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Artigo de método

A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal

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DOI:

10.3791/53576

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31 de março de 2016

 ,  ,  ,  , 
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

Neste artigo

Resumo

Este procedimento executa longa duração in vivo gravações intracelulares de neurônios individuais durante os estados cerebrais fisiologicamente relevantes e após a abolição completa das atividades elétricas em curso, resultando em um estado cerebral isoelétrico. As constantes fisiológicas do animal são cuidadosamente monitorizado durante a transição para o estado de coma artificial.

Resumo

A informação de processo maneira neurónios depende tanto nas suas propriedades intrínsecas de membrana e sobre a dinâmica da rede sináptica aferente. Em particular, a actividade de rede endogenamente-gerado, que varia fortemente em função do estado de vigilância, modula significativamente neuronal computação. Para investigar como as diferentes dinâmicas cerebrais espontâneos impacto propriedades integrativas dos neurônios individuais, desenvolvemos uma nova estratégia experimental no rato que consiste na supressão in vivo toda a atividade cerebral por meio de uma injeção sistêmica de uma alta dose de pentobarbital de sódio. actividades corticais, continuamente monitorizados pelo eletrocorticograma combinada (ECoG) e gravações intracelulares são progressivamente retardado, conduzindo a um perfil constante isoeléctrica. Este estado cerebral extrema, colocando o rato em uma em coma profundo, foi cuidadosamente monitorizada através da medição das constantes fisiológicas do animal ao longo das experiências. r intracelularecordings nos permitiu caracterizar e comparar as propriedades de integração do mesmo neurônio incorporado dinâmica corticais fisiologicamente relevantes, tais como as verificadas no ciclo vigília-sono, e quando o cérebro estava completamente silenciosa.

Introdução

Na ausência de quaisquer estímulos ambientais ou tarefas comportamentais, o "repouso" cérebro gera um fluxo contínuo de actividade eléctrica que pode ser gravada a partir do couro cabeludo, como electroencefalográficas ondas (EEG). O correlato intracelular desta actividade cerebral endógena é caracterizado por as flutuações de tensão de membrana fundo (também conhecidos como "ruído sináptica"), que são compostas por uma combinação de potenciais sinápticos excitatórios e inibidores que reflectem a actividade em curso de redes aferentes 1,2. Esta atividade espontânea varia em frequência e amplitude com os diferentes estados de vigilância. Elucidar o impacto da atividade de rede na excitabilidade e capacidade de resposta dos neurônios individuais é um dos grandes desafios da neurociência 3,4.

Muitos estudos experimentais e computacionais têm explorado o impacto funcional da atividade sináptica em curso sobre a propertie integrativas dos neurônios. No entanto, o papel dos diferentes parâmetros neuronais afectadas pelo ruído de fundo sináptica permanece elusiva. Por exemplo, o nível médio de despolarização da membrana foi encontrada positivamente ou negativamente 5,6 7-9 correlacionada com a capacidade de entradas sensoriais para desencadear potenciais de acção. Além disso, ao passo que algumas investigações sugerem que as flutuações do potencial de membrana, o que resulta de uma corrente que varia continuamente de entradas sinápticas aferentes, afectar fortemente a capacidade de resposta de neurónios individuais, modulando o ganho da sua relação de entrada-saída de 3,10-13, indicam que outros mudanças na condutância da membrana entrada mediadas por inibição de manobra são suficientes para modular o ganho neuronais, independentemente da magnitude das flutuações de membrana 14,15. Finalmente, estudos recentes realizados em animais acordados sublinhou como o processamento da informação sensorial no único neurônio depende criticamente sobre o estado de vigilância and a corrente 16,17 demanda comportamental.

Uma estratégia simples para elucidar o papel funcional de um determinado processo em um sistema altamente interligada é determinar como a sua ausência especificamente altera o funcionamento do sistema. Este método tem sido amplamente utilizado em pesquisa neuroscience, por exemplo, utilizando as lesões experimentais ou inactivação de diferentes áreas do cérebro, 18-21 ou bloqueio farmacológico de canais iónicos específicos 22,23. Notavelmente, ela foi aplicada in vivo para desvendar como funcionais de conectividade e de rede dinâmica afetar computação única célula 24-27. No entanto, até à data manipulações locais destinados para bloquear o disparo de neurônios e / ou perturbar as suas propriedades biofísicas básicos podem ser parcialmente eficazes e estão limitados a volumes relativamente pequenos cerebrais 28.

Para superar essas limitações, desenvolvemos uma nova abordagem experimental em vivo emo rato para comparar as propriedades eletrofisiológicas de neurônios individuais gravados em um determinado estado do cérebro, ou seja, inseridos em uma rede particular dinâmica, aos obtidos após a supressão completa de todo o cérebro atividade sináptica 29. Nas condições de controlo, duas dinâmicas corticais distintos poderiam ser gerados. eletrocorticográfica (ECoG) padrões de sono-like foram induzidas pela injeção de doses moderadas de pentobarbital de sódio. Alternativamente, ondas rápidas ECoG de pequena amplitude comparável à actividade cortical subjacente ao estado de vigília (-vigília como padrão) pode ser produzido por injecção de fentanil. Subsequentemente, enquanto se mantém a mesma ECoG e gravação intracelular, um silenciamento completa da actividade eléctrica do cérebro endógeno foi obtido por injecção sistémica de uma dose elevada de pentobarbital de sódio, caracterizado por ECoG isoeléctrico e actividades intracelulares. Uma vez que a indução de um estado de coma, tais extrema poderiam potencialmente fatal tem consequenCES sobre as funções biológicas, um acompanhamento cuidadoso e contínuo das variáveis ​​fisiológicas era essencial. Portanto, meticulosamente seguido da frequência de batimento cardíaco, a concentração final da expiração de CO 2 (ETCO2), a saturação de O2 (SpO 2) e a temperatura central do rato ao longo das experiências.

Nós avaliamos neurônios individuais propriedades durante estes estados diferentes, utilizando microeléctrodos afiadas, que são particularmente adequados para gravações longas e estáveis ​​in vivo. O processo descrito aqui, pode ser combinada com outras abordagens electrofisiológicos e de imagem e pode ser alargado a outros modelos animais.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as orientações da União Europeia (Directiva 2010/63 / UE) e aprovado pelo Comitê de Ética Charles Darwin em Experimentação Animal. Descrevemos aqui o procedimento que usamos rotineiramente em nosso laboratório, no entanto a maioria dos passos pode ser adaptado para atender às necessidades específicas de cada um.

1. Preparação cirúrgica

Nota: Todos os pontos de incisão e de pressão devem ser repetidamente infiltrados com anestésico local (lidocaína e bupivacaína). O presente procedimento é terminal, se uma preparação asséptica é necessária várias modificações devem ser implementadas.

  1. Anestesiar uma ratazana com pentobarbital de sódio (40 mg / kg) e cetamina (50 mg / kg) em duas injecções intraperitoneais separadas localmente (IP).
  2. Deixe o animal ir sob anestesia geral e repetidamente verificar se um plano cirúrgico de anestesia é alcançado (ausência de reacção aos pés beliscar). Coloque o rato em uma feedback cobertor de aquecimento e inserir uma sonda rectal para manter a temperatura do núcleo de cerca de 37 ° C.
  3. Coloque um cateter na cavidade peritoneal para facilitar a injecção posterior de agentes anestésicos e evitar perfurar órgãos por punções de agulha repetidas 30.
    1. Prenda o cabelo sobre uma pequena (~ 2-3 mm) área acima de uma região localizada dentro do quadrante inferior direito ou esquerdo do estômago.
      Nota: creme depilatório também pode ser usado.
    2. Adicione um 2 - 3 milímetros incisão na pele com uma tesoura afiada ou um bisturi. Usando dissecção romba, remover as camadas de gordura e músculo até a cavidade peritoneal é observado.
    3. Insira cerca de 1 - 2 cm de um pequeno cateter na cavidade e fechar a ferida com cola cirúrgica.
      (. Por exemplo, 2 Francês - correspondente a 0,043 mm de diâmetro interno): Observação O diâmetro e o comprimento total do cateter deve ser mínimo para reduzir os volumes mortos. tubos de poliuretano são mais adequados.
    4. Faça um laço e sutura tele cateter para a pele para prendê-lo no lugar.
  4. Instalar um tubo traqueal para controlar a ventilação durante a respiração artificial.
    1. Como para o passo anterior, se preparar a área de interesse (1 - 2 cm sobre a traqueia direito acima da fúrcula), remover o cabelo e incisão da pele.
    2. Blunt dissecar as primeiras camadas de gordura e músculos, em seguida, passar a glândula salivar de lado e expor a traqueia dissecando cuidadosamente a última camada de músculos.
    3. Remova cuidadosamente os tecidos mais a traqueia e deslizar uma linha abaixo dela usando pequenas pinças. Faça nó de um cirurgião com o fio, mas não apertado ainda.
    4. Faça uma incisão na traqueia de forma transversal entre dois anéis cartilaginosos. sangue cotonete na traqueia se houver.
    5. Inserir um tubo traqueal com o diâmetro adequado e apertar o nó da lista de discussão para fixar o tubo estável. Para estabilidade adicional, o segmento pode ainda estar ligado a um ponto mais alto do tubo da traqueia.
    6. Suture a ferida fechar ou usar grampos cirúrgicos. Evitar cola cirúrgica aqui Se o tubo traqueal se destina a ser reutilizado.
  5. Instalar o animal em um quadro estereotáxico e acompanhar atentamente as seguintes variáveis ​​fisiológicas: ECoG, SpO 2, ETCO 2, freqüência cardíaca (através de um eletrocardiograma, ECG) e da temperatura interna. Monitorar e ajustar essas variáveis ​​para manter uma profundidade adequada da anestesia e estado fisiológico. Especificamente, completar a anestesia com uma dose pequena (10 mg / kg) de pentobarbital de sódio, se necessário.
  6. Aplicar pomada olho em ambos os olhos para evitar a dessecação. Prenda o cabelo sobre o couro cabeludo, faça uma incisão longitudinal (~ 2 cm) e ressecar os tecidos conjuntivos que recobrem do crânio utilizando um bisturi ou uma cureta.
  7. Adicione uma pequena craniotomia (-1,5 mm de diâmetro) através da região de interesse com uma broca de dentista.
    Nota: Aqui, o campo barril do córtex somatossensorial primário é alvo (7 - anterior 8 mm a linha interaural, 4,5- 5,5 mm lateral à linha média 31). Lavar várias vezes para dissipar o calor.
  8. Use uma pinça extra-finas para fazer delicadamente um pequeno orifício na dura. Reservar uma região ~ 0,5 milímetros dentro da trepanação craniana para colocar o eletrodo ECoG (veja o próximo passo). Permanentemente manter o córtex húmido com uma solução de NaCl a 0,9% (ou fluido cérebro-espinhal artificial).
  9. Coloque uma baixa impedância (~ 60 kQ) eléctrodo de prata (o eléctrodo ECoG) sobre a dura-máter, evitando a região cortical não coberto pelas meninges, e colocar o eléctrodo de referência sobre um músculo couro cabeludo por outro lado da cabeça.
  10. Nesta fase (30 min após a injecção de pentobarbital de sódio última), manter a anestesia por injecções repetidas de pentobarbital de sódio (10-15 mg / kg / h) ou de fentanil (3-6 ug / kg / h) através do cateter de IP. O primeiro irá resultar em uma lenta oscilatório, teste padrão ECoG sono-like, enquanto a segunda irá resultar em uma, acordando-like, perfil cortical dessincronizado.
  11. Ajuste o v artificialentilation sistema de modo que a frequência respiratória e o volume são semelhantes aos da respiração espontânea do rato (intervalo normal 70-115 respiração / min 32). Em seguida, ligue a ventilação mecânica ao tubo traqueal e verificar a inflação caixa torácica adequada (em ambos os lados). Se não, ajustar a posição do tubo de ventilação no eixo traqueal. Se necessário, aspirar a secreção presente na traqueia com um catéter ligado a uma seringa ou uma bomba de vácuo.
  12. Se todas as variáveis ​​fisiológicas 32-35 e ECoG 29,36 reflectem padrões de um plano cirúrgico de anestesia estável, fazer uma injecção intramuscular de trietiodeto galamina em cada perna para paralisar o rato, 40 mg / kg para a primeira injecção e em seguida 20 mg / kg , a cada 2 horas 19,29,36,50.

2. As gravações intracelulares

  1. Puxe uma micropipeta de vidro (sharp microeletrodos) com um ~ 0,2 m de ponta, como a resistência varia between 50 e 80 mohms uma vez preenchido com 2 M de acetato de potássio (KAc).
  2. Coloque a pipeta num suporte específico com uma prata / prata-cloreto de fio (Ag / AgCl) para ligar a solução da pipeta para um amplificador intracelular (via uma cabeça de fase). O titular deve ser anexado a um micromanipulador. Coloque um eletrodo de referência Ag / AgCl nos músculos do pescoço do rato.
  3. Lentamente inserir a pipeta no cérebro para baixo para a região de interesse e verificar a sua resistência através da monitorização da tensão cai, em resposta aos passos de corrente. Use o zumbido (ou zap) botão do amplificador para limpar a pipeta se necessário.
  4. Use cotonetes ou triângulos de absorção sintéticos para secar a craniotomia (cuidado para não tocar no ECoG ou eletrodos intracelulares) antes cobrindo-o com elastômero de silicone ou 4% de agarose para reduzir os movimentos cerebrais.
  5. Abaixe a pipeta em 1 - 2 mm etapas até sua resistência aumenta quando se aproxima de uma célula. Em seguida, use a função de zumbido do amplificador para Penetrate no neurônio.

3. induzir o estado Isoeléctrico

  1. Execute o protocolo experimental apropriado (por exemplo, correntes disparando respostas a injetados no meio intracelular, relações corrente-tensão, respostas estímulos sensoriais), nesta fase, enquanto monitora simultaneamente o potencial de membrana do neurônio, o ECoG e as variáveis ​​fisiológicas.
  2. Certifique-se de que o eléctrodo intracelular é estável na célula através da análise da estabilidade de ambos o potencial de membrana e a acção propriedades potenciais ao longo da sessão de gravação. Se não, não vá para a próxima etapa e esperar até que a gravação se torne estável novamente ou procurar outro neurônio.
  3. Injectar uma dose elevada, mas de infra-letal de pentobarbital de sódio (~ 90 mg / kg, pode ser tão baixa quanto 35 mg / kg, a partir da condição inicial de pentobarbital e até 155 mg / kg, a partir da condição inicial de fentanilo) através da linha PI.
    Nota: Dentro de 15 - 20 min do intracelular e ECoG waveforms deve desacelerar com silêncios elétricos intermitentes para chegar transitoriamente a chamada "explosão de supressão de" perfil de 37,38, que cai progressivamente para um estado isoelétrico completa. Espera-se que a freqüência cardíaca diminui significativamente baixo (por ~ 10 - 20%), mas a SpO2 e ETCO2 deve permanecer relativamente estável.
  4. Se o estado isoeléctrico não é atingido, injectar uma pequena quantidade de pentobarbital de sódio (~ 10% da dose passo 3.1). Aguarde 15 minutos antes de adicionar mais anestésico se o estado isoelétrico ainda não é alcançado.
  5. Repita o protocolo experimental para comparar o impacto da dinâmica de rede em propriedades integrativas do neurônio gravado.
    Nota: Após a cessação de injeções anestésicas, a atividade elétrica do cérebro deve se recuperar totalmente dentro de 3 a 4 horas.
  6. No final da experiência, injectar uma dose letal de pentobarbital de sódio (200 mg / kg, IP) para eutanásia do rato.

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Resultados

Indução e manutenção de um estado cerebral isoelétrico é uma delicada no procedimento experimental vivo. Tem-se provado ser uma ferramenta poderosa para estudar directamente o impacto da actividade de rede cortical na excitabilidade neuronal e função de transferência 29. A Figura 1 mostra a monitorização de múltiplos parâmetros, incluindo ECoG e constantes vitais, do estado fisiológico do animal antes (Figura 1A ) e depois

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Discussão

Descrevemos aqui um novo método para suprimir a atividade elétrica cerebral espontânea vivo, tanto da rede e níveis celulares. Este procedimento leva a um estado cerebral extremo, conhecido como comatoso isoelétrico 41. De um ponto de vista clínico, uma inactividade tais electrocerebral é a anormalidade mais grave que pode ser visto no EEG. É, sobretudo, associado a um coma irreversível, com todos os pacientes morrendo ou continuadas em um estado vegetativo persistente 42, mas pod...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fondation de France, o Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale, o Curie Universidade Pierre & Marie e do programa «Investissements d'avenir 'ANR-10-IAIHU-06.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pentobarbital Centravet de SódioPentobarbital
Cetamina 500MerialImalgè ne 500
Fentanil Janssen-CilagFentanil
XilocaínaCentravetXilovet
Trietiodeto de gallaminaSigmaG8134
Amplificador ECoGAMAmplificador AC, Modelo 1700
Amplificador intracelularMolecular DevicesAxoclamp 900A
Interface de aquisição de dadosCambridge Electronic DesignPotência CED 1401-3 
Software de análise de dadosCambridge Electronic DesignSpike2 versão 7
micromanipuladorScientificaIVM-3000
Extrator de capilaresNarishigePE-2
Capilares de vidro borossilicatoHarvard ApparatusGC150F-10
Fio de prata 0,125 mm (gravação intracelular)WPIAGT0525
Referência Ag-AgClPhymepE242
Fio de prata 0,25 mm (gravação ECoG)WPIAGT1025
Sistema de respiração artificialMinerveAlpha Lab
Monitoramento de parâmetros fisiológicosDigicareLifeWindow Lite
Manta de aquecimentoHarvardApparatus 507215
EstereomicroscópioLeicaM80
TesouraFST15005-08
Fórceps Dumont #5FST11295-10
Fórceps Dumont #5SFFST11252-00
Cateter IP de poliuretano - 0,43x0,69 mm   InstechBTPU-027
Elastômero de siliconeWPIKWIK-CAST
Broca odontológicaNSKY1001151 e P496
Cola cirúrgica3Mvetbond
Sistemas

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A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal
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