Este artigo descreve os métodos para o rastreio dos genes que controlam a permeabilidade plasmodesmal e inclinação, portanto, auxina durante a resposta trópico. Isto inclui a medição do grau de resposta trópico no hipocótilo da Arabidopsis thaliana e verificar a permeabilidade plasmodesmal pelo ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico carregamento (HPTS) e avaliação do nível de finalmente calejado.
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Artigo de método
Uma estratégia para validar o papel da mediada por calejado Plasmodesmal Gating na Tropic Response
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A auxina hormona vegetal desempenha um papel importante em muitos processos de crescimento e desenvolvimento, incluindo respostas trópico à luz e gravidade. O estabelecimento de um gradiente de auxina é um evento chave levando a phototropism e gravitropismo. Anteriormente, foi demonstrado polar do transporte de auxina (PAT) para estabelecer um gradiente de auxina em diferentes domínios celulares de plantas. No entanto, Han et ai. Demonstraram recentemente que a formação adequada gradiente de auxina, plasmodesmal conectividade symplasmic mediada por calose entre as células adjacentes é também um factor crítico. Neste manuscrito, a estratégia para elucidar o papel de genes específicos, que podem afetar phototropism e gravitropismo alterando a conectividade symplasmic através de modulação de síntese calejado plasmodesmal, é discutido. O primeiro passo é o despiste de respostas aberrantes trópico de 3 dias de idade de plântulas estioladas mutantes ou sobre-expressão de um gene linhas juntamente com o tipo selvagem. Este rastreio preliminarpodem levar à identificação de uma série de genes que funcionam em PAT ou controladores conectividade symplasmic. O segundo rastreio envolve a triagem dos candidatos que mostram respostas trópico alterada por afetar a conectividade symplasmic. Para lidar com tais candidatos, foi examinado o movimento de um marcador symplasmic e a deposição de calose plasmodesmal. Esta estratégia seria útil para explorar novos genes candidatos que podem regular a conectividade symplasmic directa ou indirectamente as respostas durante trópico e outros processos de desenvolvimento.
Introdução
Plantas, como organismos vivos sésseis, desenvolveram uma rede altamente sofisticada de sinalização de célula a célula para abordar vários estímulos ambientais. respostas Tropic são um dos fenômenos pelo qual as plantas respondem a estímulos ambientais. Plantas mostram dois principais trópico respostas, phototropism e gravitropismo. plantas fotossintéticas dobrar em direção à fonte de luz por phototropism para colher o máximo de energia. Da mesma forma, gravitropismo faz as plantas a crescer em direção ao centro da gravidade. O mecanismo fundamental que leva a tais respostas tropicais envolve a formação de gradiente assimétrica da auxina phytohormone 1. O ....
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Protocolo
1. Seleção de mutantes com alterações da resposta fototrópicas e gravitrópico
- Prepare 1x Murashige e Skoog (MS) Médio, pH 5,7, com 0,8% Agar Um dia antes do experimento.
- Adicione 800 ml de água bidestilada a um frasco cónico de 2 L e mexa com uma barra magnética.
- Adicionar 4,4 g de sal de MS ao frasco cónico.
- Adicionar 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) e agita-se até que todos os sais sejam completamente dissolvidos.
- Ajustar o pH do meio a 5,7 com KOH 1 M.
- Transferir a forma de um cilindro de massa e perfazer o volume final para 1 L com ddH 2 O.
- Despeje volta do meio em um ....
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Resultados
Na configuração atual, dexametasona (DEX) -inducible linhas RNAi de AtGSL8 [daqui em diante dsGSL8 (+ dex / -Dex)] foram utilizados, como gsl8 homozigotos mutantes de inserção de T-DNA são mudas letal 18. Três dias de idade de plântulas estioladas dsGSL8 e mudas de tipo selvagem com Dex ± foram expostos a estímulos fototrópicos e gravitrópico. Descobrimos que dsGSL8 (+ dex) mudas eram defeituosos em phototropism e gravitropismo
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Discussão
Neste manuscrito, uma estratégia para a tela mutante / sobre-expressão linhas que são defeituosos nas respostas fototrópicas e gravitrópico devido a calejado PD alterada e, portanto, PD SEL é descrito em detalhes. a síntese e degradação de calose PD é conseguida principalmente por sintases de calose e β-1,3-glucanases, mas a regulação destes enzimas é controlada por muitos factores a montante. Para procurar tais factores a montante ou candidatos que estão diretamente envolvidos na regulação do PD, criámos este método pa.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF-2015R1A2A1A10053576), e por uma bolsa do Programa Next-Generation BioGreen 21 (SSAC, conceder PJ01137901), Administração de Desenvolvimento Rural, República da Coreia. RK, WS, ABB e DK foram apoiados por Cérebro Coreia do 21 programa Plus (BK21 +).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HPTS (sal trissódico de ácido 8-hidroxipireno -1,3,6-trissulfônico) | Sigma | H1529-1G | Corante fluorescente como marcador simplasmático |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Usado para HPTS bloco de agarose |
| Forno de microondas | LG-Goldstar | Máquina para ferver gel de agarose | |
| 100 ml frasco cônico de vidro | Dong Kwang | A0205 | Usado para ferver HPTS agarose placa de Petri em gel |
| (35 mm x 10 mm) | SPL ciências da vida | SPL10035 | Usada para fazer blocos de agarose HPTS e lavar amostras de plantas |
| Lâminas de cobertura de microscópio e lâminas de vidro (24 mm x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Usado para blocos de agarose HPTS e preparação de amostras microscópicas |
| Placas médias MS 125 mm x 125 mm x 20 mm | SPL ciências da vida | SPL11125 | Placas para fazer meio de ágar MS |
| Tesoura | Alemanha Inoxidável | HSB 942-11 | Usado para extirpar a região do gancho de amostras |
| de plantasMurashige e Skoog (MS) mistura de sal basal | Duchefa | P10453.01 | MS meio incluindo vitaminas. |
| (N-morfolino) ácido etanossulfônico (MES) monohidratado | Bioshop | 3G30212 | Para fazer mídia MS. |
| Ágar planta | Duchefa | P1001.1000 | Para solidificar o meio MS. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | Para lavar o tampão de coloração azul de anilina e o corante HPTS de forma plácida. |
| 1 ml de pontas azuis | Sorenson | 10040 | |
| Pipeta de 1 ml | BioPette | L-1101-2 | |
| Fita cirúrgica | MIcropore | 1530-0 | Para selar a placa MS |
| Azul de anilina (azul de metila) | Sigma | M5528-25G | Usado para preparar o tampão de coloração de azul de anilina. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Usado para preparar tampão de coloração azul de anilina. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Usado para a inibição de sintases de calose. |
| Microscópio confocal | Olympus | FV1000MPE SIM | Para verificar a coloração com azul de anilina e o resultado do carregamento do corante HPTS. |
| Agitador | Eu laboratório | K400 | Para misturar solução de mídia. |
| Folha de alumínio | SW cooking foil | Para embrulhar pratos em condições escuras. | |
| Hipoclorito de sódio | Samjin Industry | Para sementes esterilizadas na superfície |
Referências
- Went, F. W., Thimann, K. V., et al. Phytohormones. Experimental biology monographs. Bard, P., et al. , The Macmillan Company. New York. 204(1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christe....
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Triagem de Resposta TrópicaSíntese de Calose PlasmodesmalAnálise de Conectividade SimplásmicaFormação de Gradiente de AuxinaEnsaio de Fototropismo e GravitropismoMétodo do Bloco de Agarose com HPTSAnálise por Microscopia ConfocalColoração de Calose com Azul de AnilinaPlântulas Etioladas de Arabidopsis
