Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Resumo

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Resumo

Genoma de edição de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) fornece uma plataforma controlada geneticamente e clinicamente relevante do que para entender o desenvolvimento humano e investigar a fisiopatologia da doença. Ao empregar nucleases específicas do site (CPFs) para edição genoma, o rápido derivação de novas linhas HPSC abrigando alterações genéticas específicas em um ambiente de outra forma isogênico se torna possível. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS) e agrupados repete regularmente palindr�icas curtas intercaladas (CRISPR) / Cas9 são os CPFs mais comumente usados. Todas estas nucleases funcionar através da introdução de uma pausa de DNA de cadeia dupla em um local especificado, promovendo assim a edição gene preciso em um locus genómico. Edição genoma SSN-meditado explora dois dos mecanismos da célula endógenos de reparo do DNA, final não homóloga juntar (NHEJ) e homologia reparo dirigido (HDR), quer para introduzir inserção / mutações de deleção ou alter o genoma utilizando um modelo de reparação homóloga no local da ruptura de cadeia dupla. Eletroporação de hPSCs é um meio eficiente de transfecção de CPFs e modelos de reparação que incorporam transgenes como repórteres fluorescentes e cassetes de resistência a antibióticos. Após a electroporação, é possível isolar apenas os hPSCs que incorporaram a construção de reparação por selecção de resistência a antibióticos. Mecanicamente separar colónias HPSC e confirmando a integração apropriada no local alvo através de genotipagem permite o isolamento de linhas celulares corretamente alvejadas e geneticamente homogéneos. A validade do presente protocolo é demonstrado aqui, utilizando todas as três plataformas SSN para incorporar EGFP e uma resistência puromicina construir no AAVS1 seguro lócus porto em células-tronco pluripotentes humanas.

Introdução

Tecnologias de edição genoma estão evoluindo rapidamente em ferramentas padrão para biologia molecular e celular ^1. A engenharia genética de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) é de particular interesse como hPSCs representam uma fonte de auto-renovação das células primárias humanas geneticamente intactas. hPSCs podem ser diferenciadas em vários tipos de células para a modelagem doença ou como uma fonte para terapias de transplante ^2,3. Aqui demonstrada é um protocolo que utiliza três diferentes tipos de nucleases específicas do local (SSNs) em conjunto com os mecanismos de reparação de ADN endógenas alvo para a integração de uma construção repórter no locus AAVS1. Após transfecção de CPFs em hPSCs, demonstramos como isolar populações de células isog�nicas abrigar o repórter.

A capacidade de manipular genomas, especificamente pluripotent stem genomas celulares, usando CPFs não é um fenômeno novo como o utilitário de nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e transcrição activatnucleases efetoras ou semelhantes (TALENS) para a edição gene foi demonstrado há vários anos ^4-10. No entanto, com o advento do S. pyogenes CRISPR / tecnologia Cas9 ^11-13, edição gene tornou-se amplamente acessíveis ^14. Todos os CPFs introduzir uma quebra de DNA de cadeia dupla (DSB) no local de destino especificado ^1,4,5,11 que seja reparado por mecanismos celulares endógenos usando não homóloga de reparação (NHEJ) juntando-final ou homologia dirigido (HDR) ^15. NHEJ é propensa a erros e pode introduzir mutações deslocamento do quadro resultando em perda da função do gene, enquanto HDR permite novos elementos para ser introduzido através da co-transfecção de um modelo de reparação com o SSN. Embora os princípios subjacentes de reparo do DNA que facilitam a edição gene são pensados ​​para ser basicamente o mesmo para cada SSN, algumas diferenças entre as plataformas podem ser observados. De novo projeto de ZFNs permite flexibilidade e otimização nuclease ^16, no entanto, o uso de publicamentebibliotecas de montagem disponíveis e ferramentas de triagem para projetar ZFNs individuais pode ser demorado. Uma vez que o local desejado para segmentação ZFN mediada é determinado, pares ZFN pode ser projetado com a ferramenta on-line ZiFit ^17. Depois de design, ZFNs podem ser modularmente montado através de várias rodadas de clonagem plasmídeo ^18. Como alternativa, há muitos disponíveis comercialmente, pré-validado ZFNs ^19. Nucleases CONTO também podem ser projetados usando ferramentas on-line e componentes publicamente disponíveis ^17,20. Por exemplo, TALENS pode ser rapidamente montada a partir de blocos de cinco repetições conto, através do conjunto FLASH ^{21 ou} usando PCR hierárquica montagem ²² Golden Gate base. Facilidade de projeto SSN e velocidade de construção utilizando CRISPR / Cas9 fez genoma editar uma ferramenta amplamente acessível. O guia curta mediada RNA-targeting de CRISPR / Cas9 também permite a multiplexação de RNAs guia para direcionar vários loci com uma única construção ^14. O designde Cas9 para edição gene requer apenas a identificação de um motivo adjacente protospacer (PAM; um trinucleótido NGG por S. pyrogenes Cas9) proximal em relação ao locus alvo. Através da inserção de um oligonucleótido que corresponde aos 20 pares de bases 5 'do PAM no plasmídeo px330 ^14, a construção pode ser montado em uma etapa de clonagem. Além S. pyogenes Cas9, Cas9 de N. meningitidis (NmCas9) que reconhece um 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) foi mostrado para permitir a eficiente do gene de edição em hPSCs ^23.

Em adição às diferenças na facilidade de concepção SSN, cada plataforma tem propriedades específicas. Por exemplo, ZFNs e TALENS utilizar o domínio de nuclease Fokl, que gera um de quatro nucleótidos 5 'saliência ^{24, enquanto} Cas9 é pensado para gerar na maior parte neutralizar LAP casquilhos. ZFNs, TALENS, e Cas9 diferem nas suas estabilidades de proteína, a taxa de sobre-off no ADN alvo, e o modo de digitalização do ADN, todos os quais Could teoricamente resultar em pequenas diferenças no resultado de edição ^1. Embora mais estudos serão necessários para compreender plenamente as consequências dessas diferenças, nós descrevemos aqui um protocolo que é altamente robusto em todas as três plataformas e pode ser usado para gerar prontamente hPSCs geneticamente modificados.

Independentemente da escolha SSN, eletroporação é um procedimento robusto para transfectar CPFs e modelos de reparação de homologia em hPSCs ^25. O número de colónias sobreviventes após selecção para resistência a antibióticos depende de parâmetros específicas para um local e a estratégia de edição (por exemplo, tamanho de inserção transgénica e o modo de selecção). O protocolo aqui descrito geralmente resulta em cerca de 150-400 colónias derivadas de uma única célula.

No locus AAVS1 utilizando este protocolo de edição de gene tenha sido previamente utilizado para demonstrar a eficácia de SSN ^4,5. O modelo de reparação de AAV-EGFP-CAGGS utiliza um str armadilha de genesategy para conferir resistência puromicina de uma maneira específica local. Resumidamente, o modelo de reparação contém um local aceitador de união a montante da cassete de promotor de resistência puromicina. Após integração correcta no primeiro intrão do gene PPP1R12C no locus AAVS1, a cassete de resistência é expresso a partir do promotor do gene editado. A robustez deste ensaio AAVS1 específica nos permite comparar a eficiência de cada plataforma SSN.

Edição Gene usando CPFs é poderosa, dada a capacidade de perturbar e / ou alterar teoricamente qualquer gene. Aplicando esta estratégia para hPSCs oferece versatilidade como hPSCs pode ser posteriormente diferenciadas em uma infinidade de tipos de células humanas, como neurônios ^26, os hepatócitos ²⁷ e cardiomiócitos ^28. Além disso, a utilização de células estaminais pluripotentes induzidas derivadas de doentes permite a reparação ou a introdução de mutações causadoras de doenças conhecidas num fundo genético específico do paciente ²⁹ , Proporcionando uma plataforma para investigar os mecanismos da doença e terapêutica de teste usando próprias células de um paciente ^30. Em resumo, edição gene em hPSCs é uma abordagem eficiente e versátil para investigar a biologia básica do desenvolvimento humano e da doença ^31.

Protocolo

Os procedimentos descritos neste manuscrito foram revisados ​​e aprovados pela UC Berkeley Stem Cell Research Comitê de Supervisão.

1. Prepare células-tronco para Edição

1. Cresça e cultura de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) em uma placa de 6 poços contendo 2,4 x 10 ⁶ células / placa mitomicina C de ratinho inactivado fibroblasto embrionário (MEF) cultivadas em alimentadores de gelatina ^32. Manter hPSCs em 3 ml de meio de células-tronco embrionárias humanas por poço (mídia hESC) e crescer em um 37 ° C incubadora com _3% de O2 / 5% de CO _2.
   Nota: Para o sucesso deste protocolo, não é necessário manter hPSCs em uma incubadora de baixo teor de oxigênio; no entanto, é importante notar que hPSCs proliferar mais rapidamente num ambiente de elevada _O2, assim os tempos e os números de células deve ser ajustado em conformidade. Deve também ser notado que hPSCs mantidas em baixo teor de oxigénio têm menores taxas de diferenciação espontânea ^33.
   1. To tornar a mídia 500 ml 380 ml hESC combinar DMEM / F12, 75 ml de soro fetal bovino (FBS), 25 ml KnockOut substituição Serum (KSR). Adicionar Glutamina (1 mM de concentração final), 5 ml de 100x para não-aminoácidos essenciais, 100 unidades / mL de Penicilina-estreptomicina (P / S), Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) (4 ng / ml de concentração final), e 2- mercaptoetanol (5,5 uM de concentração final).
2. Mudança de mídia através da remoção de volume inteiro de mídia (3 ml) utilizando uma pipeta de vidro e vácuo. Substitua com a mídia hESC 3 ml morna usando uma pipeta sorológica. Repita mídia mudar todos os dias até hPSCs são aproximadamente 50% confluentes (dia -1).
3. Um dia antes de segmentação (dia -1), altere mídia hESC, eliminando a velha mídia e adição de mídia hESC quentes suplementado com 10 mM Y-27632.
4. Também no dia -1, preparar um a dois de 6 poços ou placas de 10 cm de resistentes células alimentadoras MEF drogas de DR4 camundongos (2,4 × 10 ⁶ células / placa) ^34.
   Nota: Em geral, placas de 6 cavidades são advantageous mais de 10 cm placas, como eles acomodar mais mídia. 6 placas de poços também assegurar que os clones diferentes de diferentes poços são independentes. No entanto, uma placa de 10 cm permitirá colheita mais fácil, de acordo com o microscópio disponíveis para este processo.

2. Edição pluripotentes Células-Tronco

1. Preparar soluções de transfecção por pipetagem de 5 ug cada de ZFN 1 e 2, TALEN 1 e 2, ou 15 ug do CRISPR / Cas9 codificação px330 plasmídeo (Figura 1) num tubo de 1,5 ml. Pipetar 30 ug do plasmídeo de reparação para este tubo bem. Finalmente, pipeta 1x tampão fosfato salino (PBS) para dentro do tubo para levar o volume até 300 ul.
   Nota: Preparar plasmídeos como um Midiprep (qualquer kit é adequado) com uma concentração mínima de 300 ng / ul, de modo a manter o volume total da solução de transfecção menos de 300 ul. Não é necessária a realização de extracção com fenol / clorofórmio, para linearizar o plasmídeo, ou de usar um endotoxin kit de preparação plasmídeo livre.
2. Remova a mídia da hPSCs usando uma pipeta de vidro e vácuo. Pipetar 2 ml de PBS 1x quente em cada poço para lavar as células.
3. Remover o PBS imediatamente utilizando uma pipeta de vidro e de vácuo. Adicionar 0,5 ml de 0,25% de solução de Tripsina-EDTA directamente sobre as células em cada poço. Colocar na incubadora (37 ° C / 5% de CO _2/3% de O2) durante aproximadamente 10 min. ou até camada de alimentação começa a levantar a placa.
4. Adicionar 2 ml de meio morno esWash (470 ml de DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unidades / ml de P / S) a cada poço para parar a reacção de tripsina.
5. Assegurar que as células alimentadoras sair como uma folha. Pipetar o conteúdo de cada poço num único tubo cónico de 50 ml, que combina todas as cavidades. Triturar as células utilizando uma pipeta 10 ml sorológico. Não é necessário para quebrar a camada alimentadora; hPSCs virá fora da camada de alimentação por trituração suave. Não deve ser de cerca de 15 ml da suspensão de células.
6. Adicionar 25 ml de meio esWash ao tubo para trazer o volume até 40 ml total. Permitir grandes pedaços de alimentação para se depositam no fundo do tubo de 1-2 min. Remover o sobrenadante (~ 38 ml) a partir do tubo, usando uma pipeta serológica e depósito para um novo tubo de 50 ml.
7. Girar durante 5 min a 190 x g. Retirar o sobrenadante do tubo, usando uma pipeta de vidro e de vácuo. Certifique-se de não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 500 ul de 1x PBS. Combine com uma solução de transfecção de plasmídeo preparado anteriormente. Contar as células nesta etapa. Use 5-10 milhões de células por electroporação.
8. Pipetar toda a suspensão em 800 ul de uma cuvete de electroporação 4 mm, colocar em gelo durante 3-5 minutos. Electroporar células usando o programa exponencial na electroporação sistema com os seguintes parâmetros: 250 V, 500 uF, resistência ∞, e 4 mm de tamanho de cuvete. Após a electroporação, colocar cuvete de volta em gelo durante 3 min.
   Nota: Observe a constante da eletroporação no sistema de eletroporação tempo. A constante de tempovaria de acordo com o número de células e a pureza do ADN. Transfections bem sucedidos costumam ter uma constante entre 10-14 ms de tempo ao usar as condições listadas e um pulsador gene II. Electroporação eficiências inferiores pode ocorrer quando as constantes de tempo varia a partir destes valores.
9. Ressuspender as células electroporadas em 18 ml quente hESC meios suplementados com 10 � Y-27632. Placa 3 ml desta suspensão de células individuais em cada poço de uma placa de 6 poços com células alimentadoras DR4. Voltar à incubadora (37 ° C / 5% de CO _2/3% de O2).

3. Selecção de colónias positivas

1. Dia 2, remova toda a mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo. Substituir por 3 mL de meios de hES quentes suplementado com 10 uM Y-27632. Dia 3, remova toda a mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo. Substitua com 3 ml de meio hESC quente sem incluir Y-27632. Dia 4, remova toda a mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo. Substitua com 3 ml de mídia hESC quentes suplementados com antibióticos para selectiligar. Voltar à incubadora (37 ° C / 5% de CO _2/3% de O2).
   Nota: O tipo de antibiótico utilizado dependerá da cassete de resistência à incluídas no modelo de reparação. Quando se trabalha com WIBR # 3 hPSCs registo (NIH 0079), 0,5 ug / ml de puromicina, 70 ug / ml de G418 (geneticina), e 35 ug / ml de higromicina foram utilizados com sucesso. As concentrações de selecção deve ser determinado empiricamente, estabelecendo a concentração mínima de antibiótico necessária para matar as células de tipo selvagem dentro de aproximadamente uma semana.
2. Dias 5-12, mudar media diária, substituindo a velha mídia de cada vez com a mídia CTEh quentes suplementado com antibióticos.
   Nota: Esperar uma grande quantidade de morte celular. As colónias individuais se tornará aparente em torno do dia 10/08. Meios células estaminais embrionárias humanas normais sem os antibióticos podem ser usados ​​depois de 12-14 dias de selecção contínua. Se a densidade celular é elevada ou a morte celular é lenta, a acidificação dos meios de comunicação deve ser evitado e pode ser necessário aumentar os volu mediame (até 4-5 ml), durante os primeiros dias de seleção.

4. Escolher colónias seleccionadas (dia 12-14)

1. Observe colônias no dia 14/12. Observe as colônias que estão prontos para pegar em um microscópio de dissecação e garantir que eles não contêm células que estão começando a se diferenciar. O tamanho aproximado deve ser 800-1200 uM. Se colônias atingir este tamanho antes do dia 12, recomenda-se que eles devem ser colhidos em seguida.
   Nota: Para cada experimento segmentação, escolher como muitas colônias do necessário para assegurar o genótipo desejado é isolado. Como um exemplo, a edição AAVS1 com o modelo de reparação de AAV-EGFP-CAGGS mostrou consistentemente integração robusta, e requer apenas 12-24 colónias de ser escolhidos para se obter cerca de 5-10 clones heterozygously segmentados. Outras experiências de direccionamento podem exigir mais colónias para ser retirado (Tabela 1). A freqüência de eventos de segmentação corretas depende de fatores tais como a eficiência da SSN para introduzir uma DSB, o tamanho da inserção, e a estratégia de selecção. No caso da abordagem de armadilha de genes para o locus AAVS1 aqui apresentado, o marcador de selecção é expresso apenas quando correctamente integrado no sítio alvo, reduzindo o número de colónias necessários para se obter um clone corretamente alvejado.
2. Um dia antes da colheita, para preparar as placas de 12 poços de MEFs (2,4 x 10 ⁶ células / placa, um poço será usado para cada colónia colhidos).
3. No dia da colheita, remova todas as mídias das 12 placas bem MEF, utilizando uma pipeta de vidro e vácuo e substituir com 1 ml de mídia hESC. Também no dia da colheita, altere mídia hESC sobre as placas de 6 bem que estão indo para ser escolhido.
4. Puxar pipetas de vidro para a dissociação mecânica das colónias individuais a partir da camada alimentadora. Abaixe as pipetas sobre um bico de Bunsen de-capuz e suavizou no ponto de expansão até que o vidro é maleável. Remover rapidamente de chamas e retirar a pipeta além criando um ponto angular. Rompem oponto a cerca de 2 cm do eixo curvo, deixando um canal estreito. Lustrar o fim do canal por exposição à chama para 1-2 seg.
   Nota: Opcionalmente escolher colônias uma pipeta de ponta p20, no entanto, isto pode reduzir a clonality da cultura, como a ponta maçante pode desalojar maiores quantidades de células de cada colônia na mídia, potencialmente contaminando colheitas subsequentes.
5. Montar escolhendo dispositivo tomando uma pipeta de ponta de filtro P1000 e anexar uma bomba de sucção para a parte mais estreita. Insira a pipeta de vidro puxado na grande final.
6. Coloque uma placa de 6 poços de hPSCs para ser retirado na plataforma de um microscópio de dissecção montado em um capuz de cultura de tecidos. Comprima o bulbo do dispositivo de picking e gentilmente extirpar e cortar uma colónia individual em 10-20 partes de igual tamanho, tomando cuidado para não soltar peças na mídia. Tome peças HPSC excisadas da colônia para a pipeta, liberando a lâmpada. Tente tomar tão pouco quanto possível a mídia durante a transferência.
7. Transfer a colónia individual para um único poço de uma placa de 12 poços MEF, comprimindo a lâmpada de novo directamente para dentro do poço, libertando a colónia agora quebrado. Rotular cada poço para permitir a identificação única de clones derivados de uma única célula. Repita o procedimento para o maior número de colônias, se necessário, mudando a pipeta de vidro de cada vez.
   Nota: colônias da colheita pode levar algum tempo para aprender. Recomenda-se que a prática experimentador em algumas células de controlo antes de tentar isolar colónias visadas.
8. Rendimento de 12 placas de poços para a incubadora (37 ° C / _3% de O2 / 5% de CO _2), agitando suavemente a placa primeiro para evitar a acumulação de células no meio de cada poço.
9. No dia seguinte, e cada dia subsequente, remover o volume total de mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo e substituir com 1,5 ml de meio hESC quente até que as células são cerca de 50% confluentes (o que normalmente leva 10-12 dias).
10. Após 10-12 dias, escolher uma a duas colónias de cada poço e transferidos para novas placas de 12 poços MEF repeating passos de 4,1-4,8 para gerar uma placa réplica.
11. Extracto de ADN (ver abaixo) a partir das colónias remanescentes em cada poço das placas de MEF originais.
    1. Remova a mídia de todos os poços utilizando uma pipeta de vidro e vácuo. Pipeta de 1 ml de PBS 1x em cada poço para lavar as células. Remover PBS usando pipeta de vidro e vácuo. Pipetar 250 L de tampão de lise celular (concentrações finais em _H2O: 10 mM de Tris HCl, 5 mM de EDTA, 0,2% SDS, NaCl 200 mM, 0,08 mg / ml de Proteinase-K) em cada poço. Colocar na incubadora (37 ° C / _3% de O2 / 5% de CO ₂₎ O / N.
    2. No dia seguinte, o conteúdo da pipeta de cada poço em tubos de 1,5 ml cada. Pipetar 250 L de álcool isopropílico em cada tubo para precipitar o ADN. Agitar vigorosamente tubo. Um precipitado branco deve ser visível.
    3. Girar cada tubo para baixo durante 3 minutos a 13.000 rpm numa centrífuga de topo de mesa. Depois de spin para baixo, elimine o sobrenadante por decantação em resíduos líquidos. Um pequeno pellet de DNA deve continuar a ser preso ao fundo dao tubo. Pipetar 250 l de etanol a 70% a cada tubo para lavar o sedimento de DNA. Agite bem. Girar cada tubo para baixo durante 3 minutos a 13.000 rpm numa centrífuga de topo de mesa.
    4. Depois de girar para baixo, elimine o sobrenadante por decantação em resíduos líquidos. Um pequeno pellet de DNA deve continuar a ser preso ao fundo do tubo. Pipetar para fora do restante do sobrenadante por isso não há líquido deixado no tubo. Deixe tubo aberto para secar em bancada para 5-10 min. Após a secagem, ressuspender o ADN em 250 pL de tampão TE. Coloque a 37 ° C durante 6 h para permitir que o DNA para dissolver.
12. Genótipo cada amostra usando uma estratégia blot pré-otimizada PCR ou do sul.
    Nota:.. Para AAVS1 direccionamento utilizando o modelo de reparação de AAV-CAGGS-EGFP, a estratégia de Southern blot pode ser encontrado em Hockemeyer et ai, 2009 ⁴ Um protocolo de transferência de Southern abrangente pode ser encontrada em Southern, 2006 ³⁵ Para a PCR multiplex genotipagem de. na mesma experiência, os iniciadores e as condições podem serencontrados na Tabela 2 ^36.
13. Descarte poços que não estão devidamente direcionados e continuar mudando media hESC em células corretamente direcionados a cada dia. Congelar para baixo as células quando elas são aproximadamente 50% confluentes, veja abaixo para protocolo de congelação.
    1. Um dia antes do congelamento, altere mídia hESC, eliminando a velha mídia e adição de mídia hESC quentes suplementado com 10 mM Y-27632.
    2. No dia do congelamento preparar 0,5 ml de cada vez de solução A e solução B por poço de uma placa de 12 poços que está a ser congelado para baixo em dois tubos cónicos de 15 ml. Soluções de colocar no gelo. Solução A: 50% mídia hESC e 50% FBS; Solução B: 80% de FBS e 20% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    3. Dissociar colônias HPSC em células isoladas antes do congelamento. Siga os passos 2,2-2,8 de fazer isso, escalando volumes em conformidade. Pellet celular totalmente ressuspender em 0,5 mL da solução A.
    4. Adicionar 0,5 ml de solução B para suspensão de células, pipeta cima e para baixo para fazer a suspensão celular homogênea. Take o volume total da suspensão de células (~ 1 ml) e depósito em 2 ml de tubo criogénico. Tampa de rosca com força.
    5. Colocar num criotubo -80 ° C congelador O / N. No dia após o congelamento, remover células congeladas a partir de -80 ° C congelador e imediatamente colocar dentro do tanque de azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.

Resultados

Aqui demonstramos um protocolo compatível com três plataformas diferentes SSN para criar linhas HPSC geneticamente modificadas. Nós alvo WIBR # 3 células estaminais embrionárias humanas no locus AAVS1 usando ZFNs publicados anteriormente ^{4, 5} e TALENS CRISPR / Cas9s ³⁷ usando um modelo de reparação que introduz um repórter EGFP e uma cassete de resistência à puromicina ^4.

Nós cultivadas nossos hPSCs em MEFs para um fluxo de trabalho de cultura de células permitindo a manutenção e expansão da hPSCs indiferenciadas (Figura 2), que também é rentável e escalável. Se as células são cultivadas mais tempo do que o necessário, há um risco de aumento da diferenciação, a redução do número de células pluripotentes que são transfectadas e, consequentemente, o número de colónias HPSC correctamente alvejados obtidos.

Nós electroporated 5,0 x 10 ⁶ culas por plataforma SSN e semeadas as células a partir de cada alvo numa única placa de 6 poços de DR4 MEFs. Após selecção, cada plataforma resultaram em colónias EGFP-positivo (Figura 3) e uma combinação de clones irrelevantes, homozigoticamente segmentados e heterozygously segmentados (Figura 4A, B; Tabela 3). Sob as condições aqui apresentados, achamos que o AAVS1 TALENS resultou na maioria dos clones EGFP-positivos. O modelo de reparação usado para esta experiência consiste em um local aceitador de união a montante do repórter e resistência à puromicina cassete EGFP. Utilizando esta estratégia de "gene trap" (Figura 1), a construção deverá ser inserida no primeiro intrão do locus AAVS1, utilizando o promotor endógeno para dirigir a expressão da cassete de resistência à puromicina. A falta de um promotor que conduz a expressão do gene de resistência à puromicina dentro do molde a reparação deverá impedir a expressão no evento de integração aleatória.

Portanto, esperamos que todos os clones puromicina resistentes seriam visados ​​no local AAVS1. Deve notar-se que um subconjunto dos clones de realizar integrações aberrantes no locus AAVS1 que são detectáveis ​​por mancha de Southern utilizando uma sonda interna, mas não pela maioria das estratégias de PCR (Figura 1; Figura 4C) ^4. Estes eventos de integração são provavelmente o resultado de eventos de alvejamento heterólogos que conduzem a várias integrações do plasmídeo dador ^4. Nós escolhemos 24 colônias de cada experimento SSN e descobriu que todas as plataformas tiveram ganhos de eficiência muito elevados de segmentação e mostrou diferenças apenas mínimos. Como interrogado por PCR, CRISPR / Cas9 produziu os clones mais correcto direccionamento enquanto a plataforma TALEN tinha os clones mais homozigoticamente segmentados (Tabela 3).

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Figura 1. Esquema de gene editado AAVS1 local usando o modelo de reparação AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. As colónias de WIBR # 3 células. Representativos imagens campo brilhantes de colônias de WIBR # 3 células estaminais embrionárias humanas anteriores à segmentação. Observe a falta de diferenciação e a separação clara da camada de alimentação em uma colônia ideal (à esquerda), em oposição a um não-ideal (à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. EGFP-positivo WIBR # 3 células. Imagens representativas de WIBR # 3 células-alvo com um modelo de reparação que expressam EGFP no locus AAVS1. Imagens de colônias representativas editadas com ZFNs, TALENS e CRISPR / Cas9 são apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. estratégias Genotipagem para confirmar a segmentação correta. (A) resultados de genotipagem Representante PCR mostrando clones não segmentados, heterozigotos e homozigotos alvejados nas três plataformas SSN. WT CTL = controle de tipo selvagem. (B) Repreresultados de Southern blot sentativas mostrando um heterozigoto alvo clone e um clone alvo homozigoto detectado com sonda externa a 3 '. Tamanhos dos fragmentos: WT-6,5 kb, editado 6,9 kb. (C) os resultados de Southern blot representativos mostrando um clone corretamente editado e um clone heterozigotos com um não-aleatório duplo-integração. Tamanhos dos fragmentos: corretamente. Editadas 6,9-kb, aberrante integração-5 kb adicional Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estude	Gene alvejado	Plataforma	Reparação tipo de modelo	Nº de clones escolhidos	Segmentação eficiência
Sexton et al., 2014	TPP1	ZFN	GFP-Puro	não declarada
Sexton et al., 2014	TERT	ZFN	Higromicina	não declarada	não declarada
Hockemeyer et al., 2009	POU5F1	ZFN	GFP-Puro	31	39,0%
Hockemeyer et al., 2009	PITX3	ZFN	GFP-Puro	74	14,9%
, Hockemeyer et al. 2011	POU5F1	TALEN	GFP-Puro	68	91,0%
, Hockemeyer et al. 2011	PITX3	TALEN	GFP-Puro	96	13,0%
Merkle et al., 2015	VASA	Cas9	Repórter-Geneticin	139	94,0%
Merkle et al. </ em>, 2015	CRH	Cas9	Repórter-Geneticin	30	93,0%
Merkle et al., 2015	Hcrt	Cas9	Repórter-Geneticin	154	92,0%
Merkle et al., 2015	HMX2	Cas9	Repórter-Geneticin	11	45,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Nterm	ZFN	GFP-Puro	não declarada	30,0%
Forster et al., 2014	LRG5-Cterm	ZFN	GFP-Puro	não declarada	14,0%
Soldner et al., 2011	SNCA	ZFN	Puro	96	1,0%

não declarada

Tabela 1. Descrição de outros genes alvo utilizando este método, com Correpondente visando ganhos de eficiência tomadas a partir de estudos publicados anteriormente. ^4,5,38-41

Lugar geométrico	Seqüência	Notas
AAVS1-F iniciador	CTCTAACGCTGCCGTCTCTC	As condições de PCR: T m = 57 ° C, 35 ciclos
AAVS1-WT-R iniciador	GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG	Banda WT: 1273 pb
AAVS1 Targeted-R cartilha	CGTCACCGCATGTTAGAAGA	Banda alvejado: 992 pb
T2-Cas9-guia	GGGCCACTAGGGACAGGAT	A partir de Mali et al., 2013
AAVS1-ZFN-direito	TAGGGACAGGAT	De Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-ZFN-esquerda	TGGGGTGTCACC	De Hockemeyer et al., 2009
AAVS1-TALEN-direito	TCCTAACCACTGTCTTT	, De Hockemeyer et al. 2011
AAVS1-TALEN-esquerda	CCCCTCCACCCCACAGT	, De Hockemeyer et al. 2011

Tabela 2. Lista de primers e sequências de direccionamento SSN.

Construção de direccionamento	Número de EGFP + Colonies	Clones escolhidos para públicos específicos (PCR verificado)	Anterior Relatados Eficiência Targeting correta (por Southern blot)
ZFN	150	86,9% (73,9% het / 13,0% homo)	56% (50% Het / 6% homo)
TALEN	412	91,3% (47,8% het / 39,1% homo)	47% (37,5% het / 9,3% homo)
CRISPR-Cas9	235	95,7% (69,5% Het / 2Homo 6,3%)	não declarada

Tabela 3. números comparativos de EGFP-positivo e alvejado TALEN, ZFN e CRISPR / Cas9 colônias de células-tronco humanas. PCR verificada integrações no locus AAVS1 para esta experiência são comparados a transferência de Southern verificou integrações únicas adequadas em experiências anteriores ^4,5.

Discussão

O método apresentado aqui para o isolamento de populações homogêneas de células-tronco pluripotentes humanas editada por genes é uma abordagem poderosa para gerar linhas HPSC isogênicas que diferem apenas no locus alvo. Estas células são um sistema ideal para sondar os mecanismos da diferenciação celular e desenvolvimento humano, bem como para compreender a patofisiologia de doenças monogénicas, num ambiente controlado genética. Como demonstrado aqui, é possível usar três estratégias de desenho independentes SSN (ZFNs, TALENS, CRISPR e / Cas9) para conseguir a integração alvo no locus AAVS1. Cada um destes métodos tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Uma vantagem potencial da ZFNs e, em certa medida, é TALENS sua flexibilidade de desenho, o que permite a engenharia iterativo, a fim de melhorar a domínios de nucleases individuais ⁴² de ligação do ADN. Essa otimização nuclease poderia aumentar a especificidade do ZFNs e TALENS além do que é possível com a CRISistema SPR / Cas9. Tal selectividade pode ser importante para aplicações clínicas requerem um alto grau de especificidade alvo. A principal vantagem do sistema CRISPR / Cas9 é a sua facilidade de uso. Embora TALEN e ZFN kits de construção têm sido postos à disposição do público (ou seja, através de Addgene ^21), CRISPR / SSN baseados em Cas9 são significativamente mais fáceis de construir, como o único personalização necessário é um par oligonucleótido de 20 bases (quando se utiliza o plasmídeo px330 projeto ^14). Esta simplicidade revela-se vantajosa para os laboratórios de pesquisa que procuram incluem edição genoma em seus estudos.

Existem técnicas de transfecção alternativos, incluindo nucleofection ^43, para criar linhas HPSC editada por genes; No entanto electroporação foi demonstrado ser eficaz ^4,5,25 consistente e custo. Nucleofection pode ser utilizado para transfectar directamente Cas9-guia complexos de ARN no núcleo de ribonucleoproteína, aumentando a eficiência de um SSNd fidelidade ^44. Crescer hPSCs em MEFs é um método robusto e baixo custo de manutenção hPSCs em um estado pluripotente sem diferenciação excessiva. Além disso, permite o isolamento fácil das colónias geneticamente idênticos. Em alternativa, é possível hPSCs cultura sem MEFs, no entanto, estas condições de cultura podem ser mais caros do que as culturas baseadas alimentadoras. Além disso, todo o processo é escalável, permitindo o isolamento de edição de eventos muito raros ou a geração de muitas linhas de células diferentes em experiências paralelas de edição.

O protocolo aqui descrito é robusta; no entanto, existem vários passos-chave que afetam a eficiência com que os clones corretamente editados podem ser obtidos. O componente mais importante para este método é que tem MEFs de alta qualidade e MEFs DR4 resistentes aos medicamentos. A sobrevivência de hPSCs individuais é tênue, e MEFs de baixa qualidade vai impedir o isolamento das linhas HPSC indiferenciadas. Em segundo lugar, o uso de Y-27632 é tambémchave para permitir a sobrevivência da célula única, sem gerar uma pressão seletiva para as células com um cariótipo anormal ^45. Em terceiro lugar, escolher colónias bem espaçadas garante a homogeneidade genética das linhas celulares derivadas. Finalmente, é importante preparar pipetas de vidro de modo que a abertura é suficientemente pequena para quebrar a colónia em muitos pedaços menores, assegurando que várias colónias irão crescer no novo poço. Isto permite a colheita de subclones bem espaçados para uma placa de réplica para ter na cultura, deixando a chapa original de colônias isoladas para genotipagem. A parte difícil neste protocolo é o manual puxando das pipetas de vidro; esta deve ser praticada de antemão. Deve notar-se que existem várias técnicas de separação clone que não necessitam de uma pipeta de vidro. Experimentadores são incentivados a encontrar o que funciona melhor para eles.

Existem limitações para este protocolo que pode ser superado por modificações simples. Um experimento destina-se a óomente perturbar o locus de interesse, sem reparação ou uma reparação cujo modelo não contém uma cassete de selecção, deve usar outro método de enriquecimento de células que foram editados. Note-se que o número de colónias que deve ser escolhido para encontrar um clone positivo aumenta grandemente na ausência de selecção. Uma estratégia para melhorar a eficiência é a co-transfecção de um plasmídeo não integrando que expressa uma proteína fluorescente. Depois de permitir que as células recuperar durante dois dias, as células visadas podem ser classificados em fluorescência positiva utilizando separação de células activada por fluorescência e replaqueadas ^29. Este processo enriquece para as células que foram transfectadas com os plasmídeos por electroporação e, assim, aumenta a probabilidade de um evento edição concorrente na célula.

As técnicas descritas aqui pode ser estendido para usar vários RNAs guia para atingir simultaneamente vários ^14,46,47 loci. Muitos protocolos foram criados para diferenciar hPSCsem tipos de células distintos, permitindo várias manipulações genéticas em tipos de células de interesse ^30. No geral, temos demonstrado o potencial para edição genoma eficiente em hPSCs independentemente da escolha SSN. Propomos que esta técnica pode ser adaptada para criar linhas isogénicas HPSC que foram gene editado em qualquer local genómico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12	Life Technologies	11320082
Soro Fetal Bovino (HI)	Life Technologies	10082-147
Knockout Serum	Life Technologies	10828-028
Fator de Crescimento de Fibroblastos - Basic	Life Technologies	PHG0261
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122
Glutamina	Life Technologies	25030-081
MEM NEAA	Life Technologies	11140-050
2-mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023
Y-27632	Calbiochem	688000
Placas de 6 poços	Corning	3506
Placas de 12 poços	Corning	3512
4 cuvetes de Electroporation do milímetro	Bio-rad	165-2081
X-cel gene pulser II	Bio-rad	165-2661
0,25% Trypsin-EDTA	25200-056		da vida
10× Solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH7.4	Life Technologies	70011-044
Puromicina	Life Technologies	A11138-02
Pipetas Pasteur, conectadas	VWR	14672-412
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	S5941
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Proteinase-K	Life Technologies	AM2544
Etanol	VWR	TX89125-172SFU
Álcool Isopropílico	VWR	MK303216
TE Buffer	Life Technologies	12090-015
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
1.8 ml Tubos criogênicos	ThermoScientific	377267