Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

Resumo

Aqui, apresentamos o protocolo de neovascularização coroidal induzida por laser de camundongo (CNV), um modelo experimental que recria as características vasculares da degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Uma vez dominado, ele pode induzir a CNV de forma confiável e eficaz como um sistema modelo para testar várias medidas experimentais.

Resumo

O modelo de neovascularização coroidal induzida por laser (CNV) de camundongo tem sido um modelo fundamental crucial para a pesquisa de degeneração macular relacionada à idade neovascular (DMRI). Ao administrar lesão a laser direcionada ao EPR e à membrana de Bruch, o procedimento induz a angiogênese, modelando a patologia característica observada na DMRI neovascular.

Desenvolvido pela primeira vez em primatas não humanos, o modelo CNV induzido por laser veio a ser implementado em muitas outras espécies, sendo a mais recente delas o camundongo. Os experimentos com camundongos são vantajosamente mais econômicos, os experimentos podem ser executados em uma linha do tempo muito mais rápida e permitem o uso de vários modelos transgênicos. O tamanho em miniatura do olho do rato, no entanto, representa um desafio particular ao realizar o procedimento. A manipulação do olho para visualizar a retina requer a prática de habilidades de destreza fina, bem como a coordenação simultânea mão-olho-pé para operar o laser. No entanto, uma vez dominado, o modelo pode ser aplicado para estudar muitos aspectos da DMRI neovascular, como mecanismos moleculares, efeito de manipulações genéticas e efeitos do tratamento medicamentoso.

O modelo CNV induzido por laser, embora útil, não é um modelo perfeito da doença. O olho do camundongo do tipo selvagem é saudável, e o ambiente corio-retiniano não imita as alterações patológicas na DMRI humana. Além disso, a angiogênese induzida por lesão não reflete as mesmas vias que a angiogênese que ocorre em um estado de doença crônica e relacionada à idade como na DMRI.

Apesar de suas deficiências, o modelo CNV induzido por laser é um dos melhores métodos atualmente disponíveis para estudar a patologia debilitante da DMRI neovascular. Sua implementação levou a uma compreensão mais profunda da patogênese da DMRI, além de contribuir para o desenvolvimento de muitas das terapias de DMRI atualmente disponíveis.

Introdução

Degeneração macular (AMD) relacionada com a idade é uma das principais causas de cegueira em indivíduos com idade superior a 50 ^3/1. AMD podem ser classificados em duas formas: atrófica ("secar") e AMD neovascular ("wet") AMD. O primeiro é caracterizada por atrofia geográfica do epitélio pigmentado da retina (RPE), coriocapilar, e fotorreceptores, enquanto o último é caracterizada pela invasão de vasos sanguíneos anormais a partir do coróide para as camadas externas retinianas provocando fugas, hemorragia, e fibrose, e, finalmente levando a cegueira ^1,2. Das duas formas, DMRI neovascular representa a maioria da perda de visão ^1. Felizmente, essa forma tem inúmeras opções eficazes de gestão farmacológicas, ao passo que o seu homólogo atrófica não tem comprovada tratamentos médicos ^3. Além disso, porque a forma neovascular foi facilmente re-capituló num modelo animal, que tem sido mais amplamente acessível a um básicaPesquisa MD explorar os mecanismos patológicos subjacentes, a fim de desenvolver novas terapias ^4.

O primeiro modelo animal experimental de neovascularização coroidal (CNV) foi desenvolvido por Ryan et al. em primatas não humanos ^5. Esta ruptura induzida modelo de membrana de Bruch através fotocoagulação por laser, o que provocou uma resposta inflamatória local na angiogénese resultante semelhante ao observado em DMRI neovascular. A progressão histopatológico de angiogênese indução de pós-laser foi encontrado para imitar neovascular AMD, que confirmou a validade do modelo ^6. Os primatas não humanos oferecem a anatomia mais semelhantes aos seres humanos, mas, infelizmente, são caros de manter, não pode ser facilmente manipulado geneticamente, e tem um curso lento tempo de progressão da doença ^7. Em contraste, os modelos de roedores são muito mais para manter a relação custo-eficácia, pode ser geneticamente manipulados com relativa facilidade, e têm um muito mais rápido course de progressão da doença (experiências pode ser conduzida numa escala de tempo de semanas contra meses). Estas experiências só devem ser realizados em roedores pigmentadas, uma vez que é muito difícil de visualizar em animais albinos.

O modelo CNV induzido por laser do mouse, primeiro desenvolvido pelo grupo Campochiaro no final dos anos 90, ^10, tem crescido a ser o modelo animal dominante na maioria dos estudos recentes ^11-16. Devido à patogénese complexo e ainda não está claro da CNV, o modelo de laser foi aplicado em todos os aspectos da investigação AMD molhado variando de estudar os mecanismos moleculares que conduzem a angiogénese para avaliar novas modalidades de tratamento para futuro uso humano. Por exemplo, Sakurai et al. e Espinosa-Heidmann et ai. utilizado o modelo de laser para investigar o efeito de macrófagos no desenvolvimento de CNV utilizando ratinhos transgénicos e tratamentos farmacológicos exaustão ^{15, 16.} Giani et ai. e Hoerster et ai. usado óptico de tomografia de coerência (OCT) para a imagem da CNV em um esforço para caracterizar a progressão da CNV e comparar os achados histopatológicos com os resultados vistos em outubro imagem ^12,17 induzida por laser. Finalmente, estudos envolvendo injeção intravítrea de agentes anti-angiogênicos têm sido usados ​​como pré-requisitos para testes em humanos e foram vitais no desenvolvimento da primeira geração de agentes anti-VEGF utilizados na gestão de DMRI neovascular hoje ^10,18,19.

Modelos alternativos para CNV experimental utilizam métodos cirúrgicos para induzir a CNV. Este procedimento envolve a injecção de substâncias pró-angiogénicas (por exemplo, vectores virais recombinantes que sobre-expressam o VEGF, a injecção sub-retiniana de células EPR e / ou pérolas de poliestireno) para simular o aumento da expressão de VEGF na DMRI neovascular visto, com o objectivo de causar a angiogénese ^8,20. No entanto, este método produz uma incidência drasticamente menor de neovascularização; estes estudos mostraram que na CNVC57 / BL6 ratos ocorre em 31% de injecções de 70% contra a taxa de sucesso ~ visto no método de fotocoagulação com laser na mesma estirpe de ratinhos ^8,14. Por estas razões, e tendo em conta as vantagens do uso de roedores contra primatas não-humanos, o modelo de ratinho de CNV induzido por laser tornou-se o modelo animal padrão de CNV para a maioria experiências de estudo AMD neovascular ^8.

O olho do rato é um tecido minúsculo, delicado para trabalhar. Manobras do olho de visualizar a retina é difícil e requer muito prática até que seja alcançado o domínio. Esta tarefa é complicada pelo facto de que deve ser aprendido com a mão dominante e não-dominante. Além disso, após os movimentos finos necessários para visualizar a retina foram aprendidas, a coordenação entre ambas as mãos ea pedal operar o laser são importantes. Neste trabalho, buscou-se destilar os desafios de aprender todas as manipulações físicas envolvidas no CNV proc induzida por laseredure em um guia que iria ajudar as operadoras a alcançar o sucesso rápido com este modelo.

Protocolo

Todos os animais são tratados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 2013 Edition, da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Oftalmologia e Vision Research, e conforme aprovado pelo animal Institucional Cuidado e Utilização Comité para a Universidade de Northwestern.

Nota: O procedimento que se segue pode ser feito inteiramente com um operador; No entanto, é muito mais eficientemente conduzida com dois operadores com as tarefas dividido em conformidade.

1. Prepare a Estação do laser do laser e pré-

1. Posicione o laser e lâmpada de fenda, onde ele pode ser facilmente acessível. Ligue a laser e definir os parâmetros pré-determinados (por exemplo, 75 mm de tamanho local, poder mW 100, 100 duração ms).
   CUIDADO: Certifique-se de operador usa todos os equipamentos de protecção individual dos animais e segurança laser e laser de segurança pertinentes sinais são exibidos fora da sala de procedimento.
   1. Antes de usar qualquer animais experimentais, encontrar parâmetros ideais usando uma calibração, rato não-experimental. Os parâmetros do laser irá depender do laser utilizado. Parâmetros ideais são definidos pela configuração de energia menor do laser que constantemente provoca a formação de "bolha" quando focada corretamente. Ver vídeo, por exemplo de lesão com adequada "bolha" de formação.
2. Prepare a estação de pré-laser de modo que a anestesia, animal mais quente, lenços de tecido, e todos os colírios (tropicamida, Tetracaína, e lágrimas artificiais) são facilmente ao nosso alcance para o operador.
   1. Assegure-se que animais mais quente é pré-aquecida para corrigir a temperatura (37 ° C) antes de injectar o anestésico em primeiro ratinho, a fim de evitar a hipotermia induzida pela anestesia.
3. Coloque fase do mouse sobre mais quente para que ele possa reter o calor e permanecer quente uma vez procedimento a laser começa.

2. Rato Anestesia e Preparação Pré-a laser

1. Antes de injectaring anestesia, inspecionar o olho macroscopicamente para garantir que ele não tem deformidades ou anormalidades que diminuem a clareza da córnea (por exemplo, catarata).
2. Pesar mouse.
3. Peso Record, sexo e número de identificação animal.
4. Usando peso, calcular o montante adequado de anestesia a ser usado com base nas orientações dadas pela instituição (por exemplo, 100 mg / kg de cloridrato de cetamina, 10 mg / kg de xilazina OU tribromoetanol 250 mg / kg; para a 20 g rato injectar 0,20 ml de xilazina / cetamina cocktail OU 0,25 ml de tribromoetanol). Tem uma tabela de dosagens pré-calculada por peso em incrementos de 1 g, a fim de reduzir os erros matemáticos.
5. Scruff do mouse e injetar anestésico por via intraperitoneal com base em cálculos na etapa 2.4.
6. Coloque o mouse sobre os animais mais quente e esperar até que o mouse é completamente anestesiados, verificando o reflexo pedal via pitada dedo do pé (cerca de 3-5 min).
7. Arregaçar um lenço de papel e proteger a área nasal do mouse para evitar aspiration de líquido roll-off. Rato do rolo no seu lado e colocar uma gota (aproximadamente 30 ul) de cloridrato de tetracaína em cada olho para a anestesia tópica. Aguarde 2 min para solução tenha efeito.
8. Repita o passo 2.7 com uma gota de Tropicamida tópico para dilatação pupilar. Como alternativa, use o cloridrato de fenilefrina (2,5%) para a dilatação.
9. Aguarde 2 min de soluções para surtir efeito; manter animais em mais quente durante este tempo.
10. Após o tempo adequado tenha decorrido, rapidamente colocar o mouse sobre o palco do mouse e coloque o estágio no queixo resto da lâmpada de fenda.
11. Ligue lâmpada de fenda para o menor brilho luz e verificar o grau de dilatação pupilar. Se pupila dilatada não é adequadamente (aproximadamente 2,5-3 mm), retorne mouse para animais mais quente e esperar. Como alternativa, administrar uma gota de Tropicamida. Uma vez que olho é suficientemente dilatado, avance para o procedimento a laser.

3. Laser Procedimento

Nota: Certifique-se de outra ps pessoas na sala de usar óculos de proteção quando está longe de lâmpada de fenda olho peça protegida por laser

1. Ajustar o posicionamento do mouse sobre o estágio do mouse, de modo que ele está na posição ideal para a visualização de nervo óptico (ver 3.1.2).
   1. Orientar o mouse ao seu titular para que ele fique na horizontal, perpendicular à fenda feixe de luz, com a cabeça de um lado e cauda na outra. Posicionamento ideal do rato fará a visualização do nervo óptico muito mais fácil uma vez tampa de deslizamento é aplicada.
   2. Ligeiramente vire o mouse por isso é em um ângulo de 170 ° ~ com a cabeça mais perto do operador de laser.
   3. Certifique-se de que o mouse é o mais próximo possível para lâmpada de fenda, mas ainda em uma posição onde ele é estável e onde a mão do operador terá espaço suficiente para manipulação fina.
2. Após o ratinho está idealmente posicionado, colocar uma gota da solução de lágrima artificial em 25 mm x 25 mm lamela de vidro.
   1. Coloque uma gota de solução de lágrima artificial em opp de ratoolho osite - este olho irá garantir é hidratada e ajuda a formação de atraso de catarata.
3. Segure esquina da lamela entre o polegar eo ponteiro dedos; posição, de modo que o vidro é apertado entre as pontas de dois dedos.
4. Suavemente embrulhar os restantes três dedos ao redor do corpo do animal para o apoio ea estabilização mão. Posição da mão de modo que a lamela de vidro pode ser facilmente colocado no olho do mouse.
   1. Certifique-se de que o pulso está estabilizada em uma superfície firme, a fim de reduzir o tremor da mão.
5. Uma vez que posição estável é obtido, pressione cuidadosamente lamela de vidro (com gota de lágrima artificial ainda aderido) sobre o olho do mouse.
   1. Certifique-se a lamela estiver posicionado o mais perpendicular possível para o feixe de laser, a fim de evitar a dispersão do feixe de laser ou reflexão. A lamela age como uma lente de contacto para aplanar a córnea.
6. Olhe através de lâmpada de fenda e com a mão livre de alternância concentrar untIL retina pode ser visualizado. A retina vai ter uma cor amarelo claro / vermelho, dependendo da localização visualizado, vasos distintos, vermelho será visível.
7. Devagar e com cuidado manipular cabeça de rato e / ou lamela até visualizar o nervo óptico. O nervo óptico será de cor amarela com múltiplos vasos que irradiam a partir dele.
8. Uma vez operador confirmou visualização do nervo óptico, ligue a laser com foco feixe.
9. Uma vez feixe de laser ter sido ligado, manobrar a laser de focagem do feixe para a posição desejada (aproximadamente 1 diâmetro do disco do nervo óptico).
10. Concentre-se feixe de laser sobre o RPE do fundo de olho. A focagem adequada é por ter conseguido o feixe de laser mais nítida e clara. Se visando feixe olha oval ou fora de foco, alternar o foco lâmpada de fenda ou re-posição lamela de vidro.
11. Uma vez que o feixe de mira está focada em RPE, iniciar administração laser utilizando gatilho pé do laser.
    1. Certifique-se de evitar vasos da retina para evitar que ele intraocularmorrhage.
12. Prestar atenção para o aparecimento de uma bolha imediatamente após a administração do laser. O esboço do tiro de laser deve ser clara e não nebulosa de qualquer forma.
    1. Se o tiro de laser não resulta na formação de bolhas, ou área de impacto parece nebuloso (aparência turva com borda circular mal definido vs. fronteira clara, bem definida de um impacto positivo), ou se a hemorragia é visto após a administração de laser, não incluir essas lesões para análise futura.
13. Repita os passos de 3,10-3,12 para todas as posições desejadas CNV (geralmente aos 3, 6, 9 e 12 posições ao redor do nervo óptico). Se induções a laser são aplicados em aproximadamente mesma distância do nervo óptico, refocus não deve ser necessário. No entanto, devido à forte curvatura do olho do rato e pequenas variações que podem existir na retina, a recentragem do feixe pode ser necessário entre administrações consecutivas de laser.
14. Registro em um notebook a localização e resultado de eadministração tiro a laser e ach resultado (sucesso, obscuro, hemorragia, etc.) de cada tiro administrados para o olho. Certifique-se de colocar o laser no modo stand-by quando não estiver em uso.
15. 3,1-3,14 Repetir para o outro olho do rato, se necessário, usando a outra mão para a estabilização e uma nova lamela.
16. Depois de todos os disparos de laser desejados são administrados, desligue a laser e lâmpada de fenda.
17. Descarte lamela e lugar do mouse sobre mais quente para a recuperação da anestesia. Macroscopicamente inspecionar olho por qualquer prejuízo e coloque uma gota de solução de lágrima artificial para manter o olho hidratado e potencialmente prevenir o desenvolvimento de catarata futuro. Uma vez que o mouse se recupera da anestesia, voltar a gaiola.

	AVERTIN	AVERTIN	AVERTIN	XYL / KET	XYL / KET
Peso do rato (g)	Dose (mg / kg)	Concentração da Solução (mg / ml)	Anestésico Dose (ml)	Dose (mg / kg)	Anestésico Dose (ml)
15	250	20	0,1875	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,15
16	250	20	0,2	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,16
17	250	20	0,2125	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,17
18	250	20	0,225	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,18
19	250	20	0,2375	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,19
20	250	20	0,25	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,2
21	250	20	0,2625	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,21
22	250	20	0,275	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,22
23	250	20	0,2875	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,23
24	250	20	0,3	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,24
25	250	20	0,3125	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,25
26	250	20	0,325	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,26
27	250	20	0,3375	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,27
28	250	20	0,35	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,28
29	250	20	0,3625	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,29
30	250	20	0,375	100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina	0,3

Tabela 1: Dose XyIKet Chart.

Resultados

Quantificação de lesões de NVC pode ser realizado através da análise da coróide planas montadas usando coloração por imunofluorescência para rotular os vasos NVC. Os dois métodos mais utilizados de preparação do tecido são rotulagem FITC-dextrano, feito através de perfusão imediatamente antes do sacrifício animal, ou post-mortem imuno-coloração com um marcador de células endoteliais. Ambos os métodos foram descritos anteriormente em detalhe ^13,14,21; figuras 1 e 2 mostram exe...

Discussão

Existem vários fatores que podem afetar a entrega do laser e do desenvolvimento resultante da lesão CNV após laser de indução bem-sucedida. Estes factores devem ser controlados e padronizados para a fim de ter os resultados mais fiáveis. O mais pertinente desses fatores são a seleção do mouse (genótipo, idade e sexo), a seleção anestésico, e as configurações de laser.

O modelo de mouse específico usado pode ter um efeito significativo sobre o curso do desenvolvimento CNV. O genótipo mais uti...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Laser oftálmico de argônio de 532 nm (verde)	IRIDEX	GLx	qualquer laser de argônio oftálmico de 532 nm (verde) pode ser usado
lâmpada de fenda	Carl Zeiss	30SL-M	qualquer lâmpada de fenda pode ser usada desde que seja compatível com o laser
tribromoetanol	Sigma	T48402-25G	usado para fazer
álcool terc-amílico	Sigma	152463-1L	usado para fazer anestésico
frascos de vidro âmbar + septos	Wheaton	WH-223696	de armazenamento de tribromoetanol
	VWR	82003-820	diversos
1% Tropicamida	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	dilatação pupilar
0,5% Cloridrato de tetracaína	Alcon	0065-0741-12	de anestesia tópica
	Alcon	58768-788-25	de hidratação
(para aquecimento animal)	Kent Scientific	HTP-1500	usado para manter a almofada de aquecimento de temperatura corporal do animal
	Kent Scientific	TPZ-0510EA	mantém a temperatura corporal do animal
30 G agulhas de insulina	Balança de	injeção de anestesia BD 328418 IP
	Balança de pesagem de	AWS-1KG-BLK
lamínula (25 mm x 25 mm)	VWR	48366089	achatar a córnea para visualizar
xilazina	obtida da instituição	obtida da instituição	anestesia
cetamina	obtida da instituição	obtida da instituição
anestesia Volocity	PerkinElmer		utilizada para reconstrução volumétrica
ImageJ	National Institutes of Health		usado para análise de imagem