DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Resumo

Este protocolo utiliza eletroporação para introduzir e expressar proteínas marcadas com fluorescência em fibras musculares de camundongos. Após a recuperação após a eletroporação, as fibras são isoladas. As fibras individuais são então visualizadas usando microscopia confocal de alta resolução para visualizar a estrutura muscular.

Resumo

O músculo maduro tem uma estrutura única que é passível de imagens de células vivas. Aqui, descrevemos o protocolo experimental para expressar proteínas marcadas com fluorescência no músculo flexor curto dos dedos (FDB). As condições foram otimizadas para fornecer um grande número de miofibras de alta qualidade expressando o plasmídeo eletroporado, minimizando os danos musculares. O método emprega etiquetas fluorescentes em várias proteínas. A combinação desse método de expressão com microscopia confocal de alta resolução permite imagens de células vivas, incluindo imagens após danos induzidos por laser. Os corantes fluorescentes combinados com imagens de proteínas marcadas com fluorescência fornecem informações sobre a estrutura básica do músculo e sua resposta aos estímulos.

Introdução

Myofibers individuais são células sinciciais grandes, altamente organizados. Existem alguns modelos de cultura celular para o músculo; No entanto, estes modelos têm como principal limitação que não diferenciar plenamente em myofibers maduros. Por exemplo, as linhas de células C2C12 e L6 são derivados de ratinhos e ratos, respectivamente ^1-4. Sob condições de privação de soro, as células mononucleares "mioblastos-like" cessar proliferação, submetido a retirada do ciclo celular, e entrar no programa miogênica formando células multinucleadas com sarcômeros, referido como myotubes. Com condições de cultura prolongados, myotubes podem exibir propriedades contrá....

Protocolo

Os métodos neste estudo foram realizados de acordo com a ética Feinberg School of Medicine da Northwestern University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) aprovou diretrizes. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento.

1. Processo Experimental para in vivo Eletroporação do brevis flexor (FDB) Bundle Muscle no mouse

1. Plasmídeos de desenho para expressão in vivo utilizando um promotor conhecido para expressar em células de mamífero (por exemplo, citomegalovírus, CMV) ou no músculo (por exemplo, músculo de creatina quinase, MCK) ^6,7. Plasmídeos maiores podem expressar em....

Resultados

A electroporação é uma técnica minimamente invasiva que introduz eficientemente DNA de plasmídeo purificado no brevis flexor (FDB) feixe muscular (Figura 1A). Sete dias após a transfecção proteína marcada fluorescentemente é visualizado em miofibras isolados (Figura 1B). Isolado fibras são então colocadas em placas e preparado para imagiologia de um microscópio confocal. As fibras podem ser submetidas a uma lesão induzida por laser. Corante FM pode ser u.......

Discussão

O uso de electroporação para estudar as proteínas marcadas por fluorescência in vivo, é idealmente adequado para o estudo do músculo devido à ausência de modelos de linhas celulares adequadas que reproduzem com fidelidade a estrutura da célula de músculo inteira. Este protocolo descreve a utilização de electroporação e microscopia confocal de alta resolução para fornecer imagens detalhadas de localização de proteínas e translocação após o ferimento a laser. Este método pode ser adaptado para estudar processos c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Life Technologies	11995-073 Meios de	dissecação Diluição: 50 ml +100 g BSA
Colgenase, Tipo II	Life Technologies	17101-015	Digestão de Fibras Diluição: 160 mg / 4 ml DMEM (estoque de 40 mg/ml alíquota)
Pratos Falcon de 12 poços	Ringers
			de Digestão de Fibras 877229 da Fisher ScientificDigestão e imagem de fibras Diluição: 146 mM NaCl 5 mM    KCl 2 mM    CaCl2 1 mM    MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml Pipetas	Axygen	T-1000-C-R	Lâminas
Barbear	Personna	94-120-71	Digestion
Precision Glide 30 G agulha	BD Biosciences		305128 Dissection
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	Dissection
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	Dissecção
	FST by Dumont	#5/45
Pinça	Dissecção	Roboz	RS-4913
Tesoura de	World Precision Instruments	500260	Dissecção
BSA	Sigma	A7906	Meio de dissecção Diluição: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm pratos	Fisher Scientific	08772B	Dissecção - usado para segurar sylgard
de Eletroporação	de Argila
	Grampos	Eletroporação	Grass s88x
	Radio Shack	270-356	Eletroporação
Triadine	Aplicare	82-220	Agulha de Eletroporação
Precision Glide 27 G	BD Biosciences	305136	Simulador de Eletroporação
	Grama	SIU-V	Gaze de Eletroporação
	Covidien	2146	Eletroporação
Injeção de Hialuronidase	Sigma	H4272	Diluição: Adicione 160 ul PBS (1x) a 40 µ l 5x estoque
1 cc U-100 Seringa de Insulina (28G1/2)	BD Biosciences	329420	Injeção
Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	02-682-550	Injeção
35 mm prato Microwell com fundo de vidro	MaTek	P35G-1.5-14-C	Microscopia
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	Microscopia Diluição: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	Microscopia< Diluição br/>: Final 2,5 ug/ml
Plasmídeo Livre de Endotoxinas Maxi Kit	Qiagen	12362	Purificação de Plasmídeo

Solução de de para Digestão Pinça de de Dissecção Estimulador de