Aqui, apresentamos um protocolo para esgotamento específico mRNA mediado por siRNA seguido por análise de imunofluorescência para avaliar a formação do fuso meiótico e organização em oócitos de camundongos. Este protocolo é adequado para in vitro esgotamento das transcrições e avaliação funcional dos diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos.
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Artigo de método
Meiotic Avaliação de fuso em oócitos mouse por silenciamento mediado por siRNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
Erros na segregação cromossômica durante a divisão meiótica em gametas podem levar à aneuploidia que é posteriormente transmitida ao embrião após a fertilização. A aneuploidia resultante em embriões em desenvolvimento é reconhecida como uma das principais causas de perda de gravidez e defeitos congênitos congênitos, como a síndrome de Down. A segregação cromossômica precisa é criticamente dependente da formação do aparelho do fuso dos microtúbulos, mas esse processo permanece pouco compreendido em oócitos de mamíferos. Curiosamente, a montagem do fuso meiótico difere da mitose e é regulada, pelo menos em parte, por centros organizadores de microtúbulos (MTOCs) exclusivos. A avaliação de proteínas associadas ao MTOC pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos regulatórios que governam a formação e organização do fuso meiótico. Aqui, descrevemos métodos para isolar oócitos de camundongos e esgotar proteínas associadas ao MTOC usando uma abordagem mediada por siRNA para testar a função. Além disso, descrevemos as condições de fixação de oócitos e análise de imunofluorescência para avaliar a formação e organização do fuso meiótico.
Introdução
A meiose é um processo de divisão única que ocorre em gametas (óvulos e espermatozóides) e envolve duas divisões sucessivas sem intervir síntese de DNA para separar cromossomos homólogos e cromátides irmãs durante a meiose-I e meiose-II, respectivamente 1. Erros na segregação dos cromossomos durante a divisão da meiose em oócitos pode resultar em aneuploidia, que é herdado pelo embrião durante a fertilização. Notavelmente, a incidência de aneuploidia em embriões em desenvolvimento aumenta com o avançar da idade materna e é uma causa principal de defeitos congénitos congénitas, bem como a perda da gravidez em mulheres 1,2, assim, uma necessidade ....
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Geórgia.
1. Preparativos
- Para a cultura de oócitos, ou acabado de preparar a compra Meio Essencial Mínimo (MEM) e completar com 3 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) tal como delineado na Tabela 1. Colocar uma garrafa de poliestireno em um equilíbrio de carga (tara a zero). Adicionar todos os reagentes, exceto BSA, em ordem e trazer o volume final com o MQ-água, em peso, para um total de 250 g. Em seguida, adicionar o BSA, para permitir dissolver e esterilizar filtro.
Nota: O mei....
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Resultados
A microinjecção de siRNAs proporciona uma abordagem eficaz para a degradação de ARNm e proteína subsequente depleção em oócitos, que permite o teste funcional eficiente e altamente específico de diferentes factores alvo in vitro. Subsequentemente, a imunofluorescência é utilizado para a análise de fenótipo específico, bem como para validar a depleção de proteínas em oócitos injectados com siRNA. No exemplo atual, marcação fluorescente de oócitos individuais com DAPI em conjunto com anticorpos anti-tubulina e an.......
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Discussão
Embora existam vários métodos para a transferência de ácido nucleico exógeno em células somáticas, tais como a electroporação e a transfecção, microinjecção é o método ideal para a administração de moléculas de ARN em oócitos de rato transcricionalmente quiescentes. O protocolo atual fornece uma abordagem eficaz para in vitro esgotamento de mRNAs específicos que permitem que o teste funcional de diferentes fuso e / ou fatores associados à MTOC em oócitos. Esta abordagem resulta em esgotamento transcrição eficie.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pela Universidade da Geórgia e uma bolsa (HD071330) do National Institutes of Health para MMV.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) | EMD Biosciences | 367222 | |
| Meio essencial mínimo (MEM) | *Receita descrita na Tabela 1 | ||
| Solução salina balanceada de Earle (10x) | Sigma | E-7510 | |
| Sódio Bicarbonato | Sigma | S-5761 | |
| Ácido Pirúvico, sal de sódio | Sigma | P-5280 | |
| Penicilina G, sal de potássio | Sigma | P-7794 | |
| Estreptomicina Sulfato | Sigma | S-9137 | |
| L-Glutamina | Sigma | G-8540 | |
| EDTA, sal dissódico di-hidratado | Sigma | E-4884 | |
| Aminoácidos Essenciais (50x) | Gibco | 11130-051 | |
| Mistura de vitaminas MEM (100x) | Sigma | M-6895 | |
| Solução de vermelho de fenol | Sigma | P-0290 | |
| (BSA) | Sigma | A1470 | |
| Milrinona | Sigma | M4659 | |
| Soro bovino fetal (FBS) | Hyclone | SH30070.01 | |
| EmbryoMax M2 Meios com hepes | EMD Millipore | MR-015-D | |
| siRNAs visando Pericentrin | Qiagen | GS18541 | |
| SiRNAs de controle negativo | Qiagen | SI03650318 | |
| Paraformaldeído (solução a 16%) | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Hyclone | SH30028.02 | |
| Anti-pericentrina (coelho) | Covance | PRB-432C | |
| Anti-tubulina acetilada (mouse) | Sigma | T-6793 | |
| Cabra anti-rabbbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21430 | |
| Cabra anti-rato Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-11017 | |
| Equipamento principal | |||
| Estereomicroscópio (SMZ 800) | Nikon | ||
| Fluorescente Vertical Microscópio | Leica Microsystems | ||
| Microscópio Invertido | Nikon | ||
| Sistema de micro-injecções Femtojet | Eppenforf | ||
| Micro manipuladores | Eppendorf | ||
| (femtotips) | Eppendorf | 930000035 | |
| Pipetas de retenção (VacuTip) | Eppendorf | 930001015 | |
| Plasticware de cultura de > | |||
| 35 mm | 351008 | Corning Life Sciences | |
| Placas | de 96 poços | ||
| Corning Life Sciences | 3367 | ||
| Sistema de filtro CA de 0,45 mm | Corning Life Sciences | 430768 |
Referências
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Hassold, T. J., Hunt, P. A. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet.
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Reimpressões e permissões
