Artigo de método
A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).
Os intensificadores controlam a identidade celular regulando a expressão gênica específica do tecido de maneira independente de posição e orientação. Esses intensificadores geralmente estão localizados distalmente do gene regulado em regiões intergênicas ou mesmo dentro do corpo de outro gene. A natureza independente da posição da atividade do intensificador torna difícil combinar os intensificadores com os genes que eles regulam. A deleção de uma região intensificadora fornece evidências diretas da atividade do intensificador e é o padrão-ouro para revelar o papel de um intensificador na transcrição gênica endógena. Os métodos convencionais de deleção baseados em recombinação homóloga foram superados por avanços recentes na tecnologia de edição de genoma, que permitem mudanças rápidas e precisamente localizadas nos genomas de vários organismos modelo. A edição do genoma mediada por CRISPR/Cas9 pode ser usada para manipular o genoma em muitos tipos de células e organismos de forma rápida e econômica, devido à facilidade com que o Cas9 pode ser direcionado ao genoma por um RNA guia de um plasmídeo de expressão sob medida. A deleção homozigótica de elementos reguladores de genes essenciais pode levar à letalidade ou alterar o fenótipo celular, enquanto a deleção monoalélica de intensificadores transcricionais permite o estudo da cis-regulação da expressão gênica sem esse problema de confusão. Apresentado aqui é um protocolo para deleção mediada por CRISPR/Cas9 em células-tronco embrionárias (ES) de camundongos F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). A deleção, triagem e análise de expressão monoalélica é facilitada por polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) entre os dois alelos que ocorrem em média a cada 125 pb nessas células.
Elementos reguladores da transcrição são críticos para a sintonia fina espaço-temporais da expressão de genes durante o desenvolvimento e uma modificação destes elementos pode resultar em doença devido à expressão aberrante do gene 2. Muitas regiões associados à doença identificadas por estudos de associação de genoma de largura estão em regiões não codificantes e têm características de potenciadores da transcrição 3-4. Identificando potenciadores e combinando-os com os genes que regulam é complicado uma vez que são muitas vezes localizados vários quilobases de distância a partir dos genes que regulam e podem ser activados de um modo ....
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1. projetar e construir o gRNA
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O protocolo aqui descrito utiliza células F1 ES para estudar -regulação cis da expressão do gene em células estimuladoras suprimido monoalélicos gerados usando CRISPR / edição Cas9 genoma (Figura 1). O gRNA e desenho de primers específicos de alelo para genotipagem e expressão do gene são os fatores-chave para esta abordagem. Cada conjunto de primers específicos de alelo devem ser validados por qPCR para confirmar a especificidade alelo. Iniciadores específicos .......
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CRISPR / Cas9 tecnologia de edição genoma mediada fornece um método simples, rápido e barato para a modificação do genoma. O método aqui descrito para gerar e analisar eliminação monoalélicos potenciador para potenciador caracterização funcional tira vantagem de SNPs em células de ratinho F1. As vantagens deste tipo de abordagem são os seguintes: 1) as supressões potenciadoras monoalélicos não produzem efeitos de confusão que ocorrem quando um intensificador crítica é suprimida de ambos os alelos, isto é, uma g.......
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Os autores leram as políticas de Jove dos conflitos de interesses e não têm conflitos de divulgar.
Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Mitchell pelas discussões úteis. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, pela Fundação Canadense para Inovação e pelo Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário (subsídios operacionais e de infraestrutura mantidos pela JAM).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Polimerase de DNA de alta fidelidade de Phusion | NEB | M0530S | DNA polimerase de alta fidelidade usada na montagem de gRNA |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611L | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | Uma sequência alvo é clonada neste vetor para criar o plasmídeo de gRNA |
| pCas9_GFP | Addgene | 44719 | SpCas9 e EGFP otimizados para códon plasmídeo de co-expressão |
| AflII | NEB | R0520S | |
| EcoRI | NEB | R3101S | |
| Sistema de Transfecção de Néon 100 µ L Kit | Life Technologies | MPK10096 | Tecnologia de transfecção de microporador |
| prepGEM | ZyGEM | PT10500 | reagente de extração de DNA genômico |
| Nucleo Spin Gel & Limpeza PCR | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Kit Mini de Plasmídeo de Alta Velocidade | Geneaid | PD300 | |
| Maxi Kit de Plasmídeo Livre de Endotoxinas | Geneaid | PME25 | |
| SYBR select mix para CFX | Life Technologies | 4472942 | reagente qPCR |
| iScript kit de síntese de cDNA | Bio-rad | 170-8891 | Reagente de transcrição reversa |
| 0,25% Tripsina com EDTA | Life Technologies | 25200072 | |
| PBS sem Ca/Mg2+ | Sigma | D8537 | |
| 0,5 M EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175095 | |
| 1 M HEPES | Life Technologies | 13630080 | |
| BSA fração V (7,5%) | Life Technologies | 15260037 | |
| Eficiência Máxima Células competentes DH5α | Invitrogen | 18258012 | |
| FBS | ES células qualificadas | O FBS é submetido a um teste prévio em células ES de camundongo para pluripotência | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| DMEM | Life Technologies | 11960069 | |
| Pencillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| Não essencial aminoácido | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma | M7522 | |
| Placa de 96 poços | Sarstedt | 83.3924 | |
| Fita de vedação | Sarstedt | 95.1994 | |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | recipiente de congelamento de células sem álcool |
| CHIR99021 | Biovision | 1748-5 | Inibidor para cultura de células F1 ES |
| PD0325901 | Invivogen | inh-pd32 | Inibidor para cultura de células F1 ES |
| LIF | Chemicon | ESG1107 | Inibidor para cultura de células F1 ES |
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