tubo de 50 ml.
  4. Centrifugar a 120 xg durante 5 min, e o sobrenadante aspirado. Re-suspender as células com 10 ml de DMEM.
  5. Coloque as superfícies St-IPAAM sob luz ultravioleta sobre uma bancada limpa para esterilizar por 5 min.
  6. Semear o ce recuperadolls sobre o St-IPAAM superfícies a uma concentração de 1,0 x 10 4 células / cm2 contados por um hemocitómetro descartável e observar as células sobre as superfícies de um microscópio equipado com uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% ar.
    Nota: Esterilizar as superfícies St-IPAAM por luz ultravioleta equipado para uma bancada limpa.
  7. Gravação de imagens de lapso de tempo de BAECs aderentes para cerca de 24,5 horas a 37 ° C por um microscópio de contraste de fase com aumento de 10x. Após BAEC adesão, ficha descolamento das BAECs da superfície de St-IPAAM a 20 ° C durante cerca de 3,5 h.

Fabricação de chapas 5. celular nas superfícies Langmuir Film-transferidos

  1. BAECs cultura utilizados da mesma maneira descrita na Secção 4.
  2. Semente um total de 1,0 x 10 5 células / cm2 em superfícies St-IPAAM e incubar durante 3 dias a 37 ° C em 5% de CO 2. Confluente BAECs espontaneamente isolada a 20 ° C.

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Resultados

Os copolímeros em bloco compostos por poliestireno e poli (-isopropylacrylamide N) (St-IPAAms) com pesos moleculares específicos foram sintetizados por polimerização de radicais TRAF. ECT foi preparado como um agente de transferência de cadeia como descrito no Moad et ai. 28. Duas moléculas de St-IPAAM de diferentes comprimentos de cadeia PIPAAm foram sintetizados, e os polímeros em bloco obtidos foram caracterizados por 1H ressonância magnética nu...

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Discussão

Uma superfície termicamente reativo foi fabricado pelo método de Langmuir-Schaefer, e as propriedades de superfície para adesão celular / descolamento e a folha de célula de recuperação foram optimizados. Ao utilizar este método para a fabricação de superfícies, vários passos são críticos. A composição molecular das moléculas de St-IPAAM tem um grande efeito sobre a estrutura da superfície e a estabilidade da superfície, e, por extensão, a adesão celular e descolamento. Em particular, as moléculas de St-IPAAM deve ter u...

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Divulgações

Todos os autores contribuíram igualmente para a redação do manuscrito e aprovaram a versão final. Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado financeiramente pelo Projeto de Desenvolvimento de Sistemas de Inovação "Cell Sheet Tissue Engineering Center" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
N-isopropilacrilamidaKohjinSem número de catálogo
Azobis(ácido 4-cianovalérico)Wako Pure Chemicals016-19332
EstirenoSigma-AldrichS4972
1,3,5-trioxanoSigma-AldrichT81108
1,4-DioxanoWako Pure Chemicals045-24491
DMEM Sigma D6429
PBSNakarai11482-15
EstreptomicinaGIBCO BRL15140-163
PenicilinaGIBCO BRL15140-122
Tripsina-EDTASigmaT4174
FBSJapão BioserumJBS-11501
BAECsde Recursos de Pesquisa em Ciências da SaúdeJCRB0099
Vidros de coberturaIndústria de vidro de MatsunamiC024501
AFM NanoScope VVeeco
1H NMR INOVA 400Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPCTosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000Calhas
Langmuir-BlodgettKSV InstrumentsKN 2002KSV NIWA Midium através
ECLIPSE TE2000-UNikon
Banco de Deposição Tosoh Nikon

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