Um protocolo é descrito para a preparação de espalhamentos cromossômicos mitóticos de alta qualidade por um método de gota rápida e seca ao ar adequado para a detecção de FISH de sondas de DNA de cópia única e alta.
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Artigo de método
Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Preparação dos spreads de cromossomos é um pré-requisito para o bom desempenho de hibridização fluorescente in situ (FISH). Preparação de alta qualidade para barrar planta cromossômicas é desafiador devido à parede celular rígida. Um dos métodos aprovados para a preparação dos cromossomas de plantas é uma preparação gota chamada, também conhecido como espalhando-gota ou técnica de secagem ao ar. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação rápida do cromossomo mitótico espalha adequado para a detecção de sondas de DNA FISH individuais e elevado número de cópias. Este método é uma variante melhorada do método de gota, seca ao ar realizada sob uma humidade relativa de 50% -55%. Este protocolo compreende um número reduzido de etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Óbvios benefícios desta abordagem são bem-propagação, cromossomos metafásicos não danificadas e numerosos que servem como pré-requisito perfeito para análise FISH bem sucedido. Usando este protocolo obtivemos chrom de alta qualidadeosome spreads e resultados PEIXES reprodutíveis para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
Introdução
Hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma ferramenta eficaz para o mapeamento físico de sequências de cópia única e de alta no nível cromossômico. Pré-requisito é a preparação dos spreads de cromossomos de alta qualidade. Não existe um protocolo de preparação geral descrito cromossoma que seriam igualmente adequados para células animais e vegetais. Preparação dos cromossomas de plantas é particularmente difícil devido à rígida parede celular e vários consistência citoplasma dentro de espécies diferentes. Um dos métodos mais favoráveis para a preparação dos cromossomas de plantas é uma assim chamada técnica de gota também conhecida como técnic....
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Protocolo
1. Preparação Chromosome
- A germinação das sementes e fixação de pontas de raiz
- 10-20 germinar sementes de cevada em duas camadas de papel de filtro húmido numa placa de Petri em condições escuras durante 2 dias a 22-24 ° C. Cortar raízes vigorosos com o comprimento de 1-2 cm a partir da semente, utilizando uma lâmina de barbear.
- Prepare água gelada, colocando uma garrafa de vidro de 500 ml contendo água fria da torneira em esmagado gelo-água. Arejar a água gelada e mergulhe dicas de raiz durante 20 horas para aumentar a freqüência de células em metafase.
- Transferir raízes a partir de água a 50 ml de etanol: ácido acético (3: 1)....
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Resultados
Lâminas microscópicas com os diferenciais de mitose em metafase foram preparados pelo método de preparação rápida, seca ao ar de gotejamento cromossoma descrito acima (Supl. Figura 1). Análise dos peixes foi realizada utilizando ambos, seqüências repetitivas e de cópia única. As imagens foram obtidas através de um microscópio de epifluorescência, com um conjunto de filtros que permitem excitação de fluoróforos correspondentes e captada por uma câmara CCD monocromática de alta sensibilidade. Para a aquis.......
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Discussão
O experimento cromossoma preparação foi levada a cabo usando raízes novas de cereais pertencentes à família das gramíneas (Poaceae). Todas as espécies analisadas têm 14 relativamente longo mitóticas cromossomos metafásicos (11-15 um) no conjunto de genoma diplóide e pertencem a espécies de grande genoma (5,1-7,9 GBP).
Comprimento de raízes germinadas não era mais do que 2 cm, para se obter um máximo de tecido meristemático. Sincronização de células em divisão foi atingido por um 20 horas de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos à DFG pelo apoio financeiro (HO 1779/21-1), bem como a Katrin Kumke e ao Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) pelo aconselhamento técnico.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa Quente | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Celulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Celulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Citohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | fluorocromo direto |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | fluorocromo direto |
| Microscópio de fluorescência | Olympus BX61 | BX61 | |
| Câmera CCD | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Corante | fluorescente | Vector Laboratories H-1200 |
Referências
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al.
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Reimpressões e permissões
