A ressecção apical mouse modelo para estudar precoce Regeneração Mammalian Coração

Resumo

Um protocolo de vídeo passo a passo de ressecção apical é demonstrado neste estudo. A ressecção apical é uma abordagem cirúrgica recentemente destacada na pesquisa de regeneração cardíaca de mamíferos. Este estudo pode promover a aplicação da ressecção apical como metodologia padrão na pesquisa sobre o mecanismo subjacente à regeneração cardíaca.

Resumo

A doença cardiovascular assola o mundo inteiro devido a mudanças de estilo de vida intensivos. A regeneração do coração é uma grande promessa para reparar e restaurar cardiomiócitos perdidos devido a lesões e doenças. Em contraste com a regeneração cardíaca robusta de certos vertebrados inferiores, corações de mamíferos adultos mostram tipicamente uma capacidade mínima para a regeneração cardíaca e reparação. No entanto, estudos recentes têm suscitado interesse científico considerável com a constatação de que, entre o dia pós-natal 1-7 (P1 a P7), o coração neonatal do rato mantém potencial regenerativo significativa após a ressecção apical (ou seja, a amputação cirúrgica e exposição do ápice ventricular esquerda). Uma grande controvérsia sobre este achado pode ser devido aos procedimentos relacionadas à cirurgia diversos usados ​​em esforços para replicar ou expandir sobre esta importante descoberta. Estas instruções apresentar dinamicamente os materiais e metodologia para ressecção apical em um modelo de mouse. As etapas mais salientes deste surviva roedorl cirurgia envolve anestesia hipotermia, toracotomia, amputação cirúrgica do ápice ventricular coração, e sutura e recuperação de ratos. A abordagem descrita poderia expandir a aplicação do modelo de rato ressecção apical para a investigação cardiovascular.

Introdução

A expectativa de vida humana prolongada leva a várias doenças relacionadas ao envelhecimento e ao estilo de vida, incluindo insuficiência cardíaca, uma das principais causas de mortalidade. No entanto, sem a substituição de células musculares cardíacas perdidas ou disfuncionais, a terapêutica atual só pode melhorar transitoriamente a função cardíaca^{1, 2}. Assim, é necessário descobrir e desenvolver estratégias inovadoras para regeneração e reparo cardíaco. O coração de mamíferos adultos tem potencial regenerativo limitado. Estudos de vertebrados inferiores, como anfíbios urodele e peixes teleósteos, forneceram informações sem precedentes sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à regeneração do coração^{3, 4}. Recentemente, surgiu um modelo de camundongo neonatal de regeneração cardíaca que pode permitir a identificação e caracterização de eventos fisiopatológicos mais evolutivamente conservados necessários para a regeneração cardíaca humana⁵.

A ressecção apical refere-se à remoção cirúrgica do ápice do ventrículo esquerdo. Este procedimento é restrito a camundongos de 1 a 7 dias de idade (P1 a P7) devido à sua alta letalidade em camundongos mais velhos⁶. Espera-se que o processo de regeneração cardíaca em camundongos neonatais após a ressecção apical seja o seguinte: (I) formação rápida e eficaz de um hematoma para selar o ápice e prevenir a exsanguinação; (II) regeneração de cardiomiócitos e restauração da função sistólica^{5, 7}. Trabalhos recentes têm estimulado o debate sobre o significado e a eficiência desse modelo^8-11. Assim, é importante apresentar a ressecção apical de forma clara e detalhada. Para esse fim, este protocolo descreve de forma vívida e específica um vídeo de como fiz a ressecção apical com base em um protocolo anterior⁶.

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração cardíaca é importante para o tratamento de doenças cardíacas caracterizadas por perda e/ou lesão de cardiomiócitos, como insuficiência cardíaca^{1, 2}. Dado o progresso atual e promissor da ressecção apical na pesquisa de regeneração cardíaca, este estudo poderia promover o uso dessa técnica e seus usos na pesquisa de regeneração cardíaca.

Protocolo

Todas as experiências do rato foram aprovados pelo Animal Care e Use Program no National Institutes of Health (NIH) com número de protocolo H0083R3. O NHLBI IACUC aprovou o protocolo sem analgésicos.

1. Hipotermia Anestesia em Neonatal Mice

1. Esterilizar esponjas e equipamento cirúrgico em autoclave antes da cirurgia. Preparar todos os materiais cirúrgicos e ligar um esterilizador quente talão 15-20 minutos de antecedência para chegar a 240 ° C a 270 ° C.
2. Transferir todos os camundongos C57BL / 6 filhotes (idade P1) de sua mãe que amamenta a uma gaiola limpa rato com roupas de cama e materiais de nidificação. Uma vez que as crias são levadas para uma sala de cirurgia, realizar a cirurgia apical rapidamente para minimizar o seu tempo gasto separado da matriz e para reduzir o risco de cannibalization materna.
3. Coloque esponjas em uma cama de gelo e, em seguida, colocar um filhote de cachorro na esponja para ~ 3 min para conseguir anestesia hipotermia. Confirme anestesia observando apnea e acinesia e beliscar um pé de trás. Verifique o status de recém-nascidos com freqüência porque muito pouco tempo não vai fazer o akinetic filhote de cachorro e apnéia, e uma duração excessiva da anestesia pode diminuir a taxa de sobrevivência ^12.

2. Thoracotomy

1. Transferir o filhote de cachorro da cama de gelo para uma área de bancada cirúrgica e usar a fita para imobilizar os braços, pernas e cauda em uma posição supina.
2. Desinfectar o peito usando betadine e gentilmente limpe-o com um pano com álcool prep 70%.
3. Faça uma incisão transversa da pele ao longo da área intercostal diante da cavidade torácica através de um Vannas Primavera Scissor, e, em seguida, sem corte dissecar os músculos intercostais adiante para facilitar o acesso ao coração.
   NOTA: As taxas de sobrevivência melhoraram quando a perda de sangue é minimizada durante o processo cirúrgico.

3. A amputação cirúrgica do Ventricular Apex Coração

1. Ao lado, aplicar suavemente a pressão sobre o abdômen para exteriorizar ovértice do coração. Absorver o sangue ao redor da área cirúrgica com aplicadores com ponta de algodão estéreis para visualização clara. Para recém-nascidos de controle operados por simulação, prossiga diretamente para a Etapa 4 (Sutura e Recuperação de Mice).
2. Sob uma lente de aumento e usando uma tesoura iridectomia, realizar suavemente ressecção fragmentada do ventrículo esquerdo (VE), até que a câmara de LV é exposto. Tenha cuidado para minimizar as porções ressecados da LV. Aproximadamente 15% a ressecção é necessária para alcançar uma exposição óptima da câmara LV.
3. Assegure-se que o coração retorna para a cavidade torácica, uma vez que a câmara LV é exposta.

4. Sutura e Recuperação de Mice

1. Suturar as costelas e músculos juntos para selar a cavidade torácica utilizando suturas estéreis prolina 6-0, e em seguida, feche cuidadosamente o local da incisão da pele usando cola de pele.
2. Aqueça o recém-nascido sob um calor luminária para ~ 3 min de recuperação, e, em seguida, limpar o sangue e vestígios de cola usando uma compressa embebida em álcool 70% prep before reintroduzir-lo aos seus irmãos. Tente completar todo o procedimento cirúrgico dentro de 10 min porque minimizando o tempo gasto separada da mãe melhora a sobrevivência das crias após a ressecção apical.
3. A seguir a cada cirurgia, colocar os instrumentos cirúrgicos em contacto com os grânulos do esterilizador talão quente para aproximadamente 20 segundos para a esterilização completa. Permitir que os instrumentos cirúrgicos arrefecer até à TA antes de cada cirurgia.
4. Depois de completar cirurgias para todos os filhotes em uma maca, misture os filhotes com roupa de cama e excrementos da mãe antes de devolvê-los ao ninho da mãe.
   NOTA: Geralmente, ICR / CD-1 ratos são mães adotivas melhor do que C57BL / 6, mas mesmo entre as mães de enfermagem do mesmo fundo genético, os instintos de fomento variar. Se a mudança de uma mãe que amamenta é necessário para reduzir a mortalidade materna por canibalização, retire os filhotes P0 a uma mãe de cuidados e, em seguida, executar a ressecção apical em P1. Apenas a executar qualquer operação simulada ou a r apicalesection em uma ninhada de filhotes, porque a mistura farsa e filhotes cirúrgicos poderia diminuir as taxas de sobrevivência do grupo cirúrgico de filhotes ^6.

5. Análise Pós-Cirúrgica

1. Um dia após a cirurgia, monitorar os filhotes, garantir que não há nenhuma diferença entre os grupos sham e cirúrgicos, e contar o número de filhotes para medir a taxa de sobrevivência. Se as cirurgias são realizadas adequadamente, as taxas de sobrevivência deve ser semelhante e maior do que 60% em ambos os grupos sham e cirúrgicos.
2. Isolamento do coração e fixação.
   1. Euthanize os filhotes nos dias 1 e 2 pós-cirurgia via decapitação e dia 21 pós-cirurgia por CO2 com uma garantia de morte por deslocamento cervical, em seguida, limpar o peito usando uma preparação de álcool 70%.
   2. Faça uma incisão na pele da linha média e músculos do peito e, em seguida, abrir o peito.
   3. Extirpar os corações inteiros a partir da cavidade torácica e corrigir todo o coração de cada amostra em 5 ml de paraformaldeído a 4% O / N à temperatura ambiente.
3. No dia seguinte, a transferência das amostras para etanol a 70%. As amostras podem ser armazenadas até uma semana antes da inclusão em parafina.
4. Fatia cortes de parafina 5 mícrons de espessura através de todo o ventrículo e executar hematoxilina padrão e eosina (H & E) e tricromo de Masson para examinar a resposta regenerativa ^{5, 7.} Especificamente, H & E mancha é usado para examinar substituição muscular e tricrômico de Masson é utilizada para examinar as respostas fibróticas ^5.
5. Selecione a área de interesse e criar pelo menos três focos por amostra manualmente usando um scanner de slides. Imagem e analisar as lâminas de coloração a 40 × ampliação de acordo com as instruções do fabricante, com os parâmetros por defeito.

Resultados

Rato filhotes foram sacrificados 1, 2 e 21 dias pós-ressecção apical, e seus corações foram coletadas para H & E e tricrômico de Masson. Cor azul em tricrômico de Masson indica a deposição de matriz extracelular epicardial ^5. Com ressecção apical bem sucedida, um coágulo de sangue é formado para selar eficazmente a VE um dia pós-ressecção apical, como mostrado na Figura 1A. Uma reabsorção gradual do coágulo sanguíneo e fibrose cardíaca precoce é observada, e sua substitui...

Discussão

A regeneração cardíaca mostra potencial para o tratamento e prevenção da insuficiência cardíaca^{1, 2}. Os modelos animais são indispensáveis e desempenham um papel fundamental na compreensão de como ocorre a regeneração cardíaca^3-6. Muitos anfíbios e peixes regeneram o tecido cardíaco em resposta a lesões, fornecendo informações sobre nossa compreensão das doenças cardiovasculares humanas^{13, 14}. Em termos de evolução, no entanto, a fisiopatologia deve ser mais conservada entre um modelo de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Porta-agulhas Olsen-Hegar com Tesoura, 1.5 mm	Ferramentas de Fine Science	12002-12
Tesoura de Mola Vannas - 2 mm Tesoura	Iridectomia	Ponta Ferramentas de Ciência Fina	15000-03
Esterilizador de Esferas Quentes	Pinça de Íris	18000-45
, Reta, Serrilhada	Ferramentas de Ciência Fina	11064-07
Pinça de Íris, Curvado, Serrilhado	Ferramentas de Ciências Finas	11065-07
Tesoura de Karité - Curvo/Blunt-Blunt/12cm	Ferramentas de Ciências Finas	14105-12
Pinça de Sutura com Cabo Redondo, Reta	Ferramentas de Ciências Finas	18025-12
Tesoura de Mola Vannas com Cabo Redondo	Ferramentas de Ciência Fina	15400-12
Hemostat Fino	Ferramentas	de Ciência Fina13007-12
Lâmpada de Aumento	Luxolamp Corp	IM120
Lâmpada de aquecimento	Brandt Equipment llc	51152/3
6-0 Suturas de Prolene	Ethicon	8889H
Cola para a pele-Adesivo de tecido Vetbond	3M	1469
	Dynarex	4305
WEBCOL Almofada de Preparação de Álcool	Covidien	6818	Médio 2 PLY, 200/CAIXA, Saturado com Álcool Isopropílico 70%
Esponjas de Uso Geral Curity	Covidien	9024	Não Tecido 4 PLY, 4"x4" (10.2cm× 10,2 cm)
Folha protetora de bancada	KIMTECH SCIENCE	7546	18 "x 19,5" (45,72 cm x 49,53 cm) x 50
0,9% Cloreto de sódio, 250ml	Hospira Inc.	NDC 0409-6138-22
Cotonetes de solução Betadine	Purdue Products LP	NDC 67618-153-03
Autoclave	TOMY Digital Biology	SX-700	ESTERILIZADOR A VAPOR DE ALTA PRESSÃO Scanner
slides	HAMAMATSU	NanoZoomer 2.0-RS

de de Aplicadores de Algodão Estéril de