Artigo de método

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

DOI:

10.3791/53498

⸱

27 de março de 2016

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Oslo University Hospital, 2Norwegian Center for Stem Cell Research, Oslo University Hospital, 3Laboratory of Neural Development and Optical Recording (NDEVOR), Department of Physiology, Institute of Basic Medical Sciences, University of Oslo

Neste artigo

Resumo

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Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.

Resumo

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lesão da medula espinal (SCI) normalmente provoca déficits neurológicos devastadores, nomeadamente através danos às fibras que descem do cérebro para a medula espinhal. Uma grande área atual da pesquisa é focada sobre os mecanismos de plasticidade adaptativa que fundamentam a recuperação funcional espontânea ou induzida a seguir a SCI. recuperação funcional espontânea é relatado para ser maior no início da vida, levantando questões interessantes sobre como adaptativa alterações de plasticidade como a medula espinhal se desenvolve. Para facilitar a investigação dessa dinâmica, temos desenvolvido um modelo SCI no ratinho neonatal. O modelo tem relevância para SCI pediátrica, o que é muito pouco estudada. Porque plasticidade neural no adulto envolve alguns dos mesmos mecanismos como plasticidade neural no início da vida 1, este modelo pode, potencialmente, ter alguma relevância também para adultos SCI. Aqui nós descrevemos todo o procedimento para a geração de uma lesão reprodutível compressão da medula espinhal (SCC) no ratinho neonataltão cedo quanto pós-natal (P) dia 1. SCC é conseguido através da realização de uma laminectomia para um dado nível espinal (aqui descrita em níveis torácicos 9-11) e, em seguida, utilizando um mini-Yasargil aneurisma grampo modificado para comprimir e descomprimir rapidamente a medula espinhal . Como descrito anteriormente, os ratos neonatais ferido pode ser testado para os défices comportamentais ou sacrificados para análise ex vivo fisiológica de conectividade sináptica usando técnicas de gravação óptica electrofisiológicos e alto rendimento 1. Anteriores e em curso estudos com avaliação comportamental e fisiológica demonstraram uma dramática deterioração aguda da motilidade dos membros posteriores seguido por uma recuperação funcional completa dentro de 2 semanas, e a primeira evidência de mudanças no circuito funcional ao nível da identificadas descendente conexões sinápticas 1.

Introdução

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Durante a última década, evidências crescentes obtidas de diferentes modelos de lesão medular (LM) mostraram que as redes espinhais podem se reorganizar espontaneamente para contribuir para a recuperação funcional1-9. A plasticidade adaptativa tornou-se, como consequência, um tópico importante na pesquisa da SCI. Foi demonstrado que a plasticidade abrange o crescimento de axônios poupados, o surgimento de novos colaterais axônicos e a formação de novas conexões sinápticas. Muito desse conhecimento foi obtido a partir de estudos comportamentais ou anatômicos em animais adultos. Uma limitação importante dos estudos da medula espinhal em adultos é a dificuldade de realizar avaliação fisiológica de alto rendimento, o que é mais fácil em preparações neonatais1. Uma grande diferença é que as preparações ex vivo do tronco encefálico adulto e da medula espinhal têm baixa viabilidade. Outra é que o tecido espinhal adulto é mais opaco à luz porque é mais espesso e mielinizado. Embora os avanços recentes na imagem in vivo (ver, por exemplo, 10-12) possam superar parcialmente esses problemas, a possibilidade de realizar imagens de alto rendimento em qualquer profundidade dorsoventral desejada em vários locais ao longo de uma determinada preparação tronco encefálico-medula espinhal é atualmente viável apenas em neonatos. O estado imaturo de mielinização do axônio na medula espinhal neonatal facilita o registro óptico ex vivo de alto rendimento, permitindo assim uma avaliação dinâmica das conexões sinápticas funcionais13-17. Combinadas com repórteres de cálcio geneticamente codificados e ferramentas de estimulação optogenética e farmacologia, as abordagens ópticas podem contribuir para uma compreensão mais profunda dos mecanismos subjacentes à plasticidade adaptativa.

Estima-se que entre 1-10% de todas as lesões da medula espinhal afetem bebês e criançasde 18 a 22 anos. Em contraste com a LME em adultos, a patogênese e o potencial de recuperação espontânea na LME pediátrica são menos estudados. O uso de um modelo de LME neonatal pode, portanto, fornecer mais informações sobre a LME pediátrica e contribuir para uma melhor compreensão dos mecanismos patogenéticos e de recuperação envolvidos. Além disso, acredita-se que a plasticidade pós-LM que apoia a recuperação funcional na medula espinhal adulta envolva, pelo menos em parte, os mesmos mecanismos que governam o desenvolvimento do sistema nervoso central, como o crescimento do axônio, a ramificação e a formação de novas sinapses23-26. Assim, o uso de um modelo de LME neonatal pode fornecer informações importantes sobre os mecanismos que também operam na medula espinhal adulta ou que podem ser restabelecidos na medula espinhal adulta (por exemplo, por implantação de células ou tecidos fetais ou de tecido construído de novo a partir de células-tronco pluripotentes) para facilitar a recuperação.

O camundongo neonatal, portanto, fornece uma plataforma para uma abordagem integrativa e multimetodológica para investigar a plasticidade adaptativa após lesão medular, na qual uma combinação de métodos comportamentais, fisiológicos, anatômicos, moleculares e genéticos pode ser prontamente empregada. O estabelecimento de modelos padronizados de lesões neonatais é um passo importante na implementação de tais estudos.

Protocolo

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Este protocolo experimental foi aprovado pela Autoridade Nacional de Pesquisa Animal da Noruega (Forsøksdyrutvalget, número local experimental aprovação 12,4591) em conformidade com os regulamentos da União Europeia de cuidados de animais (Associação Ciência Animal Federação Laboratório Europeu). Foram feitos esforços para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento. Neste artigo, o procedimento utilizado em pós-natal (P) dia 1 de tipo selvagem ICR (imprinting Região de Controle) ratinhos (Jackson, EUA) é descrito mas a mesma abordagem pode também ser utilizado em fases posteriores.

1. Construção de um sistema de anestesia de gás para ratos Neonatal (Figura 1)

  1. Construir um nariz-máscara a partir da ponta de uma seringa. Conecte-o ao 3-way válvula com tubo de plástico (Figura 1 - tubo vermelho e Figura 2A1).
  2. Perfurar um pequeno furo no lado da máscara nariz e ligar esta para tubos de plástico para remover o excesso de gás a partir damáscara. Terminar a tubagem, quer a uma bomba de vácuo ajustado para uma pressão ligeiramente negativa, ou numa hotte (Figura 1 - tubo verde-claro).
  3. Realizar uma câmara de anestesia de um x 25 mm de plástico de Petri 150 mm (Figura 2A2).
    1. De um lado, fazer um buraco grande o suficiente para acomodar a cabeça do rato ea máscara nariz.
    2. No lado oposto, faça dois furos menores por meio do qual os tubos de plástico de e para a máscara do nariz podem ser inseridos (figura 1 - tubulação vermelho e verde brilhante, respectivamente).
    3. Adicione um terceiro orifício na parte superior da tampa e se ligar a este um terceiro tubo de plástico que termina na bomba de vácuo (Figura 1 - tubo verde-escuro). O objectivo deste terceiro tubo é para assegurar que qualquer excesso de gás, que não foi captada pela saída do nariz máscara é removida.
  4. Criar uma câmara de sono, fazendo um buraco no fundo de qualquer tipo de prato de laboratório que é suficientemente grande para Contain o rato e tem uma borda lisa e uniforme (na abertura do prato deve estar nivelada com a tabela para evitar fugas de gás). Ligue o orifício na câmara até a torneira de 3 vias com tubo de plástico (Figura 1 - tubo castanho). Coloque a câmara de dormir sob uma coifa.
  5. Conectar uma torneira de passagem de 3 vias para o tubo de saída do vaporizador (Figura 1 - tubo amarelo e Figura 2A3).
  6. Ligue a entrada do vaporizador para o fornecimento de oxigénio (Figura 1 - tubo azul).

2. A modificação de um Yasargil temporária Aneurysm Mini-clip para criar a ferramenta de compressão (Figura 2 e Tabela 1)

  1. Apor o clipe firmemente a um carrinho com uma braçadeira. Usando uma lupa binocular para controle visual, arquivo para baixo da superfície exterior da ponta de cada lâmina de clipe para uma espessura final de cerca de 150 um, utilizando uma pedra de afiar montado sobre uma broca (Figura 2B e C).
  2. Adicione uma rolha para o clipe por corte de um curto troço de tubo de polietileno capilar (Tabela 1) sob um estereomicroscópio usando um micro-faca (Tabela 1), e colocar este em uma das lâminas (Figura 2A4 e as Figuras 2B e C). Isso impede o fechamento completo do clipe e cria dimensões compressão padronizados. Quando o clipe estiver fechou a distância interblade é de cerca de 230 um. Fazer uma nova rolha para cada experiência como o material de polietileno pode comprimir durante a sua utilização, o que alteraria o espaço interblade.
    Nota: A tensão da mola de aperto diminui ao longo do tempo tais que, após cerca de 80 compressões o clipe não fecha totalmente a rolha e necessita de ser substituída.

3. Preparação antes da cirurgia

  1. Colocar o rato na câmara de sono (Figura 1) e iniciar a anestesia com isoflurano a 4% (Figura 2A5 ) Vaporizado em oxigénio puro, usando um vaporizador (Figura 2A3 e Tabela 1).
  2. Teste o reflexo de retirada do mouse por beliscar suavemente a web de pele entre os dedos dos pés com uma fina pinça de plástico. Faça isso com cuidado como ratos recém-nascidos são facilmente feridos. Beliscar resultados muito duras em hematomas imediata. Se efectuar este ensaio, no início da sedação desencadeia o reflexo e fornece uma boa indicação da quantidade de força necessária.
  3. Uma vez que o reflexo é abolido, remova o mouse da câmara de sono e colocá-lo em uma posição propensa na mesa de operação com o focinho inserido no nariz máscara que proporciona um fornecimento contínuo de 4% de isoflurano misturado com oxigênio puro (Figura 1). Certifique-se de que a almofada de aquecimento está ligado e definido para 37-38 ° C como hipotermia durante a cirurgia pode ser fatal.
  4. Para obter analgesia completa, injectar por via subcutânea de 50 uL de anestésico local bupivacaína (2,5 mg / ml, Figura 2A6) no local da cirurgia (nas experiências relatadas aqui, isto é ao nível torácico (T) 9-T11). Usar uma seringa de insulina (300 ul, 30 g, Figura 2A7 e Tabela 1) para executar a injecção.
  5. Reduzir a concentração de isoflurano entregue ao nariz máscara para 1-2%.

4. Dorsal Laminectomy

  1. Realizar a cirurgia sob controle microscópico.
  2. Depois de limpar a área de cirurgia com gluconato de clorexidina (Tabela 1 # 19) durante pelo menos 30 segundos, fazer um 1-2 mm incisão cutânea transversal em T9-T11 usando um microlanceta (Figura 2A8).
    Nota: Em ratinhos ICR neonatal a porção rostral do estômago, visível quando contém leite, está de frente para os níveis vertebrais T12-T13 (Figura 3). Outro marco é a parte rostral do agregado tecido adiposo subcutâneo torácica que termina em cerca de T8-9. Este marco é visível somente após incisão na pele.
  3. utilize uma pinça (Figura 2A9 e A10) para aumentar a abertura da pele numa direcção transversal para 8-9 mm, puxando a pele suavemente rostral e caudal (a pele rasga facilmente, criando uma ferida suave e linear). Isto proporciona acesso lateral suficiente para a coluna vertebral.
  4. Retrair as bordas da incisão da pele a partir de estruturas subjacentes através da inserção de peças estéreis de esponja de gelatina hemostática (Figura 2A11 e Tabela 1) por via subcutânea rostral e caudal para a incisão. Isto aumenta a abertura e impede a pele de retracção e obscurecendo a área durante a cirurgia. A esponja de gelatina hemostática não necessita de ser embebido em solução salina, antes da utilização.
  5. Para expor a coluna vertebral, dissecar os músculos paravertebrais, usando tesouras finas (Figura 2A12, e Tabela 1). Corte os anexos dos músculos para a coluna vertebral e expor a lâmina (Figura 4A). Nãoe também que, nesta fase do processo espinhal é subdesenvolvido.
  6. Identificar a linha média e cortar transversalmente entre as duas lâminas (que, nesta fase, é cartilaginoso) com tesouras finas (Figura 4B). Coloque cuidadosamente uma lâmina de uma fina fórceps entre a lâmina e a dura-máter (Figura 4C), segure a lâmina com a pinça e levante-o cuidadosamente até um pedaço quebra, deixando a dura-máter intacta (Figura 4D). Repita este procedimento 2-3 vezes para obter um longo laminectomia 1-2 segmento.
  7. Usando fórceps finos como fórceps, remover partes das articulações bilateralmente para ganhar espaço suficiente para colocar o clipe dentro do canal vertebral. Limpar a área cirúrgica e controlar o sangramento com pequenos pedaços de esponja de gelatina hemostática.

5. Spinal Cord Injury Compression

  1. Abra o aneurisma mini-clipe modificado no suporte do clipe (Figura 2A13 e Figura 2B) e local the lâminas em cada lado da medula espinal, nos espaços entre a faceta junções e o cabo. Certifique-se de que as lâminas são inseridas profundamente o suficiente para afectar a parte ventral da medula espinal. Se isso não for possível, remova mais das articulações.
  2. Solte o mini-clipe rapidamente, segurando-o no lugar com o suporte do grampo para evitar que ele caia. Manter a compressão por 15 s.
  3. Abra o mini-clip rápida e removê-lo. Para alcançar uma compressão simétrica, inverter a orientação do mini-grampo, e usando a marca facilmente visto feito pelo edema hemorrágica da primeira compressão como um guia, reposicionar o clipe na orientação inversa, para uma segunda compressão de 15 seg (prévia experiência mostrou que isso gera déficits histológicas e fisiológicas simétricas, enquanto as compressões individuais não 1). A dura-máter não devem ser danificados pela compressão.
  4. Limpar a área e manter a hemostasia com pedaços de esponja de gelatina hemostática.
  5. Remover os pedaços de esponja de gelatina hemostática que foram colocados sob as bordas da incisão da pele no início da cirurgia e fechar a incisão na pele com estéril 6,0 sutura e um suporte de agulha (Figura 2A14 e 15).
  6. Injectar por via subcutânea 0,75 mg / kg de peso corporal de Buprenorfina (Figura 2A16) diluída em PBS estéril usando uma seringa de insulina (300 ul, 30 g).

6. Cuidados no pós-operatório

  1. Remover o rato da máscara do nariz e colocá-lo em um conjunto de câmara com temperatura controlada a 30 ° C até que a anestesia desgasta fora eo mouse torna-se alerta (1-3 hr é tipicamente suficiente).
  2. Injectar Diazepam (Figura 2B17) intraperitonealmente para a matriz (8 g / kg de peso corporal). Isto cria um torpor que diminui o risco de canibalismo durante a primeira noite, quando este risco é mais elevado.
  3. Retornar o mouse operado para a maca.
  4. Se o lixo é large (> 12 filhotes), remova alguns dos filhotes não operados, preferencialmente os animais maiores se eles diferem em tamanho, para reduzir a competição para o leite. cuidados maternos dos filhotes operados há de melhor na linha de ICR se o tamanho da ninhada é de cerca de 9 filhotes.
  5. Para a gestão da dor, administrar buprenorfina (0,75 mg / kg de peso corporal) por via subcutânea uma vez por dia durante os primeiros dias após a cirurgia, utilizando uma seringa de insulina (300 ul, 30 g). Um volume apropriado para a injecção subcutânea é de 30-50 ul. Em vocalização ratos neonatal e agitação são bons indicadores de dor.
  6. Realizar um exame diário dos ratinhos lesionados usando uma folha de pontuação para avaliar a nutrição, o peso corporal, desidratação, dor, cicatrização de feridas, a retenção de urina e estado da infecção. De acordo com a pontuação obtida, fornecer cuidados especiais, tais como injeções de uma solução estéril pediátrica nutrição (Tabela 1 # 18) em caso de alimentação anormal. A folha de pontuação também0; define critérios endpoint humanas. Uma mãe que não rejeita os filhotes feridos é o melhor cuidador.
  7. No caso incomum de disfunção da bexiga, realizar massagem de bexiga duas vezes por dia até que a função é restaurada. Isso é feito colocando o rato em decúbito dorsal em uma mão e massagear o abdômen inferior delicadamente em um sentido rostro-caudal usando a ponta dos dedos.

Resultados

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Lesão compressão da medula espinhal e perda de função

Tal como descrito anteriormente, através da optimização dos processos de pré-operatório, cirurgia e pós-operatórias, um modelo reprodutível SCI compressão no rato neonatal pode ser obtido um. A rolha de polietileno colocado sobre uma lâmina do clipe (Figura 2B e C) impede o fecho completo do grampo e mantém a distância entre a lâmina de forma consistente a cerca de 230 um. Invertendo a orientação do clipe entre os dois resultados compressões em uma lesão simétrica, tal como avaliado por sequelas histológico (Figura 5A e 1). Imediatamente após a remoção mini-clip, o tecido da medula espinhal comprimido torna-se mais escura, devido à contusão hemorrágica e edema. Observação de cortes seriados da medula lesionada coradas para Eosina e Hematoxilina já um dia porlesão epois revela deterioração gradual do tecido quando se aproxima o epicentro da lesão (Figura 5A). A presença de cavidades intra-espinal ou sangue na lesão não é incomum.

Avaliação comportamental, por exemplo, rastreando trajectórias dos membros posteriores em condições de ausência de peso condições de rolamento de algumas horas após a cirurgia, mostra uma insuficiência dramáticos da motilidade dos membros posteriores em murganhos SCC lesionado em comparação com ratinhos de controlo placebo, em que apenas uma laminectomia é realizado (Figura 5B e 1) . Este teste pode ser repetido até que o rato é capaz de executar outros testes comportamentais de rolamento que exigem o seu próprio peso 1.

Mortalidade e de recuperação após a cirurgia

a mortalidade intra-operatória é principalmente devido à apnéia e parada cardíaca causada pela alta concentração de isoflurano necessária para alcançar anesthesi suficienteuma. Introduzindo o anestésico local para Bupivacaína o protocolo cirúrgico permite a redução da concentração de isoflurano e, assim, diminui significativamente a taxa de mortalidade. Em uma série experimental recente, incluindo mais de 20 animais, a mortalidade intra-operatória foi nula. Em contraste, a sobrevivência pós-operatório é influenciada principalmente pela aceitação dos ratos operados por sua mãe. Uma melhoria significativa ocorreu quando a ansiedade e a agressividade foi reduzida através da apresentação de uma única injecção de diazepam (ip 8 g / kg de peso corporal) para a mãe antes de devolver os ratos operados para o maca 1. A aceitação e a recuperação pós-operatório dos ratos operados podem ser monitorizadas pela presença do leite no estômago. O estômago de um rato P1-P7, que tem o leite de embriaguez é claramente branco e visível através da pele abdominal (Figura 3). Comparação de alimentação em funcionamento, controle de farsa e camundongos não operados é útil para avaliar o estado nutricional de ferird ratinhos. Avaliação do crescimento de operado face a ratinhos não operado mostra que, apesar de uma pequena perda de peso durante o primeiro dia pós-operatório, a curva de crescimento de ratos operados normaliza rapidamente depois disso (Figura 6). A mortalidade relacionada à disfunção da bexiga ou infecção não foi observada mesmo em camundongos estudados por até sete semanas.

Número na Fig. 2 Nome Fabricante / Fornecedor referência # Ligação Comente
1 seringa de plástico (30 ou 50 ml)
2 Placa de Petri de plástico (150 x 25 mm)
3 vaporizador de isoflurano Fortec Cyprane http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/ Usamos e dispositivo antigo fora de produção, consulte o link para o dispositivo mais recente
4a Yasargil aneurisma temporária mini-clipe Aesculap FE681K http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b Belas furo polietileno capilar tubos ID 0,58 mm, OD 0.96 mm Smiths Medical 800/100/200 http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5 O isoflurano (Forene) Abbott GmbH & Co. KG http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6 Marcain (bupivacaína) AstraZeneca http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7 Insuline seringa de 0,3 ml de 30 G x 8 milímetros VWR 80086-442 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8 Belas Micro faca de ponta Ultra 5 milímetros Ferramentas Ciência Belas 10315-12 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0019900000 & reloadmenu = 1
9 Extras pinça fina Graefe - 0,5 milímetros Tip Ferramentas Ciência Belas 1153-1110 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0055700000 & reloadmenu = 1 		Não é realmente necessário, muitas vezes, os dentes são muito grandes
10 Fórceps SuperGrip Hetero Ferramentas Ciência Belas 00632-11 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0053500000 & reloadmenu = 1 		Duas pinças são necessárias
11 Spongostan especial de 70 x 50 x 1mm Ferrosan
12 Vannas Primavera Scissors - 2 lâminas mm Hetero Ferramentas Ciência Belas 15000-03 http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp=
Kat & suchkatalog = 0012800000 & reloadmenu = 1
13 Vario clipe Aplicando Fórceps Aesculap FE502T http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14 Vicryl 6-; 0 (Ethicon) Johnson e Johnson J105G
15 suporte de agulha micro Diethrich 11-510-20 http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16 Temgesic (buprenorfina) Schering-Plough
17 Stesolid (diazepam) Actavis Também conhecido como Valium
18 Pedamix Fresenius Kabi http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ern%C3%A6ring/parenteral-ern%C3%A6ring
19 Klorhexidinsprit (gluconato de clorexidina) Fresenius Kabi D08A C02 http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

Tabela 1. Lista de ferramentas e equipamentos para a geração de uma lesão compressão da medula espinhal impulsionado-clip em um rato neonatal.

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Figura 1. Esquema de configuração anestesia. Este esquema apresenta a configuração anestesia projetado para o rato neonatal, com uma câmara de sono para anestesia inicial e um dispositivo de máscara nariz para anestesia continuado durante a cirurgia.

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Figura 2. ferramentas principais e clipe de compressão. (A) As ferramentas usadas durante o procedimento. Os números correspondem à anotação utilizado na Tabela 1. (B e C) Um aneurisma temporária mini-Yasargil grampo com a ponta de cada lâmina cortada manualmente para baixo para cerca de 150 um de espessura. Uma rolha feita de um pedaço de tubo de polietileno (Tabela 1) é colocada sobre uma das lâminas para evitar o encerramento completo do grampo. Barra de escala: 2 mm. App: aplicador de clipe (# 12 em A); St:. Stopper Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3. Landmark para a avaliação pré-operatória de nível espinhal em camundongos ICR neonatal. (A) Vista lateral de um rato P1 ICR com leite branco nos s tomach. A parte rostral do estômago corresponde ao nível da coluna vertebral T12-T13. (B) de rato P1 ICR sob anestesia em uma posição propensa. Apesar de ser mais difícil de visualizar que em (A), o estômago cheio de leite é reconhecível. A parte rostral do estômago indica o nível da coluna vertebral T12-T13. Barras de escala: 0,5 cm.

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Figura 4. Dorsal laminectomia. (A) Dissecção da musculatura paravertebral. Note-se que nesta idade o processo espinhal é subdesenvolvido. (B) de corte transversal da lâmina com uma tesoura fina. (C) A introdução de uma lâmina de uma pinça fina entre a lâmina e a dura-máter. O ponto de entrada é mostrado pela seta. (D) A remoção da lâmina. Barra de escala: 2 mm.

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Figura 5. histológica e os resultados comportamentais após a lesão compressão da medula espinhal em P1. (A) eosina e hematoxilina em secções da espinal medula de um rato ferido (1 dia após a lesão) em diferentes distâncias do epicentro lesão. (B) os traços representativos de membros anteriores e dos membros posteriores trajetórias observada 6 horas após a lesão ou após uma laminectomia controlo simulado. Traços na parte superior representam trajetórias vistos de uma vista lateral do animal. Traços na parte inferior representam trajetórias vistos do aspecto ventral do animal. Ver também uma. Barra de escala: 250? m. DH: corno dorsal; G, para a esquerda; R: right; SCC: compressão da medula espinhal; VH:. Corno anterior Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. curvas de crescimento comparativos. Histograma mostrando o ganho de peso de ratos feridos não-operado e SCC do dia pós-natal 1 ao dia pós-parto 9.

Discussão

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Neste artigo são descritos os procedimentos para uma lesão SCC gerado-clip em ratos P1. Os mesmos procedimentos, também pode ser realizada em fases posteriores. Lesões de compressão foram realizados com êxito em P5, P7, P9 e P12 (Züchner, et ai., Manuscrito em preparação). Em todas as fases pós-natal, a anestesia geral é obtida com isoflurano vaporizado com oxigênio puro, mas o resultado anestésico depende muito da idade. Em tentativas iniciais de P1-P4, antes da anestesia local, foi introduzido no protocolo, foi difícil obter uma sedação profunda e prolongada devido a uma janela estreita de dose-efeito entre a sedação e sobredosagem insuficiente. Além disso, as preocupações relacionadas com um efeito neurotóxico de isoflurano em animais recém-nascidos foram levantadas 27-30. Uma combinação de isoflurano e os resultados anestésico bupivacaína locais em uma anestesia mais profunda e mais estável para permitir uma redução da dose de isoflurano por um factor de 2-3. Diferentes tipos de anestesiaSIA foram descritas para roedores neonatais, incluindo Crioanestesia 31,32, mas um inconveniente potencial de Crioanestesia é o seu efeito neuroprotector (revisto por 33,34), o que pode complicar a geração de uma lesão reprodutível e eficiente. Anestesia-barbitúrico com base é considerada para ter uma eficiência mais baixa, em ratos neonatais devido aos níveis mais baixos de albumina do soro e de gordura corporal do que em adultos 35,36.

Embora bastante invasiva e traumática, uma vez que o procedimento é estabelecido a taxa de mortalidade durante a cirurgia é baixa. No entanto, há passos críticos durante o procedimento que requerem uma atenção especial para melhorar a recuperação e sobrevivência dos ratinhos operados. Uma questão importante é selecionar filhotes que terão a melhor chance de sobreviver à cirurgia. Quando o lixo é grande o estado nutricional dos filhotes individuais varia. Além do sangramento inevitável que ocorre durante a cirurgia, os filhotes operados passar horas longe da mãe, e muitas vezes eles não bebem leite antes da manhã seguinte. É assim uma vantagem para seleccionar crias que já possuem uma certa quantidade de leite no estômago. Isto é facilmente visível através da pele abdominal de P0 a P7.

Durante a primeira noite o filhote operado está em grande risco de ser canibalizados pela mãe. Durante o desenvolvimento inicial do presente modelo de mais de metade dos ratos operados estavam em falta na manhã seguinte, com sinais claros de sangue na gaiola. Necrophagy, canibalismo e infanticídio em roedores têm sido estudados há décadas 37-40. Neste estudo, o canibalismo só foi testemunhado uma vez, mas foi considerado uma explicação mais provável do que necrofagia porque os filhotes que foram devolvidos para a jaula eram tipicamente em tão boa forma que a morte por causas naturais durante a noite parecia improvável. Isto levou a idéia de usar um agente farmacológico reversível tais como Diazepam para reduzir a ansiedade e agressividade in a mãe (revisado por 41). A injecção intraperitoneal de Diazepam melhorou muito a situação, soltando a mortalidade durante a primeira noite de mais de 60% para menos de 20%.

Reduzir o tamanho da leitegada através do abate e perturbando o lixo tão pouco quanto possível após o retorno pós-operatório são elementos adicionais que podem beneficiar os animais operados. No entanto, deixando filhotes única operados com a mãe não é benéfico. O melhor equilíbrio entre operados / filhotes não operados podem variar de acordo com a linha, mas para ICR e SCID-ICR ratos que saem 4-5 filhotes operados (lesão ou simulada) em conjunto com 3-4 filhotes não operados deu os melhores resultados.

De um modo geral, a principal limitação deste modelo SCI neonatal é que a medula espinhal neonatal difere em muitos aspectos da medula espinal adulta, e, assim, pode não fornecer resultados experimentais, que são comparáveis ​​aos obtidos a partir de modelos SCI adultos. Essas diferenças incluem o tamanho total evolume da medula espinal, o número de células, a sub-representação de tipos de células específicos, tais como oligodendrócitos, respostas imunes imaturos e circuitos neuronais imaturas. As conclusões extraídas dos experimentos neste modelo deve, portanto, ser considerado com cuidado. Por outro lado, o modelo é relevante para o cenário relativamente menos investigados de SCI pediátrica. Além disso, a fraqueza aparente no que diz respeito aos modelos SCI adultos também uma força potencial, uma vez que pode permitir que a elucidação dos mecanismos de plasticidade que, embora minimamente existentes na medula espinal adulta, podem representar um substrato terapêutico se restabelecido. É concebível que a reintegração de condições neonatais ou mesmo embrionárias poderia ser implementado através da implantação de células ou tecidos menos desenvolvidos ou por tratamento com reagentes que geram o tecido adulto com características de desenvolvimento anteriores. Usando enzimas para eliminar redes perineurais é um exemplo da última abordagem 42,43.

Uma questão importante ao estabelecer um modelo animal para SCI é a obtenção de uma lesão padronizada. Este é um aspecto importante que tem sido abordada em vários modelos SCI, por exemplo, o corte transversal, hemissecção, pêndulos, compressão por balão, esmagamento fórceps, compressão de peso estático, etc. Com relação ao impacto dispositivos, os esforços neste sentido resultaram em modelos SCI em roedores adultos, onde vários parâmetros de impacto, como velocidade, força e duração podem ser manipuladas (revisto em 44). Outra abordagem, envolvendo menos equipamento, emprega uma modificação do grampo de aneurisma Kerr-Lougheed 45,46. Estes 2 abordagens são complementares como o pêndulo imita uma lesão contusão enquanto os imita clipe de uma lesão de compressão com algum grau de isquemia concorrente. Devido às restrições de tamanho substancial e uma maior vulnerabilidade dos ratinhos neonatais, a maior mortalidade associada com cirurgias maiores, bem como os custos de desenvolver equipamento escala menor, que foi escolhida para desenvolver uma compressão gerada pelo clipe em vez de uma abordagem contusão gerado pelo pêndulo. Isto foi realizado por adaptação de um aneurisma mini-grampo disponíveis comercialmente para acomodar o tamanho da coluna vertebral de ratos neonatais 1. Adicionando uma rolha garante uma largura de compressão padronizada, e desde que a tensão do clipe comprime ao limite da rolha, a força de compressão durante a fase estática a largura mínima deve variar pouco. O que não é normalizada é a velocidade da compressão, durante a sua fase dinâmica, uma vez que este variará em função da evolução da tensão de grampo sobre a sua vida útil. À medida que a fase estática da compressão dura muito mais tempo do que a fase dinâmica, e há pouco para sugerir que o tecido da medula espinhal exerce tanto de uma força contrária contra as lâminas mini-grampo, é provável que a gravidade da lesão é mais dependente a fase estática. Isto, no entanto, continua a ser testado. Prejuízoseveridade é provável que dependem de múltiplos factores, incluindo a força de compressão estática e a duração, a velocidade de compressão e descompressão, a posição do mini-grampo, e o número de compressões executadas no mesmo local. Assim, a variação combinatória nestes parâmetros poderia resultar na geração de um espectro de severidade de lesões de fraca a grave. Apesar do potencial de variabilidade, em nosso estudo publicado anteriormente 1 obtivemos resultados consistentes no histológica, níveis fisiológicos e comportamentais, por isso há pouco para sugerir que a normalização aceitável é difícil de alcançar. Notamos que, nesse estudo, utilizamos vários métodos de validação em cada nível, incluindo os testes comportamentais, tais como ar-stepping como mostrado na Figura 5.

Neste modelo SCI neonatal a lesão poupa uma certa proporção de axônios e, assim, proporciona uma situação favorável para induzir plasticidade adaptativa por meio da re-modeling de conexões poupado e a formação de novos circuitos. Além disso, desde o rato neonatal é bem adequado para investigação por muitos métodos experimentais, é possível usar este modelo para estudar a recuperação funcional e plasticidade adaptativa com uma abordagem integrativa, incluindo testes comportamentais, traçado axonal retrógrado e anterógrado, imuno-histoquímica, eletrofisiologia e alta de gravação óptica -throughput 1. Como exemplo, aproveitamos esta abordagem integrativa para demonstrar re-modelagem de rede ao nível das entradas descendentes específicos usando imagem de cálcio de alto rendimento em ex vivo preparações wholemount do tronco cerebral e medula espinhal feridos 1. Isso pode ser empurrado ainda mais usando ferramentas de neuro-optogenética e farmacologia optogenética para avaliar a remodelação de conexões sinápticas entre as populações específicas de neurônios espinhais.

Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por doações da Autoridade Regional de Saúde do Sudeste da Noruega (JLB, 2014119; JCG, número 2015045 e 2012065), pelo Conselho Norueguês de Pesquisa (JCG, número do projeto 23 00 00) e pela Universidade de Oslo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de plástico (30 ou 50  ml)
Placa de Petri de plástico (150 x 25  mm)
Vaporizador de isoflurano FortecCypraneUsamos um dispositivo antigo fora de produção, verifique o link para o dispositivo mais recente
Yasargil mini-clipe de aneurisma temporárioÆ Tubo deFE681K
ID 0.58  mm, OD 0.96  mmSmiths Medical800/100/200
Isoflurano (Foreno)Abbott GmbH & Co. KG
Marcain (Bupivacain)AstraZeneca Seringa
insulina 0,3  ml 30  G x 8  mmVWR80086-442
Faca Micro Ultra Fina 5  mm de pontaFerramentas de Ciência Fina10315-12
Pinça Graefe Extra Fina – 0.5  mm TipFine Science Tools1153-10Não é realmente necessário, muitas vezes os dentes são muito grandes
Fórceps SuperGrip StraightFine Science Tools00632-11São necessárias duas pinças
Spongostan Special 70 x 50 x 1  mmTesouras de Mola Ferrosan
Vannas - 2  mm Lâminas Retasde Ciência Fina15000-03
Vario Clip Aplicando FórcepsAesculapFE502T
Vicryl 6– 0 (Ethicon)Johnson and JohnsonJ105G
Diethrich micro porta-agulha11-510-20
Temgesic (buprenorfina)Schering-Plough
Stesolid (diazepam)ActavisTambém conhecido como Valium
PedamixFresenius Kabi
Klorhexidinsprit (gluconato de clorexidina)Fresenius KabiD08A C02
Polietileno de Furo Fino sculap de Ferramentas

Referências

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