Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through

Resumo

Um protocolo rápido para digestão proteolítica com um microrreator tríptico de fluxo interno acoplado a um espectrômetro de massa de ionização por eletrospray (ESI) é apresentado. A fabricação do microrreator, a configuração experimental e o processo de aquisição de dados são descritos.

Resumo

A grande maioria de espectrometria de massa (MS) baseados em métodos de análise de proteínas envolvem um passo de digestão enzimática antes da detecção, tipicamente com tripsina. Este passo é necessário para a geração de péptidos de baixo peso molecular, geralmente com PM <3000-4000 Da, que caem dentro do intervalo de varrimento efectivo de instrumentação de espectrometria de massa. protocolos convencionais envolvem O / N digestão enzimática a 37 ºC. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de uma variedade de estratégias, que envolvem normalmente a utilização de um micro-reactor com enzimas imobilizadas ou de uma variedade de processos físicos complementares que reduzem o tempo necessário para a digestão proteolítica de alguns minutos (por exemplo, microondas ou alta pressão). Neste trabalho, nós descrevemos um método simples e de baixo custo que pode ser implementado em qualquer laboratório para a realização rápida digestão enzimática de uma proteína. O (ou mistura de proteína) proteína é adsorvida em alta perf de fase inversa C18-ligadoormance partículas de sílica com cromatograf ia líquida (HPLC), pré-carregados numa coluna capilar, e com tripsina em tampão aquoso é administrada por perfusão durante as partículas para um curto período de tempo. Para permitir a detecção em linha de MS, os peptídeos trípticos são eluídas com um sistema de solvente com o aumento do teor orgânico directamente na fonte de iões de MS. Esta abordagem evita a utilização de partículas de alto preço enzima imobilizada e não necessitam de qualquer ajuda para completar o processo. a digestão de proteínas e a análise da amostra completa pode ser realizada em menos de 3 minutos ~ e ~ 30 min, respectivamente.

Introdução

A identificação e caracterização das proteínas purificadas é frequentemente conseguido através de técnicas de MS. A proteína é digerido com uma enzima e os seus péptidos são ainda analisados ​​por MS utilizando uma configuração experimental simples de infusão. A digestão proteolítica é necessário para a geração de fragmentos peptídicos pequenos que caem na gama de massa da maioria dos analisadores útil MS, e que pode ser facilmente fragmentado por baixo de energia de colisão de dissociação induzida para gerar informação sobre a sequência de aminoácidos. Para as proteínas isoladas ou misturas de proteínas simples, não há mais necessidade de separação cromatográfica dos péptidos antes da detecção MS. Uma mistura de péptidos 25-50 podem ser facilmente analisadas por infusão da amostra com uma bomba de seringa directamente na fonte de iões de MS.

O espectrómetro de massa pode realizar a análise e confirmar a sequência de uma proteína dentro de um curto espaço de tempo. Com os métodos modernos de aquisição de dados, este processo pode ser realizado Within alguns minutos ou mesmo segundos. O fator limitante para completar todo o processo em uma escala de tempo curta é a etapa de digestão proteolítica. Normalmente, isto é realizado ao longo de algumas horas (ou O / N), em solução, a 37 ºC, utilizando substrato: rácios de enzimas de (50-100): 1. Para reduzir o tempo de digestão enzimática para minutos ou segundos, microrreactores enzima imobilizada, sob a forma de reactores de microfluidos ou cartuchos disponíveis comercialmente, foram descritos. ^06/01 Tipicamente, a enzima é imobilizada por ligação covalente, não-covalente / adsorção física, complexo formação ou encapsulamento, ^3,6 a eficiência melhorada do processo enzimático a ser activada pela grande superfície para volume e rácios de enzima e substrato. As vantagens adicionais de reactores imobilizadas incluem a redução da autólise e interferência do enzima na análise de MS, melhorou a estabilidade da enzima e reutilização. Uma variedade de abordagens, utilizando vidro ou dispositivos microfabricados poliméricos têm sido descritos,usando enzimas imobilizadas em esferas magnéticas por interações antígeno-anticorpo, ^7,8 aprisionados em redes de nanopartículas de ouro, ⁹ encapsulado em titânia de alumina sol-gel ¹⁰ e nanozeolites, ¹¹ ou capturados através de Ni-NTA ou His-Tag formação do complexo. ⁶ Alternativamente , capilares tubulares abertas com enzimas imobilizadas têm sido desenvolvidos, assim. ¹² além disso, a clivagem proteolítica aumentada foi demonstrada utilizando a irradiação de microondas controlado ¹³ ou assistida por pressão ou ciclagem tecnologia pressão (PCT) para reduzir os tempos de reacção a 30-120 min. ¹⁴

Apesar das várias vantagens de reactores de enzimas imobilizadas, os custos de cartuchos comerciais é alta, a disponibilidade de dispositivos de microfluidos para uso de rotina é limitado, e o uso de tecnologias de micro-ondas ou de PCT resultados em necessidade de instrumentação adicional. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método que circumvents estas desvantagens, e que pode ser facilmente implementado em cada laboratório para capacitar investigadores com uma abordagem simples e eficaz para a realização de clivagem enzimática das proteínas na preparação para análise por MS em poucos minutos. A abordagem baseia-se na utilização de, C18-partículas hidrofóbicas, que são pré-carregados em um capilar ou dispositivo de microfluidos, e a adsorção da proteína (s) de interesse sobre essas partículas, seguido por digestão enzimática durante a infusão da enzima sobre o de leito fixo e de proteína (s) capturado. Nesta abordagem, o substrato é imobilizada através de interacções não covalentes, e a enzima é infundido através da proteína imobilizada. A eficiência proteolítica digestão é aumentada pelas grandes áreas de superfície de partícula que expõem a proteína para o processamento enzimático, as distâncias e os tempos de difusão de e para a superfície de partículas reduzido, uma melhor transferência de massa, sem ligação covalente que pode afectar a actividade da enzima, a capacidade Avaliado com a rapideze combinações de diferentes enzimas, descartável, e a multiplexação, se o processo é executado num formato de microfluidos. Esta abordagem é demonstrada com o uso de uma mistura de proteínas padrão e tripsina a enzima mais comumente utilizado para a digestão proteolítica antes da detecção ESI-MS. O espectrómetro de massa utilizados para a detecção neste estudo foi um instrumento linear armadilha de quadrupolo (LTQ).

Protocolo

1. Preparação do capilar microrreactor

1. Cortar o diâmetro interno 100 um (ID) x 360 uM exterior capilar diâmetro (DO) a um comprimento de 7-8 cm, e a 20 uM ID x 90 um OD capilar de 3-5 cm com o cutelo de capilar em vidro; verificar sob o microscópio que ambas as extremidades capilares têm um corte limpo, em linha reta, sem quaisquer rebarbas salientes.
2. Inserir a 20 um x 90 um ID OD capilar para um final de 100 uM ID x 360 uM OD capilar, para um comprimento de ~ 6 mm; em caso de necessidade, observar esta operação sob um microscópio.
3. Aplique uma pequena gota de E6000 cola em torno da junção dos 90 mm OD / 100 capilares mm ID com o fim de um Q-tip, e deixe a cola cura O / N à temperatura ambiente.
4. Cortar a 20 um x 90 um ID OD capilar inserido com um comprimento de ~ 10-15 mm; este vai ser o emissor de ionização por electropulverização.
5. Pré-cortar a 1/32 "OD PEEK, 1/16" PEEK OD e 1/16 "banheira de PTFE ODing em pedaços de 4-5 cm de comprimento; estas serão as mangas utilizados em uniões capilares para fornecer uma conexão livre de vazamento.
6. Ligar a extremidade oposta da 100 mm Dl x 360 uM OD capilar para uma união PEEK; usar uma luva 1/32 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
7. Inserir / apertar uma peça de ~ 5 cm de comprimento tubagem de PTFE 1/16 "para a extremidade oposta da união.
8. Pesar ~ 4 mg de C18 (5 uM), em partículas de um pré-limpos / secos frasco de 2 ml de vidro; adicionar 0,5 ml de isopropanol, fechar o recipiente e dispersar a pasta no banho ultrasonicator.
9. Retirar com uma seringa de 250 ul a cerca de 200 pasta ul, inserir a agulha da seringa no "tubo de 1/16 PTFE da união PEEK, e dispensar lentamente a pasta para o 100 mm ID x 360 mm OD capilar; observar ao microscópio como a capilar enche de partículas até um comprimento de 2-3 mm de embalagem é obtida, o que irá ser o micro-reactor (Figura 1) a 20 μ.m ID capilar retém as partículas na micro-reactor por meio de um efeito de distorção. ¹⁵
10. Lavar o microrreactor com ~ 50 ul de solução de _H2O / _CH3CN 50:50 v / v, e em seguida, com solução de ~ 50 ul de _H2O / _CH3CN 98: 2 v / v.

2. Preparação das Soluções Amostra

Nota: As operações que envolvam o manuseamento de solventes e ácidos orgânicos e preparação da solução são para ser executadas numa hotte. Usar óculos, luvas e vestuário de protecção.

1. Lavar com _CH3OH e secar alguns frascos de vidro (4 mL) e tubos de polipropileno (15 ml).
2. Preparar 10 ml de uma solução de _H2O / _CH3CN (98: 2 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 9,8 ml _{de H2O} com 200 ul _{de CH3CN;} misture com ultra-sons.
3. Preparar 10 ml de uma solução de _H2O / _CH3CN (50:50 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 5 ml de H _{2 <}/ sub> O com 5 ml CH ₃ CN; misture com ultra-sons.
4. Prepare a 4 ml de uma solução aquosa acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons.
5. Prepare a 4 ml de uma solução orgânica acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons.
6. Pesar 16 mg _de NH ₄ HCO ₃ com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicionar 4 ml de H ₂ O / CH ₃ CN: solução (98 2 v / v) e dispersa-se por ultra-sons; isto resulta em uma solução 50 mM de NH ₄ HCO ₃ (pH ~ 7,8) em tampão aquoso.
7. Pesar 5 mg de uma proteína padrão (por exemplo, albumina de soro bovino, a hemoglobina α / β, citocromo C, anidrase carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc) com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicione 4 ml wate DIR e dispersar por sonicação; Isto normalmente resulta numa solução de elevada concentração de nível uM.
8. Prepare 1 ml de solução de proteína (1-2? M), diluindo a solução de concentração elevada de nível um, com um volume adequado de NH ₄ HCO ₃ (50 mM), tampão aquoso; misture com ultra-sons.
9. Preparar a solução de tripsina (5 ^ M) por dissolução de 20 ug de tripsina de grau de sequenciação-em 170 mL _de NH ₄ HCO ₃ (50 mM), tampão aquoso; dispersar por sonicação.

3. Configuração Experimental

Nota: O sistema LTQ-MS está equipado com uma fonte ESI modificado que inclui uma XYZ-estágio home-construído, que permite a interface do espectrômetro de massa para várias abordagens de entrada da amostra.

1. Desligue o microreator capilar a partir da união PEEK e se conectar à PEEK Tee.
2. Insira fio Pt A ~ 2 cm de comprimento no lado-braço do PEEK T; utilizar uma "manga PEEK 1/32 para fornecer umaconexão e para o isolamento do fio Pt livre de vazamento.
3. Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para a extremidade oposta do PEEK T; usar uma luva 1/32 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
4. Fixe o Tee PEEK na XYZ-stage e posicione o ESI emissor ~ 2 mm de distância da massa capilar de entrada espectrômetro.
5. Ligue o fio de Pt à fonte de alimentação de energia ESI do espectrômetro de massa.
6. Ligar a extremidade oposta do capilar de transferência de amostras para a união de aço inoxidável; usar uma luva 1/16 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
7. Conectar um 4-5 cm de comprimento "1/16 tubagem de PTFE para a extremidade oposta da união de aço inoxidável e inserir a agulha da seringa de 250 ul na tubagem de PTFE; ligar a bomba e ajustar a taxa de fluxo no valor desejado (por exemplo, 2 ul / min).
8. em tandem entrada parâmetros MS de aquisição de dados para o pacote de software que controla o instrumento de MSd salvar como um arquivo método para pronta a configuração para realizar a análise; para o sistema LTQ-MS, use os parâmetros de análise dependentes seguintes dados: a exclusão dinâmica habilitado para 180 segundos com largura de massa exclusão ± 1,5 m / z; uma MS varredura seguido por um zoom e MS ² varreduras em 5 melhores picos mais intensos, aumentar a largura de digitalização ± 5 m / z; dissociação induzida por colisão (CID) parâmetros definidos no isolamento largura de 3 m / z, energia de colisão normalizada de 35%, a activação Q 0.25, e tempo de activação 30 ms.

4. Setup Microfluidic

1. Preparar um dispositivo de microfluidos de vidro ou substratos poliméricos; ^16-18 a disposição do dispositivo é fornecida na Figura 2A, que consiste de um micro-reactor (1) (0,13 mm Comprimento largura x 2 mm x 50 mm de profundidade) ligada a uma entrada (2 ), saída (3) e uma porta lateral (4); os canais comunicantes para manipulações são fluídicos ~110 uM de largura e ~ 50 mm de profundidade; uma estrutura de múltiplos canais (5), que consiste em ~ 1,5-2 uM de profundidade x 10 m de largura x 100 mm de comprimento colocados microcanais de 25 um para além, irá actuar como um filtro para a retenção das partículas no microrreactor.
2. Ative as conexões de fluido de entrega para o chip por meio de colagem conectores especializados para as portas de entrada, ou através da elaboração de um suporte polimérico que acomoda acessórios para fornecimento de fluido (Figura 2B). ¹⁶
3. Prepara-se uma pasta fluida de partículas de C18 (5 uM) tal como descrito no passo 1.8; fornecer a pasta para o micro-reactor com uma seringa usando 1/16 "tubagem de PTFE ligado à porta lateral do chip (4); selar a porta após o carregamento de partícula com cola epóxi e cura durante 1 hora num forno a 90 ° C ^16.
4. Inserir um capilar (20 uM ID x 90 um comprimento OD x 10 mm) no orifício de saída, selar com cola E6000, e deixar cura S / N; isso vai se tornar o emissor ESI ( 6).
5. Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para o orifício de entrada do chip (2); ligar a extremidade oposta do tubo capilar a uma seringa de 250 ul e a bomba de seringa, tal como descrito em 3,6-3,7.
6. Coloque um leve conector PEEK T na linha de transferência de amostras imediatamente antes da abertura de entrada (2) e inserir um fio de Pt sobre o lado do braço do T, como descrito no ponto 3.2; este será o eletrodo ESI.
7. Fixar o dispositivo de microfluidos na fase XYZ com o emissor ESI posicionado ~ 2 mm de distância do capilar massa espectrómetro de entrada; preparar a MS para análise tal como descrito em 3.8.

5. Amostra de carregar, digestão proteolítica e eluição por análise por MS

Nota: Todos os passos de transferência de solução / amostra são realizadas com o auxílio de uma bomba de seringa e deveria permitir a alguns minutos adicionais para completar, para compensar os mortos-volumes associados com as linhas de transferência de e para o micro-reactor; o tempo necessário dependerá das taxas de fluxo envolvidos.

1. Lavar o microrreactor e prepará-la para a análise por infusão de uma solução aquosa de NH ₄ HCO ₃ (50 mM) em H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
2. Carregar a amostra de proteína (1 uM) no micro-reactor por infusão da solução de amostra a 2 mL / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
3. Infundir a solução de tripsina (5 uM) sobre a proteína adsorvida no micro reactor em 2 ul / min durante 1-3 min.
4. Extingue-se o processo de digestão proteolítica, por lavagem do micro-reactor com uma solução aquosa acidificada de TFA (0,01% v / v) em H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
5. Iniciar eluindo a digestão de proteínas a partir do micro-reactor por infusão de uma solução orgânica acidificada de TFA (0,01%v / v) em _H2O / _CH3CN (50:50 v / v) em 300 nl / min.
6. Ligue o processo de aquisição de dados de MS e a voltagem ESI (~ 2000 V); adquirir dados de MS, utilizando os parâmetros de aquisição de dados fornecidos no passo 3.8; observar a eluição dos péptidos trípticos.

6. Processamento de Dados

1. Processar os dados em tandem MS com um motor de busca compatível com o formato de dados MS-primas.
   1. Processar os arquivos raw LTQ-MS, utilizando um organismo banco de dados específico de proteína minimamente redundantes; fazer o upload dos dados brutos no motor de busca, definir as tolerâncias de massa pai e de iões fragmento a 2 e 1 Da, respectivamente, e usar apenas fragmentos totalmente trípticos com até dois perderam clivagens para a busca; não permitem modificações pós-translacionais; definir os de média e alta confiança falsos taxas de detecção (FDR) para 1% e 3%, respectivamente, e não permitem modificações pós-translacionais.
2. Filtrar os dados para selecionar apenas de alta confiançapéptido corresponde às proteínas na base de dados; avaliar os resultados de proteína e de nível de péptido.

Resultados

Um resultado representativo de um processo de digestão proteolítica realizado simultaneamente com uma mistura de proteínas, com os micro-reactores acima descritos (Figuras 1 ou 2), é fornecida na Tabela 1. A tabela compreende as sequências de péptidos únicas que identificam uma proteína em particular, a cruz o resultado de correlação (Xcorr) (isto é, uma pontuação que caracteriza a qualidade do jogo experimental-a-teórica para o espectro de mass...

Discussão

O microreator descrito neste trabalho fornece um fácil de implementar configuração experimental para a realização de digestão enzimática de proteínas para permitir a análise MS e identificação em menos de 30 min. As vantagens deste sistema, em comparação com métodos convencionais, incluem a simplicidade, a velocidade e baixo consumo de reagentes e baixo custo. Em particular, não há necessidade de caros esferas de tripsina imobilizada e os cartuchos. A preparação do microreator capilar é simples (Figura 1A),

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Armadilha de íons ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	O espectrômetro de massa LTQ é usado para adquirir dados MS em tandem
Estágio XYZ Newport		Múltiplas peças	O estágio XYZ construído em casa é usado para adaptar a fonte comercial LTQ nano-ESI para receber informações de vários sistemas de entrega de amostras
Microscópio estéreo	Óptica Edmund	G81-278	O microscópio é usado para observar o processo de embalagem do microrreator
Balança analítica/Metler	VWR	46600-204	A balança é utilizada para pesar as amostras de proteínas
Banho ultrassónico/Branson	VWR	33995-540	O banho sónico é utilizado para misturar/homogeneizar as amostras e dispersar a pasta de partículas C18
Bomba de seringa 22	Harvard Apparatus	552222	A microbomba é usada para carregar, enxaguar e eluir a amostra e a enzima no e do microrreator capilar embalado
Sistema de água ultrapura Milli-Q	EMD Millipore	ZD5311595	O sistema de água MilliQ é usado para preparar água DI purificada
Pipettor/Eppendorf (1,000  µ l)	VWR	53513-410	O pipetador é utilizado para medir pequenos volumes de soluções de amostra
Pipettor/Eppendorf (100  µ l)	VWR	53513-406	O pipetador é utilizado para medir pequenos volumes de soluções de amostra
Pipettor/Eppendorf (10  µ l)	VWR	53513-402	O pipetador é utilizado para medir pequenos volumes de soluções de amostra
Capilar de sílica fundida (100 µ m ID x 360 µ m OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	Este capilar é usado para a fabricação do microrreator
Capilar de sílica fundida (20  µ m ID x 100 µ m OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	Este capilar é usado para a fabricação do emissor ESI
Capilar de sílica fundida (50  µ m ID x 360 µ m OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	Este capilar é usado para transferir as amostras e o eluente da bomba de seringa para o microrreator capilar
Cutelo capilar	de vidro Supelco	23740-U	Esta é uma ferramenta para cortar capilares de sílica fundida no comprimento desejado
Cola	Produtos Ecléticos	E6000 Artesanato	Esta cola é usada para fixar o emissor ESI no microrreator capilar ou no chip microfluídico
Cola epóxi	Epo-Tek	353NDT	Esta cola é usada para selar o orifício de entrada microfluídico através do qual as partículas C18 são carregadas
Partículas C18 de fase reversa (5  µ m)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	Estas são partículas C18 nas quais as proteínas são adsorvidas; as partículas foram extraídas de um 4  mm x 20 cm coluna C18 LC da Agilent
Seringa/vidro (250 µ l)	Hamilton	81130-1725RN	As seringas de vidro são usadas para carregar a pasta de partículas C18 no microrreator capilar e para entregar a amostra e os eluentes ao microrreator
União PEEK redutora interna (1/16 "a 1/32")	Valco	ZRU1.5FPK	Esta união é usada para conectar o 250 µ l seringa para o microrreator para carregar o 5 µ Pasta de partículas m
União de aço inoxidável (1/16")	Valco	ZU1XC	A união de aço inoxidável é usada para conectar a agulha da seringa de vidro ao conector em T PEEK de microvolume capilar de infusão
(1/32")	Valco	MT.5XCPK	O T Peek é usado para conectar o capilar de transferência de amostras ao microrreator capilar; em seu braço lateral, permite a inserção do conector em T do fio Pt
(peso leve)	Valco	C-NTXFPK	Este conector em T é usado para aplicar tensão ESI ao chip microfluídico através do fio Pt da linha de transferência de amostra
(0,404 mm)	VWR	66260-126	O fio Pt fornece conexão elétrica para geração de ESI e é conectado à fonte de alimentação ESI do espectrômetro de massa
, tubulação de PTFE (1/16" OD)	Valco	TTF115-10FT	O tubo de Teflon é usado para permitir uma conexão hermética entre a agulha da seringa e a união de aço inoxidável
Tubulação PEEK (0,015 " ID x 1/16" OD)	Upchurch Scientific	1565	O tubo Peek é usado como uma luva para permitir uma conexão hermética entre a união de aço inoxidável e o 50  µ m Tubo PEEK capilar de transferência ID
(0,015" ID x 1/32" OD)	Valco	TPK.515-25	O tubo Peek é usado como uma luva para permitir uma conexão sem vazamentos entre os capilares de sílica fundida e o Peek Tee
Cortador de tubos de polímero de corte limpo	Valco	JR-797	Este cortador é usado para pré-cortar o 1/16" e 1/32' Tubo de polímero Peek que é usado como manga para conexões sem vazamentos em peças de ~4-5 cm de comprimento
Frasco âmbar (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	Os frascos são usados para preparar soluções de amostra e a pasta de partículas C18
Frasco âmbar (4 ml)	VWR	66011-948	Os frascos são usados para preparar soluções de amostra
Tubo de polipropileno (15  ml)	Fisher	12-565-286D	Os frascos são usados para preparar soluções tampão
Cilindro (100 ml)	VWR	24710-463	O cilindro é usado para medir volumes de solvente
Cilindro (10 ml)	VWR	24710-441	O cilindro é usado para medir volumes de solvente
Ponteiras de pipeta (1.000 µ l)	VWR	83007-386	As ponteiras de pipeta são utilizadas para medir pequenos volumes de soluções de amostra
Ponteiras de pipeta (100 µ l)	VWR	53503-781	As ponteiras de pipeta são utilizadas para medir pequenos volumes de soluções de amostra
Ponteiras de pipeta (10 µ l)	VWR	53511-681	As ponteiras da pipeta são utilizadas para medir pequenos volumes de soluções de amostra
Substratos de vidro	Nanofilme	B270 coroa branca, 3" x 3"	Estes são substratos de vidro para fabricação de microchips
Encaixe de porca macho (1/16")	Upchurch	P203X	Este encaixe é usado para conectar capilares de transferência ao chip microfluídico
Montagem de nanoport	Upchurch	N-122H	Este encaixe é usado para conectar capilares de transferência ao chip microfluídico
Padrões de proteína	Sigma	Múltiplo #
Acetonitrila, grau HPLC	Fisher	A955
Metanol, grau	HPLCFisher	A452
Isopropanol, grau HPLC	Sigma	650447
Ácido trifluoroacético	Sigma	302031
bicarbonato de amônio	Aldrich	A6141
Tripsina, grau de sequenciamento	Promega	V5111