Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

Resumo

Este novo modelo de transplante de membro posterior ortotópico em ratos, aplicando uma técnica manguito não sutura para a anastomose super-microvascular, fornece uma ferramenta poderosa para in vivo pesquisa imunológica mecanicista relacionadas com alotransplante composta vascularizado (VCA).

Resumo

Os sistemas de modelos animais in vivo e, em particular, os modelos de camundongos, evoluíram para ferramentas científicas poderosas e versáteis, indispensáveis à pesquisa básica e translacional no campo da medicina de transplante. Uma vasta gama de reagentes está disponível exclusivamente neste cenário, incluindo anticorpos mono e policlonais para aplicações diagnósticas e intervencionistas. Além disso, um grande número de cepas genotipadas, endogâmicas, transgênicas e nocautes permitem uma investigação detalhada das contribuições individuais dos componentes humorais e celulares para a complexa interação de uma resposta imune e tornam o camundongo o padrão-ouro para a pesquisa imunológica.

O Alotransplante Composto Vascularizado (VCA) delineia um novo campo de transplante usando aloenxertos para substituir "igual por igual" em pacientes que sofrem perda de tecido traumática ou congênita. Este protocolo metodológico cirúrgico mostra o uso de uma técnica de manguito sem sutura para anastomose supermicrovascular em um modelo ortotópico de transplante de membros posteriores de camundongos. O modelo permite especificamente a comparação entre paradigmas estabelecidos no transplante de órgãos sólidos com uma nova forma de transplantes que consiste em vários componentes de tecido diferentes. Excepcionalmente, este modelo permite o transplante de um compartimento e nicho vascularizados viáveis da medula óssea que têm o potencial de exercer um efeito benéfico no equilíbrio da aceitação e rejeição imunológica. Essa técnica fornece uma ferramenta para investigar o reconhecimento de aloantígenos e a rejeição e aceitação do aloenxerto, além de permitir a realização de estudos de regeneração funcional do nervo para avançar ainda mais neste novo campo do transplante.

Introdução

O final dos anos noventa anunciou os dias pioneiros do transplante reconstrutivo com o primeiro transplante de mão bem-sucedido realizado na França em 1998. Desde então, o uso de AVCs para reconstrução de defeitos teciduais devastadores tem sido empregado com sucesso em um amplo espectro de pacientes. Até o momento, o mundo conta com 76 receptores de 112 extremidades superiores, bem como 31 faces ^1-3. Além disso, vários outros tipos de AVCs, como parede abdominal ⁴, laringe ⁵, traqueia ⁶, articulações vascularizadas ⁷ e até pênis ⁸ foram realizados. Além disso, o nascimento vivo de um bebê foi relatado recentemente após o transplante de útero ⁹. Essa crescente experiência mundial é indicativa de como o transplante reconstrutivo se tornou uma opção terapêutica válida para pacientes que sofrem de defeitos teciduais funcionais significativos não passíveis de correção para cirurgia e tratamento reconstrutivo e restaurador convencionais.

Embora a ideia de substituir "semelhante por semelhante" tenha despertado entusiasmo clínico, o ceticismo inicial ainda prevalece em relação aos efeitos colaterais da imunossupressão convencional em altas doses necessária para manter os aloenxertos e sua função ^10,11. No entanto, como mostrado pelo trabalho seminal de Lee et al., esses enxertos compostos são menos propensos a rejeitar do que seus componentes individuais e, além disso, alguns dos componentes do tecido, como o compartimento ósseo vascularizado, alimentaram o otimismo, pois podem exercer efeitos imunológicos únicos no equilíbrio da aceitação e rejeição imunológica ¹².

Nosso grupo foi pioneiro em vários modelos animais microcirúrgicos para transplante de órgãos sólidos, bem como alotransplante composto vascularizado ^13-19. Aqui descrevemos um novo procedimento cirúrgico usando uma técnica de manguito sem sutura para realizar anastomose supermicrovascular em um modelo ortotópico de transplante de membros posteriores de camundongo. Este modelo de transplante fornece uma ferramenta útil para investigar os mecanismos de aceitação e rejeição imunológica, bem como o papel de componentes teciduais individuais, como o compartimento vascularizado da medula óssea, para a indução de tolerância no cenário imunologicamente versátil das espécies de camundongos. Além disso, a colocação ortotópica do membro abre as possibilidades para a regeneração nervosa e estudos de resultados funcionais, que são extremamente importantes para o cenário da AVC.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M108 protocolo ACUC aprovado.

Operação 1. Donor

1. Administrar analgesia no ponto de tempo adequado para cada formulação farmacológica antes da cirurgia. De acordo com a cuidar dos animais aprovados e uso de uso de protocolo 0,1 mg / kg de peso corporal por via subcutânea de buprenorfina 1 hora antes da incisão na pele.
2. Sedar o doador com isoflurano aplicado através de uma câmara ligada a um vaporizador de isoflurano a 4%; manter a sedação e anestesia em 2% por meio de um cone do nariz. Realizar dedo retirada pitada reflexão para monitorizar a profundidade da anestesia antes do início do procedimento.
3. Usar máscaras, batas de isolamento descartáveis ​​e luvas.
4. Raspar o ar cirúrgicaea, em particular a dos membros posteriores e na virilha, e prep com 10% de Povidona - Iodo.
5. Use uma cortina de campo estéril, instrumentos autoclavados e um microscópio de alta ampliação (40x).
6. Adicione virilha incisão na pele com uma tesoura proximalmente para a área do meio da coxa e circunferencialmente ligar a incisão para delimitar o membro posterior a partir do resto do corpo do rato.
7. Identificar e dissecção da artéria femoral, veias e nervos. Separe todas as três estruturas usando fórceps e micro-tesoura.
8. Uma vez que o pedículo vascular é dissecado dividem os vasos no nível do ligamento inguinal utilizando micro tesouras.
9. Em seguida, continuar a dividir os individuais ventral (gracilis e os músculos da coxa medial) e grupos de músculo dorsal ²⁰ proximalmente ao nível do meio da coxa para separar o enxerto a partir do animal dador com uma tesoura.
10. Transecto do fêmur e cortado no meio da haste femoral com uma tesoura.
11. Eutanásia de animais por fol overdose isofluranolowed por deslocamento cervical. Confirmar cessação do batimento cardíaco e respiração.
12. Lavar o membro com 2 ml heparinizados (30 IE) frio (4 ° C) de solução salina usando uma agulha 33 G de lavagem montado sobre uma seringa (ver Materiais Tabela).
13. Coloque um manguito poliimida na veia femoral e da artéria, respectivamente.
14. Enrole enxerto em gaze de algodão molhado, coloque em placa de petri e armazenar a 4 ° C até inserção.

2. Destinatário Operação

1. A remoção do membro posterior
   1. Administrar analgesia no ponto de tempo adequado para cada formulação farmacológica antes da cirurgia. De acordo com a cuidar dos animais aprovados e uso de uso de protocolo 0,1 mg / kg de peso corporal de Buprenorfina SC 1 hora antes da incisão na pele.
   2. Sedar o doador com isoflurano aplicado através de uma câmara ligada a um vaporizador de isoflurano a 4%; manter a sedação e anestesia em 2% por meio de um cone do nariz. Execute toe retirada pitada reflexão para monitorar o depth de anestesia antes do início do procedimento.
   3. Use pomada veterinária sobre os olhos do mouse para evitar a secura e sob anestesia.
   4. Raspar a área cirúrgica, em particular a dos membros posteriores e na virilha e prep com 10% de Povidona - Iodo.
   5. Adicione virilha incisão na pele com uma tesoura proximalmente para a área do meio da coxa e circunferencialmente ligar a incisão para delimitar o membro posterior a partir do resto do corpo do rato.
   6. Identificar e dissecção da artéria femoral, veia e nervo e separar todas as três estruturas usando fórceps e micro-tesoura.
   7. Uma vez que o pedículo vascular é dissecado, apertar os vasos femorais ao nível do ligamento inguinal.
   8. Cortar os vasos distais ao nível da artéria epigástrica superficial.
   9. Em seguida, continuar a dividir os individuais ventral (gracilis e músculos da coxa medial) e grupos musculares dorsais ²⁰ proximal ao nível do meio da coxa para separar o li traseira nativamb dos animais receptores usando uma tesoura.
   10. Transecto fêmur no meio do eixo femoral com uma tesoura.
   11. Cauterizar músculos da coxa anteriormente transeccionados para evitar sangramento do local de dissecção e, portanto, a perda de sangue destinatário.
2. Implantação
   1. Minimizar a perda de fluido por irrigação do campo operatório com solução salina quente (37 ° C) e injectando 0,3 ml de solução salina quente antes e depois da operação.
   2. Coloque o enxerto de uma forma que reflete a posição anatômica precisa do membro posterior nativa alinhando o osso do fémur do destinatário e do enxerto e conectá-los usando uma agulha espinhal 20 G como uma haste intramedular.
   3. Coapt os grupos musculares ventral e dorsal, utilizando material de sutura absorvível (6-0 Polysorb).
   4. Ligue os vasos femorais, utilizando a técnica do manguito não sutura; em detalhe, puxar para o lado do receptor do recipiente sobre os punhos anteriormente montado no recipiente de termina do Graft. Use um Nylon sutura 10-0 e realizar uma ligação periférica para corrigir o navio receptor para o manguito.
   5. Próximo liberar as braçadeiras. Nesta fase, verificar visualmente rotação punho e posicionamento ideal para evitar mis-rotação e dobras dos vasos.
   6. Execute hemostasia meticulosa usando cautério electro com um foco particular na interface doador destinatário muscular e as extremidades ósseas.
   7. Feche a pele usando suturas de nylon não-absorvíveis (6-0 ethilon).
   8. Estabelecer condições normotermicos, permitindo que o animal a se recuperar em sua gaiola sob uma lâmpada de aquecimento. Continue acompanhamento regular por pelo menos 4 horas antes de retornar para a instalação de habitação.
   9. Proporcionar analgesia pós-operatória com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg SC cada 6-8 horas durante 3 dias.

Resultados

Executando alotransplante compósito vascularizada num modelo de ratinho utilizando uma técnica não-sutura braçadeira permite atingir uma excelente e de longa sobrevivência do enxerto prazo e animal, tal como mostrado na Figura 1. Além disso, representa um método confiável para a obtenção de resultados reprodutíveis de rejeição de aloenxertos gradual no compósito vascularizado alotransplante como documentado por as imagens mostradas na Fi...

Discussão

Vascularizado Composite Alotransplante, como membro superior e transplante de rosto para reconstrução de defeitos de tecidos devastadores, tem evoluído como uma opção de tratamento válida para pacientes não alterada para procedimentos reconstrutivos convencionais. Os avanços técnicos no campo da microcirurgia reconstrutiva, bem como uma vasta experiência com potente terapêuticas imunossupressoras e imunomoduladoras em transplante de órgãos sólidos, agora permite a sobrevivência do enxerto a longo prazo nesta população d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sutura, 6-0 Nylon	MWI	31849
Sutura, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Sutura, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Tubo de Poliimida, Tamanho 25	Vention Medical	141-0023
Tubo de Poliimida, Tamanho 27	Vention Medical	141-0015
Braçadeiras Microvasculares (Únicas)	Synovis	00396
Pinças Microvasculares (Duplas)	Synovis	00414
Micro-Tesoura	Synovis	SAS-18
Micro-Fórceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilatadores	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Agulha	Synovis	C-14
Aplicador de Micro-Clamp	Synovis	CAF-4
Agulha de Micro-Lavagem	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Solução de Ringers com lactato	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorfina			Número DEA necessário; Obtido na farmácia hospitalar.
Enrofloxacina; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparina			Obtido na farmácia hospitalar