Este manuscrito descreve como preparar biochips fluídicos com células epiteliais branquiais de truta arco-íris para uso em um sensor de impedância de substrato de célula elétrica portátil de campo. O protocolo para executar um teste rápido de toxicidade da água potável com o sensor também é descrito.
Artigo de método
Preparação e Teste de impedância baseado em Biochips fluídicas com células RTgill-W1 para avaliação rápida das amostras de água para a toxicidade
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este manuscrito descreve como preparar biochips fluídicos com células epiteliais branquiais da truta arco-íris (RTgill-W1) para uso em um sensor portátil de toxicidade da água em campo. Uma monocamada de células RTgill-W1 se forma nos eletrodos sensores contidos nos biochips. Os biochips são então usados para testes em um dispositivo portátil de detecção de impedância de substrato de célula elétrica (ECIS) projetado para testes rápidos de toxicidade de água potável. O manuscrito descreve ainda como executar um teste de toxicidade usando os biochips preparados. Uma amostra de água de controle e a amostra de água de teste são misturadas com meios em pó pré-medidos e injetadas em canais separados do biochip. As leituras de impedância dos eletrodos sensores em cada um dos canais do biochip são medidas e comparadas por um programa de software estatístico automatizado. A tela no instrumento ECIS indicará "Contaminação detectada" ou "Nenhuma contaminação detectada" dentro de uma hora após a injeção da amostra. As vantagens são a facilidade de uso e a resposta rápida a um amplo espectro de produtos químicos inorgânicos e orgânicos em concentrações relevantes para as preocupações com a saúde humana, bem como a estabilidade a longo prazo dos biochips armazenados em um estado pronto para teste. As limitações são a necessidade de armazenamento refrigerado dos biochips e a sensibilidade limitada aos pesticidas inibidores da colinesterase. As aplicações para este detector de toxicidade são para testes rápidos portáteis de campo de abastecimento de água potável pelo pessoal de Medicina Preventiva do Exército ou para uso em instalações municipais de tratamento de água.
Introdução
O objectivo global foi o de desenvolver um método para a sementeira de células, de armazenamento e ensaio de biochips fluídicos no biossensor ICE. A meta para o desenvolvimento deste biossensor foi para atender às especificações do Exército dos Estados Unidos para um dispositivo portátil de campo que poderia detectar uma possível contaminação do abastecimento de água potável sendo usado por soldados. Os requisitos para o sensor de toxicidade foram que poderia detectar um amplo espectro de compostos industriais tóxicos rapidamente (dentro de uma hora) em concentrações relevantes para a saúde humana, que o dispositivo ser campo-portátil, e os componentes biológicos que têm um prazo de validade de pelo menos, nove meses. Refrigeração, mas não de congelamento, de componentes perecíveis era aceitável.
Historicamente, tecnologias de teste de campo de água portátil com um componente biológico para eles (tais como anticorpos, enzimas, ou ácidos nucleicos) têm sido 1-3 específico para a substância analisável. A desvantagem com estes tipos de biossensores é que eles vão ONLY detectar um tipo de química de cada vez. Vários sensores são necessários se suspeita-se que mais de um produto químico está presente. Se um sensor específico não é no repertório de teste, contaminantes químicos na água pode facilmente passar despercebido.
sensores de toxicidade de base ampla, por outro lado, têm o potencial para preencher esta lacuna tecnologia. Estes normalmente têm um componente celular para eles 4-8. As vantagens de toxicidade biossensores baseados em larga são de que eles podem detectar a presença de uma grande variedade de contaminantes químicos, incluindo misturas e desconhecidos, num período relativamente curto de tempo 5,9,10.
O conceito de utilizar a medição da impedância eléctrica de monocamadas de células como um sensor de toxicidade possível, o que também é conhecido como substrato de células eletro-impedância de detecção (ECIS), foi descrita pela primeira vez por Giaever e Keese 11. Ao longo das últimas duas décadas tem sido demonstrado ser um indicador sensível da célula VIABility e citotoxicidade. Basicamente, a monocamada de células que é aderida aos eléctrodos nos biochips é exposta a alta frequência e de baixa voltagem e amperagem do sinal de corrente alternada. A monocamada confluente de células impede o fluxo de electrões. Quando a integridade da monocamada de células fica comprometida (por exemplo, quando uma substância química tóxica é introduzida), o sensor ECIS grava uma alteração na impedância eléctrica 11-14. A Figura 1 ilustra o princípio das ICE em relação à monocamada de células no biochip .
Figura 1:.. Princípio da ECIS Ilustração de uma monocamada de células em um biochip com simplificado leitor ECIS esquema elétrico Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Inicialmente, as linhas celulares de mamífero foram semeadas em biochips fluídicos e foram usadas na tecnologia de sensor de ECIS aqui descrito 12. Estas células não estavam prático para o uso no campo, no entanto, porque necessárias alterações frequentes do suporte, teve um período de vida útil limitada, e necessário um ambiente de CO 2 artificial e uma temperatura de 37 ° C de incubação. Descobriu-se que uma linha celular comercialmente disponível derivada de células epiteliais truta arco-íris de emalhar (RTgill W-1 de células) podem ser testados à temperatura ambiente a CO ambiente 2, formaram uma monocamada confluente nas biochips, pode ser armazenado a temperaturas de refrigeração, e teve uma resposta rápida (1 hora ou menos) para um largo espectro de produtos químicos, em concentrações relevantes para a saúde humana 12. Aplicações das células RTgill-W1 em toxicologia, bem como em pesquisa básica, são revistos por Lee et al 15.
Os métodos para a semeadura, armazenamento e ao controlo dos biochips fluídicas que contêmmonocamadas de células RTgill-W1 sobre biochips fluídicos em um biossensor ECIS são descritos aqui. Os biochips fluídicos pode ser armazenado por até 9 meses em um estado refrigerado e pode ser enviado em um recipiente de armazenamento a frio, para testes de beber água SUPPLIES.THE acompanham leitores ECIS, ou unidades de teste, são enviados separadamente. Os biochips têm dois componentes para eles; uma camada de policarbonato superiores com dois canais de fluido separadas, e uma camada inferior electrónico que contém quatro almofadas do eléctrodo por canal para detecção da impedância. Há 10 eletrodos de trabalho por pad; cada um dos eléctrodos é 250 um de diâmetro. Os biochips montados têm conexões de eletrodos de ouro para a aquisição de leituras de impedância, quando inserido na unidade de teste ECIS. Cada um dos dois canais em forma de U fluídicos fechados realizará 2 ml da suspensão de células RTgill-W1. A Figura 2 mostra um biochip fluídica no leitor ECIS com uma ampliação de células confluentes em um único eléctrodo de detecção.
Figura 2:.. Biochip Fluidic em ECIS Leitor área ampliada mostra uma monocamada confluente de células RTgill-W1 em um único eléctrodo de detecção por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocolo
1. Preparação dos materiais de teste
NOTA: A fim de preparar os biochips para testes, vários frascos confluentes de células RTgill-W1 precisa estar pronto. Uma boa estimativa do número de frascos necessários é um confluente T175 frasco durante 16 biochips para ser semeado.
- Execute as seguintes etapas em um gabinete II classe biológica de segurança (biohood), utilizando técnica asséptica. Use etanol a 70% para desinfecção do biohood e quaisquer materiais colocados no exaustor.
- Preparar substrato fibronectina para os fluídicos biochips descongelando um frasco de 1 mg de fibronectina e diluindo em 100 ml de solução estéril de meio L-15 para uma concentração de 10 ug / ml. Congelar em alíquotas de 40 ml estéreis em tubos de 50 ml de polipropileno cónicos à temperatura de -20 ° C. Descongelar à temperatura ambiente, várias horas antes de semear as biochips. Uma vez descongelado, não voltar a congelar.
- Preparar meios de cultura de células por adição de 50 ml de soro bovino fetal, 5 ml de 200 mM de um sup de L-alanil-L-glutaminaplemento, e 5 ml de uma solução de penicilina / estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / mL e / ml 10.000 ug de estreptomicina) a 500 ml de meio L-15. Isto irá produzir 560 ml de meio de cultura de células que contêm 9% de soro. Refrigerar.
Nota: Este será o meio de cultura celular completo usado para os frascos de cultura e os biochips.
- Em pó Frascos de mídia
- Preparar antes do tempo frascos 0,1 dram snap-tampão contendo 60 mg ± 0,5% de pó de L-15ex utilizando um dispensador de pó automatizado. Rotular os frascos com a data em que o pó foi dispensado e frascos refrigerar (em quantidades de 50) em Recloseable sacos de polietileno metalizadas; cada um contendo três 1 g de dessecação pacotes de gel de sílica.
Nota: frascos L-15ex mídia em pó pode ser feito e armazenado por até 9 meses de antecedência dos testes.
- Preparar antes do tempo frascos 0,1 dram snap-tampão contendo 60 mg ± 0,5% de pó de L-15ex utilizando um dispensador de pó automatizado. Rotular os frascos com a data em que o pó foi dispensado e frascos refrigerar (em quantidades de 50) em Recloseable sacos de polietileno metalizadas; cada um contendo três 1 g de dessecação pacotes de gel de sílica.
- Adicione uma solução de 100 ml de 20% de lixívia por diluição de lixívia doméstica com água desionizada (Dl). Estimado que 5 ml de solução de lixívia serão necessários para cada biochip.
- Faça conjuntos de tubos biochip cortando secções de 27 mm de tubo biocompatível autoclave (2 secções para cada biochip para ser semeado) e encaixe as duas extremidades do tubo com acessórios luer policarbonato deslizamento. Coloque os conjuntos de tubos em um saco de autoclave e autoclave durante 8 minutos a 134 ° C. Também plugues autoclave biochip (2 por biochip) em um saco separado com as mesmas configurações.
- água Dl autoclave durante 30 min at121 ° C.
Nota: Esta água irá ser usado para enxaguar biochips após a sementeira. Estimamos que 10 ml serão necessários para cada biochip.
Nota: O volume efectivo de cada canal biochip é de 2 ml, mas 5 ml de água esterilizada é enxaguado através de cada canal após a remoção da solução de lixívia. - Faça conjuntos de tubos de injeção seringa, cortando secções de 27 mm de tubo biocompatível e anexando acessórios deslizamento luer machos para ambas as extremidades da tubulação. Coloque os conjuntos de tubos em uma bolsa de esterilização papel de selagem térmica e autoclave durante 8 minutos a 134 &# 176; C.
2. Fluidic Procedimento Biochip Sementeira
Nota: Execute todos os procedimentos em que os biochips ou os meios de comunicação é manuseado em uma cabine de segurança biológica classe II, utilizando técnica asséptica.
- Vinte e quatro horas antes da semeadura programada, retire os biochips de embalagem fabricante no biohood e coloque em casos de instrumento de plástico esterilizados.
- Esterilizar os biochips usando uma solução de água sanitária 20% como se segue
Nota: Historicamente, este processo de branqueamento tem impedido o crescimento de fungos nos biochips durante o armazenamento a longo prazo em caso de que a esterilização do plasma dos biochips feito pelo fabricante não foi eficaz.- Usando uma seringa de 20 ml esterilizado, com um tubo de injecção da seringa montagem ligado e trabalhando no biohood, injectar 2 ml da solução de lixívia a 20% em cada canal do biochip. Permitir que os biochips para sentar-se durante 1 hora com a solução de água sanitária.
- Após uma hora, asp vácuoirados a solução de lixívia a partir de ambos os canais usando um conjunto de luer slip macho estéril ligada ao tubo de sucção de vácuo. Use um dos conjuntos de tubos biochip como um dreno quando enxaguar os biochips.
- Usando uma seringa esterilizada de 20 ml ligado a um conjunto de injecção da seringa estéril, lave cada canal do chip com 5 ml de água estéril, permitindo que o excesso de água seja drenado para um recipiente na biohood. Então vácuo aspirado fora da água como descrito para a lixívia e colocar os biochips de volta para os casos de instrumento de plástico e deixe na biohood até semeado com células no dia seguinte.
- Sessenta minutos antes de semear as biochips, injectar 2 ml do / solução de fibronectina ml de 10 ug em cada canal do biochip. Deixar os biochips no biohood durante 60 minutos, e, em seguida, aspirado de vácuo fora da fibronectina (como descrito no passo 2.2.3) antes de semear o biochip com células. Coloque duas seções dos conjuntos de tubos biochip estéreis (consultesecção 1.4) nas portas dos biochips.
- Trypsinize um confluentes RTgill-W1 balão T175 para cada 16 biochips usando procedimentos descritos na American Type Culture Collection (ATCC) descrição do produto de folha 16.
- Aspirar fora da mídia do frasco confluente (s) de células.
- Lavar a camada de células com 15 ml de PBS e depois aspirar fora.
- Adicionar 6 ml de tripsina / EDTA para a camada de células em cada frasco T175 e permitir que as células trypsinize durante ~ 5 min.
- Adicionar 15 ml de meio de cultura celular completo L-15 a cada frasco para parar a tripsinização.
- Combinam-se as suspensões de células num recipiente descartável estéril.
Nota: O tamanho do recipiente pode variar de 150-500 ml, dependentes do número de biochips sendo semeada. Estimado que 5 ml de suspensão de células será necessária por biochip.
- Remover ~ 1 ml da suspensão de células e colocar num tubo de microcentrífuga para contagem. Usando um microscópio de campo claro com um objecti 10Xve e um hemocitómetro, contam-se uma alíquota de 10 ul das células e calcular o volume de meios completo L-15 de cultura de células necessárias para atingir uma suspensão de células de 2,5 x 10 5 culas / ml.
Nota: Se utilizar a suspensão de células para semear frascos para continuar a cultura, este seria o ponto de o fazer. Ajustar a concentração de suspensão de células utilizando meios de cultura celular completo L-15. - Usando uma agulha estéril 20 ml syringeattached para um conjunto de tubo de injecção da seringa estéril (ver secção 1.6), injectar 2,5 ml da suspensão de células para a porta exterior de cada canal da biochip (ou seja, as portas que não têm o tubo ligado), permitindo alguma da suspensão de células extra para fluir para fora do tubo dentro de um recipiente de resíduos no biohood.
Nota: Isto irá assegurar que todo o canal e o tubo ligado será cheio da suspensão de células.- Criar um loop fechado para cada canal biochip, inserindo a extremidade livre da mangueira com os Fitti luerng nas portas exteriores de cada canal.
- Limpar qualquer excesso de materiais fora das laçadas fechadas com uma toalha de papel, humedecido com 70% de etanol e colocar os biochips de volta na caixa de plástico em uma incubadora a 20 ° C. Dê a cada biochip um número de identificação único.
- Nos dias 4 e 7, retire os biochips do C incubadora de 20 ° e reabastecer os meios de comunicação em todos os biochips com total meios de cultura celular equilibrada temperatura L-15. Seguir o mesmo procedimento como no passo 2.6, excepto o uso apenas G-15 de meio de cultura celular, em vez (sem suspensão de células). Coloque os biochips de volta no C incubadora de 20 ° após a alimentação dia 4.
- Após a alimentação dia 7, remover e descartar as mangueiras de os chips e inserir os bujões de drenagem autoclavados nos biochips.
- Coloque as biochips numa caixa numa incubadora C 6 ° até serem utilizadas para os testes.
Nota: Os chips podem ser armazenados em temperaturas refrigeradas para até 9 meses e ainda são viáveis para testes in os leitores ICE.
3. ECIS Testing com Biochips
- Prepare produtos químicos de teste se estiver usando. (Ver Brennan, et al., 2012 7, para a preparação de produtos químicos de teste).
- Remover leitor ECIS e material de teste a partir da caixa de transporte. Remover um biochip preparado a partir do 6 ° C incubadora. Coloque o biochip numa toalha de papel. Ligue o leitor ECIS.
- Usando 10 ml seringas, dispensar 10 ml de água de controle em um frasco de 0,5 oz controle de plástico transparente marcados e 10 ml da amostra de teste em um 0,5 oz jar test plástico transparente rotulados.
Nota: 1) Certifique-se de remover as bolhas para uma medição precisa. 2) As seringas e frascos são codificados por cores; azul para controle e vermelho para o teste. - Retire os dois frascos de mídia em pó a partir dos sacos de plástico. Abra um dos frascos de mídia em pó (uso de ferramenta multiuso se necessário) e despeje todo o conteúdo de um frasco dentro do frasco com água controle, soltando todo o frasco parasolução bem. Repita este procedimento com o frasco de teste. Tampão e agitar os frascos para garantir que o pó esteja dissolvido.
- Encher cada um dos coloridos seringas de 10 ml com 9 ml de um ou outro controlo (seringa azul) ou a partir de soluções respectivos frascos de teste (vermelho de seringa). Retirar as bolhas de ar a partir de seringas.
- Remova os plugues dos portos biochip e anexar o dreno.
- Coloque o biochip na bandeja de plástico removível no leitor ECIS e feche a tampa.
- Anexar seringas cheias para os portos biochip exteriores e anexar o êmbolo da seringa.
- Na tela principal, selecione "Next" para iniciar a pré-teste.
Nota: O software leitor irá verificar impedâncias. Se impedâncias estão dentro do intervalo definido pelo usuário (geralmente entre 1.000 e 3.000 ohms) a tela irá registar "Cartucho Aprovado" como indicado na Figura 3, e instruir o usuário selecione "Next" eo software vai avançar para o passo 3.10). Se as impedâncias não estão dentroo intervalo definido por causa de um biochip com defeito ou conexão defeituosa do biochip para o leitor (geralmente devido a um desalinhamento dos eletrodos), em seguida, a tela irá registar "Cartucho Falha" e o usuário terá a opção de "Abortar" ou "Verificar" o teste.- Selecione "Abortar" para voltar para o passo 3.9). Selecione "Verificar" para avançar para o passo 3.10) depois de receber um "cartucho Aprovado" mensagem e selecionando "Next".
Nota: É melhor tomar a biochip para fora e inspecionar visualmente-lo por defeitos ou vazamento se um "cartucho falhou" mensagem é recebida antes de prosseguir com um novo biochip.
- Selecione "Abortar" para voltar para o passo 3.9). Selecione "Verificar" para avançar para o passo 3.10) depois de receber um "cartucho Aprovado" mensagem e selecionando "Next".
Figura 3:. ECIS leitor de tela de um Biochip com leituras de impedância aceitáveis A captura de tela mostra as leituras de impedância iniciais em ohms de cada um dos quatro coeletrodos ntrol (CE) e 4 eletrodos da amostra de ensaio (SE) no interior do biochip fluídico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Quando solicitado pelo leitor, insira as informações de amostra usando um teclado virtual e selecione "Aceitar" quando terminar.
Nota: O software leitor ECIS irá carimbar automaticamente cada conjunto de dados com a data, hora e outras informações inseridas pelo usuário; tais como o número biochip, e o tipo de química e concentração. Dois minutos de dados de impedância serão recolhidos a partir do biochip inserido e um temporizador no ecrã, vai contar-down tempo. - Depois de dois minutos, quando solicitado por instruções na tela que estão piscando dentro de uma caixa vermelha, clique em "Avançar". Quando solicitado por uma caixa verde piscando para "Injetar amostras agora", injetar o controle e meios de teste das seringas ligados simultaneamente no elá biochipels. Deixar as seringas no lugar sobre os biochips quando terminar.
Nota: Os valores de impedância serão recolhidos uma vez por minuto para 60 min. Se o software de leitura ECIS determina que o canal de tratamento é estatisticamente diferente do canal de controlo, em qualquer ponto entre 10 e 60 min após o início do teste, em seguida, a apresentação no ecrã indicará que a amostra é "contaminado". Se o tratamento não é diferente do canal de controlo, em seguida, a tela irá indicar "nenhuma contaminação detectada" no final da execução do teste. - os resultados dos testes dos recordes como contaminados ou não contaminados para cada amostra.
- No final do ensaio, remover e descartar o biochip. Enxágüe e deixe secar as seringas, frascos de teste e bandeja de plástico removível que abrigava o biochip durante os testes.
Nota: O leitor ECIS tem 4 GB de armazenamento a bordo para o software operacional, modelos de controlo e os arquivos de teste gerado a execução de um teste. Isto permite que vários thousand arquivos de teste para ser armazenado para o leitor. Os arquivos podem ser recuperados com uma unidade de salto USB e transferidos para um computador para análise posterior para fins de pesquisa, se desejar.
Resultados
A tecnologia ECIS descritas neste documento foram submetidos a testes da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (USEPA) -sponsored Testing Tecnologia e Programa de Avaliação (TTEP). Treze produtos químicos foram selecionados para testar como representantes de um amplo espectro de compostos industriais tóxicos que poderiam ser possíveis contaminantes da água potável. Durante o teste, 9 dos 13 foram detectados por ECIS dentro de uma hora a concentrações que são relevantes para a saúde humana 8. A tabela 1 ilustra os resultados deste teste contaminante. A Figura 4 é representativo do que um resultado "contaminadas" ficaria em a tela leitor ECIS. Para a maior parte, impedâncias celulares diminuiu para amostras contaminadas em comparação aos controles. Ocasionalmente, certos compostos podem causar um aumento na impedância.
Também resumidos na Tabela 1 é o teste de água limpa. Quarenta amostras de água potável foram executados e nenhuma contaminação foi detectada em nenhuma das amostras (ver Figura 5) para uma captura de tela representante da "nenhuma contaminação detectado".
Figura 4: ECIS leitor de tela de um "contaminadas" Amostra de Água Um exemplo normalizados impedância gráficos e os resultados de uma amostra de água que foi contaminada.. As linhas azuis representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos de controlo; linhas vermelhas representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos da amostra de teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ECIS leitor de tela de um "nenhuma contaminação detectado" Amostra de Água Um exemplo normalizados impedância gráficos e os resultados de uma amostra de água que não foi contaminada.. As linhas azuis representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos de controlo; linhas vermelhas representam impedâncias normalizadas de cada um dos eléctrodos da amostra de teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Categoria | contaminante | Concentração testada (mg / L) 1 | Detectado ≤1 hora n = 4/4 fichas | |||
| pesticidas | aldicarbe | 0,17 | não | |||
| Arsen IC (arsenito de sódio) | 4,5 | sim | ||||
| A azida (azida de sódio) | 46,7 | sim | ||||
| fenamifos | 0,56 | não | ||||
| metamidofos | 1.4 | não | ||||
| metilparatião | 33,6 | sim | ||||
| Paraquat (dicloreto) | 4.6 | não | ||||
| Pentaclorofenato (de sódio) | 71,9 | sim | ||||
| Químicos industriais | Amônia | 924 | sim | |||
| De cobre (sulfato de cobre II) | 103 | sim | ||||
| Cyanide (sódio) | sim | |||||
| Mercúrio (cloreto) | 24,7 | sim | ||||
| Tolueno | 444 | sim | ||||
| Clean Water 2 | Nenhum | N / D | não | |||
| 1 concentrações testadas são as mesmas que no manuscrito por Widder, et ai. (2014). | ||||||
| 2 40 amostras de água potável foram executados sem contaminação. | ||||||
Tabela 1: Os contaminantes em amostras de água detectado pelo ECIS.
Discussão
A tecnologia ECIS teve um bom desempenho em um ambiente de laboratório e foi capaz de detectar contaminantes da água potenciais em concentrações que são relevantes para a saúde humana. A portabilidade e embalagem da tecnologia torna mais propício para uso no campo.
etapas críticas do protocolo para o sucesso da tecnologia são as seguintes: 1) Manter as condições de assepsia durante a cultura, sementeira, ea alimentação dos biochips, 2) Manter os biochips semeados em condições de refrigeração até que esteja pronto para o teste uma vez que as células RTgill-W1 não sobreviverá muito tempo, uma vez que eles são submetidos a temperaturas acima de 25 ° C, 3) pesar com precisão o G-15ex nos frascos media em pó e medir com precisão as amostras de água para evitar a produção de falsos positivos, o que pode ser causado por uma mudança na osmolaridade dos meios de comunicação em vez de toxicidade da amostra, 4) Siga as instruções de utilização no ecrã do ECIS para a execução dos testes. O software no leitor irá alertar o usuário se um biochip é inaceitável para ensaios (com base nas leituras de impedância inicial) quando o biochip é primeiro inserido no leitor. Se os níveis de impedância são inaceitáveis para o teste, o software não vai permitir que o utilizador prossiga com o teste até que um novo biochip é usado. Razões para leituras de impedância inaceitáveis são geralmente devido a um ligeiro desalinhamento dos eléctrodos biochip com os pinos de leitor de LCE ou fuga de fluido ao longo de uma das bordas de colagem do biochip.
Existem alguns limites para essa tecnologia, porque o sensor ECIS só foi testado com água potável e não com água de superfície. As células RTgill-W1 que estão no biochip não podem tolerar o congelamento ou a temperaturas muito acima dos 25 ° C durante períodos prolongados de tempo (intervalo de tempo pode ser de horas a dias dependendo da temperatura. Os biochips funcionar melhor numa gama de temperatura de refrigeração a temperatura ambiente 7. Eles estão prontos para uso imediato, no entanto, logo depois de ser removed de armazenamento a frio. Portáteis recipientes de armazenamento a frio são usadas atualmente por pessoal do Exército no campo de suprimentos sensíveis à temperatura. Estes mesmos recipientes podem ser usados para o transporte biochip semeado.
Outro limite para esta tecnologia é que mesmo que seja um sensor de toxicidade de banda larga, não respondem bem, se de todo, a compostos inibidores de colinesterase, tais como alguns pesticidas. Para preencher esta lacuna capacidade, o sensor de ICE concebido para ser usado em conjunto com um ensaio de teste rápido de pesticidas disponíveis comercialmente ao testar amostras de água a fim de proporcionar ao utilizador uma gama mais ampla de ensaios de toxicidade. O kit é um ensaio enzimático rápida concebido para detectar pesticidas organofosforados e carbamatos no prazo de 30 min.
O sensor ECIS complementa o wqas-PM (Water Quality System Analysis - Medicina Preventiva) Sistema de teste de água campo, atualmente usado por militares medicina preventiva para detectar, arsenic, chumbo, ou cianeto numa amostra de água potável. Embora o sensor ECIS não identificará o que o contaminante é, ele irá indicar se certos metais ou compostos orgânicos estão presentes, o que indica que a água pode não ser adequado para o consumo humano. Os resultados do teste ECIS estão disponíveis dentro de uma hora. As amostras de água podem ser enviados para análises ulteriores para a identificação do contaminante, se houver um resultado de teste positivo.
Como descrito acima, o leitor ICE concebido para ser parte de um sistema que inclui um kit de ACE enzimático separado, a fim de cobrir um largo espectro de detecção de contaminantes. Ambos os leitores estão a ser embalado em um caso resistente para o transporte de campo para uso em campo por soldados.
Divulgações
Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são de responsabilidade dos autores e não são necessariamente endossadas pelo Exército dos EUA. As citações de organizações comerciais ou nomes comerciais neste relatório não constituem um endosso ou aprovação oficial do Departamento do Exército dos produtos ou serviços dessas organizações. Os autores Linda M. Brennan e Mark W. Widder, ambos do Centro de Pesquisa em Saúde Ambiental do Exército dos EUA, declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Michael Mayo, Michael McAleer e Alex Greis são funcionários da Nanohmics que produz os biochips e instrumentos descartáveis usados neste artigo.10251980
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Comando de Pesquisa Médica e Material do Exército dos EUA e pelo programa de Pesquisa em Inovação para Pequenas Empresas e Transferência de Tecnologia para Pequenas Empresas; Contrato nº W81XWH-13-C-0093. Gostaríamos de agradecer à Dra. Lucy Lee, da Universidade de Fraser, por ser nossa mentora de cultura de células RTgill-W1 e ao Dr. Niels Bols, da Universidade de Waterloo, pelo desenvolvimento da linha de células RTgill-W1.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Soro fetal bovino | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para meios de cultura de células L-15 completos (10%). |
| Fibronectina, plasma bovino | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Armazenar @ -20 °C. Descongelar @ temperatura ambiente antes de usar. Misture com meio L-15 para uma concentração de 10 μ g/ml e congelar @ -20 ° C em alíquotas. Use como substrato para biochips. |
| Meio L-15 sem L-glutamina | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Meio basal para cultura de células e alimentação de biochips. Armazene a 6 ° C. |
| L-15ex em pó com vermelho de fenol | US Biological www.usbio.net | L1501 | é pesado em alíquotas de 60 mg em frascos de 0,1 dram e armazenado a 6 & C em bolsas de alumínio com embalagens dessecantes. Prazo de validade de nove meses. Misturado com 10 ml de amostra de água para teste em biochips. |
| PBS, sem Ca2+ ou Mg2+ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Armazene em temperatura ambiente. Usado para enxaguar meios ao tripsinizar frascos de cultura de células. |
| Tripsina, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Descongele à temperatura ambiente e use para tripsinizar frascos de cultura de células. |
| Frascos de cultura T175 | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-30 | Usado para cultura de células RTgill-W1. |
| Alvejante | Clorox | Diluído a 20% com água milique ou destilada para limpeza de chips ECIS. Qualquer alvejante doméstico é aceitável. | |
| etílico 70% | Para desinfetar superfícies de biohood e quaisquer materiais que estejam sendo colocados em biohood. | ||
| Células branquiais da truta arco-íris (RTgill-W1) | Coleção de Cultura de Tecidos American Type www.atcc.org | CRL-2523 | Células cultivadas e usadas para biossensor (biochips de semeadura). |
| Suplemento GlutaMAX-1, 200 | mM Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Armazene em temperatura ambiente. Ingrediente para meios de cultura de células L-15 completos (1%). |
| Estoque Penn/Strep 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Loja @ -20 °C. Descongele @ temperatura ambiente antes de usar. Ingrediente para meios de cultura de células L-15 completos (1%). |
| Tubulação BPT Farmacêutica | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Corte em seções de 27 mm e autoclavado. Usado para semear biochips com células e como um circuito fechado entre as mudanças de mídia. |
| Conexões luer de policarbonato para conjuntos de tubos Pharmed | Value Plastics | MTLS210-9 | Fixado a cada extremidade do tubo Pharmed cortado para inserção em bichips. |
| Seringas de 20 ml, ponta deslizante | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Usado para injeção de suspensão de células para semeadura de chips ECIS, bem como para alimentação de chips. |
| Microvials de polipropileno com tampa de pressão de 0,1 dram | Garrafas Frascos e Tubos, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Usado para armazenar alíquotas de 60 mg de meio em pó L-15ex. |
| 60 mil Lexan fluídico ECIS biochips | Nanohmics, Inc. | Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. As células RTgill-W1 serão injetadas nos biochips e os chips semeados serão colocados no leitor ECIS para teste. | |
| Caixa de Instrumentos de Plástico Autoclavável 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" | Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Usado para armazenar o seguinte; plugues autoclavados, biochips que foram limpos, biochips semeados. |
| Bolsas de esterilização de selagem térmica de papel, 7 ½ ” x 13" | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Usado para autoclavagem de tubos, conexões e plugues. |
| Dispensador de pó automatizado Quantos | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Dispensação automatizada de alíquotas de 60 mg de L-15ex em pó em frascos de 0,1 dram. |
| Leitor ECIS | Nanohmics, Inc. | Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. O biochip semeado é inserido no leitor para a realização de testes de toxicidade da água. | |
| 3 x 5 sacos reutilizáveis de polipropileno metalizado de 2,5 mil | Uline www.uline.com | S-16893 | Embalagem e armazenamento de biochips semeados e frascos de mídia L-15ex em pó. |
| Leatherman squirt ps4 | Amazon | Usado para abrir frascos de mídia em pó. | |
| 1 g de pacotes de dessecante de gel de sílica | Uline www.uline.com | S-3902 | Coloque em sacos de polipropileno com frascos de mídia em pó L-15ex para evitar que o pó absorva umidade. |
| Frascos estéreis de 250 ou 500 ml Nalgene | Fisher Scientific www.fishersci.com | 09-740-25C ou E | Hold cell suspensões para semear chips ECIS em biohood. |
| Plugues para biochips | Nanohmics, Inc. | Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. Usado para selar portas em biochips antes do armazenamento a 6 °C. | |
| Drenos para biochips ECIS | Nanohmics, Inc. | Feito sob medida pela Nanohmics, Inc. Colocado em 2 portas internas em biochips antes da inserção no leitor ECIS. Permite que o excesso de mídia seja drenado dos canais durante as injeções de teste. | |
| Hemocitômetro | Fisher Scientific www.fishersci.com | S17040 | Necessário para contar células antes de ajustar a suspensão celular para injeção em biochips. |
| Microscópio de campo claro com objetiva de 10X | Leitz Labovert | Qualquer microscópio de campo claro é aceitável. | |
| de segurança biológica classe II | Qualquer cabine de segurança biológica classe II onde a cultura de células possa ser realizada em condições estéreis é aceitável. | ||
| Tubos de microcentrífuga, 0,6 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 02-681-311 | Contém 1 ml de suspensão celular antes da contagem das células. |
| Seringas vermelhas deslizantes de 10 cc | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Retira 9 ml de amostra de água de teste e é usada para injetar a amostra no biochip. |
| Seringas azuis deslizantes de 10 cc | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Retira 9 ml de amostra de água de controle e é usada para injetar a amostra no biochip. |
| ½ oz. frasco de plástico transparente para animais de estimação com tampas brancas com nervuras SKS | Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Frascos de amostra usados para misturar o pó L-15ex e 10 ml de amostra de água para teste. |
| Tubos de centrífuga cônicos estéreis de polipropileno de 50 ml | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Usado para conter alíquotas de 40 ml de 10 μ g/ml de fibronectina a -20 °C. |
| Teste de Detecção de Inibidores de Acetilcolinesterase NIDS ACE | ANP Technologies, Inc. www.anptinc.com | Sensor ACE-400 | projetado para a detecção rápida de pesticidas em água potável |
Referências
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Reimpressões e permissões
